Name: cell-cell fusion of genome edited cell lines for perturbation of cellular structure and function
Uploaded: 2019-12-07T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av en Wellcome tillit Henry Wellcome Fellowship til RM (https://wellcome.ac.uk/grant nummer 100090/12/Z). Funder hadde ingen rolle i studien design, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Vi takker Ashok Venkitaraman og Paul fransk for kritiske råd og veiledning om prosjektet. Vi takker Chiara Cossetti og Gabriela Grondys-Kotarba i Cambridge Institute for Medical Research Flow flowcytometri anlegg for utmerket støtte. Vi takker Liam Cassiday, Thomas Miller, og Gianmarco Contino for korrekturlesing manuskriptet.

1. differensial fluorescerende cellemerking
<ol><li>Gene merking med CRISPR Cas9<ol>
<li>Bruk CRISPR Cas9 Genova redigering å merke rootletin (eller andre gener av interesse) med fluorescerende proteiner meGFP eller mScarlet-i i menneskelig kreftcelle linjer. Merk: Detaljerte protokoller for redigering av Genova dekkes andre steder24,25,26.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fluorescerende fargestoff merking<ol>
<li>G...

<ol>
	<li>Lane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , (2006).</li><li>Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cells+fuse.">How cells fuse.</a> The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).</li><li>K&#246;hler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li><li>Rao, P. N., Johnson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Cell+Fusion:+Studies+on+the+Regulation+of+DNA+Synthesis+and+Mitosis.">Mammalian Cell Fusion: Studies on the Regulation of DNA Synthesis and Mitosis.</a> Nature. 225 (5228), 159-164 (1970).</li><li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+instability+in+colorectal+cancers.">Genetic instability in colorectal cancers.</a> Nature. 386 (6625), 623-627 (1997).</li><li>Fournier, R. E., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcell-mediated+transfer+of+murine+chromosomes+into+mouse,+Chinese+hamster,+and+human+somatic+cells.">Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (1), 319-323 (1977).</li><li>Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+germ+cells+induce+epigenetic+reprogramming+of+somatic+nucleus+in+hybrid+cells.">Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells.</a> The EMBO Journal. 16 (21), 6510-6520 (1997).</li><li>Skelley, A. M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+control+of+cell+pairing+and+fusion.">Microfluidic control of cell pairing and fusion.</a> Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).</li><li>Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylene+glycol+rapidly+restores+physiological+functions+in+damaged+sciatic+nerves+of+guinea+pigs.">Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs.</a> Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).</li><li>Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primate+virus+generates+transformed+human+cells+by+fusion.">A primate virus generates transformed human cells by fusion.</a> The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).</li><li>Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cells+suppress+oncogene-dependent+apoptosis.">Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis.</a> Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).</li><li>Duelli, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virus+causes+cancer+by+inducing+massive+chromosomal+instability+through+cell+fusion.">A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion.</a> Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).</li><li>Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratin+intermediate+filament+dynamics+in+cell+heterokaryons+reveals+diverse+behaviour+of+different+keratins.">Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins.</a> Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).</li><li>Lentz, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG+as+a+tool+to+gain+insight+into+membrane+fusion.">PEG as a tool to gain insight into membrane fusion.</a> European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).</li><li>Lentz, B. R., Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+glycol)+(PEG)-mediated+fusion+between+pure+lipid+bilayers:+a+mechanism+in+common+with+viral+fusion+and+secretory+vesicle+release?.">Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release?.</a> Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).</li><li>Pontecorvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+mammalian+somatic+cell+hybrids+by+means+of+polyethylene+glycol+treatment.">Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment.</a> Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).</li><li>Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+giant+polynuclear+cell+formation+caused+by+HVJ+virus+from+Ehrlich's+ascites+tumor+cells.+I.+Microscopic+observation+of+giant+polynuclear+cell+formation.">Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich's ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation.</a> Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).</li><li>Zimmermann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-mediated+fusion+and+related+electrical+phenomena.">Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).</li><li>Hu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+cells+by+flipped+SNAREs.">Fusion of cells by flipped SNAREs.</a> Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).</li><li>Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+cellular+fusion+using+optically+trapped+plasmonic+nano-heaters.">Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters.</a> Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211 (2016).</li><li>Kao, K. N., Michayluk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-frequency+intergeneric+fusion+of+plant+protoplasts.">A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts.</a> Planta. 115 (4), 355-367 (1974).</li><li>Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cell+fusion.">Mechanisms of cell fusion.</a> Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).</li><li>Mahen, R., Venkitaraman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+centrosome+assembly.">Pattern formation in centrosome assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).</li><li>Mahen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+centrosomal+roots+disentangle+to+allow+interphase+centriole+independence.">Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence.</a> PLoS Biology. 16 (4), e2003998 (2018).</li><li>Mahen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+assessment+of+fluorescent+transgene+methods+for+quantitative+imaging+in+human+cells.">Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Yang, J., Shen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylene+glycol-mediated+cell+fusion.">Polyethylene glycol-mediated cell fusion.</a> Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).</li><li>Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+pairing+and+polyethylene+glycol+(PEG)-mediated+cell+fusion+using+two-step+centrifugation-assisted+single-cell+trapping+(CAScT).">Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT).</a> Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).</li><li>Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+Cell-Cell+Fusion+Assay+for+Cytoplasmic+and+Organelle+Intermixing+Studies.">Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies.</a> Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61 (2018).</li><li>Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+of+polyethylene+glycol-induced+cell+fusion+and+hybridization+in+lymphoid+cell+lines.">Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines.</a> Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).</li><li>Frye, L. D., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rapid+intermixing+of+cell+surface+antigens+after+formation+of+mouse-human+heterokaryons.">The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons.</a> Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).</li><li>Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+mitochondria+in+mammalian+cells+is+dependent+on+the+mitochondrial+inner+membrane+potential+and+independent+of+microtubules+or+actin.">Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin.</a> FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).</li><li>Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+fusion+in+vivo+between+normal+host+and+tumor+cells:+possible+contribution+to+tumor+progression+and+metastasis+studied+with+a+lectin-resistant+mutant+tumor.">Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor.</a> Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).</li></ol>

Vi viser en facile og kostnadseffektiv protokoll for fiksering celler og visualisere den påfølgende arkitekturen av celle hybrider med mikroskopi, tar ca to dager fra Start til slutt. Kritiske deler av denne protokollen er berikelse av smeltet celler ved celle sortering (protokoll del 3), og forsiktig validering av smeltet celler ved mikroskopi (protokoll seksjon 4). Disse seksjonene sikre at smeltet celler er lett innhentet og er bona fide heterokaryons. Konsentrasjoner og inkubasjons tider bør overholdes. Når det f...

Homøostatisk vedlikehold av cellulær struktur er avgjørende for livet. Celler har karakteristiske morfologier, sub-cellulære organelle tall, og interne biokjemiske sammensetning. Forstå hvordan disse fundamentale egenskapene er generert og hvordan de går galt under sykdom krever laboratorie verktøy for å forurolige dem.
Celle fusjon er sammenslåing av to eller flere separate celler. Celle fusjon kan ha vært avgjørende for fremveksten av eukaryote liv1. I menneskekroppen, celle fusjon er relativt sjelden, forekommer under begrenset utviklings forhold og vevstyper, slik som under befruktning eller dannelsen av muskler, bein og morkaken2. Denne protokollen beskriver induksjon av celle-celle fusjon i vev kultur cellelinjer med differensielt fluorescensmerkete merket organeller, som et verktøy for å forstå mekanismene kontrollerende cellestruktur og funksjon.
I vitro indusert celle-celle fusjon er sentralt i produksjonen av monoklonale antistoffer3, et viktig verktøy for biologisk forskning og sykdomsbehandling. Cell Fusion har også blitt brukt til å spørre mange forskjellige grunnleggende celle biologiske spørsmål om celle syklus dominans4,avvik,omprogrammering, cellular,reparasjonav skadede neurons9, viral spredning10, apoptose11, tumorigenesis12, cytoskjelettkomponenter Dynamics13, og membran Fusion14,15. Laboratorie baserte metoder for å indusere celle-Cell Fusion16,17,18,19 indusere lipid membran Koalesens gjennom den fysiske sammenslåing av to bilayers i ett. Cell Fusion kan bli indusert av elektrisitet18, viral baserte metoder17, thermoplasmonic oppvarming20, transgene Expression19, og kjemikalier inkludert polyetylen glykol (PEG)16,21,22.
Centrosomes er mikrotubulinettverket organisering sentre kontrollerende cellulær form, motilitet, polarisering, og divisjon23. Centrosomal røtter er fiber strukturer som strekker seg fra centrosomes som inneholder proteinet rootletin24 (kodet av genet CROCC). Vi har nylig brukt celle-celle fusjon for å forstå hvordan centrosome posisjon og antall varierer inne heterokaryons forhold til foreldrenes celler24. Begrunnelsen bak bruken av denne metoden er å spore cellen opprinnelse røtter innenfor en heterokaryon etter fusjon av differensielt fluorescensmerkete merkede foreldrenes celler, og dermed til bilde organelle fusjon og fisjon. Den fluorescensmerkete merket proteiner rootletin-meGFP eller rootletin-mScarlet-jeg er skapt av Genova redigering i separate cellelinjer som deretter smeltet sammen med PEG-mediert celle fusjon. Vi beskriver bruken av cellefarge stoffer (tabell av materialer) for å identifisere smeltet celler ved flyt flowcytometri og påfølgende fluorescens mikroskopi identifisering av centrosome celle av opprinnelse og morfologi (figur 1). Denne tilnærmingen er en robust og unik metode for å studere hvordan store endringer i mobilnettet stat inkludert organelle nummer impinge på celle homeostase.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62554502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well imaging dishes</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>gba-488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Influx Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Filters (70um)</td>
			<td>Biofil</td>
			<td>CSS010070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Far Red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Violet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody</td>
			<td>NanoTag Biotechnologies</td>
			<td>N1302-At565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15 CO2 independent imaging medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red free DMEM, high glucose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21063029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (1 x PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP151</td>
			<td>nonionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP337</td>
			<td>nonionic detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-cell fusion of genome edited cell lines for perturbation of cellular structure and function

Livet er romlig partisjonert innen lipid membraner for å tillate isolert dannelse av distinkte molekylære tilstander inne celler og organeller. Celle fusjon er sammenslåingen av to eller flere celler for å danne en enkelt celle. Her gir vi en protokoll for celle fusjon av to forskjellige celletyper. Smeltet hybrid celler er beriket av Flow flowcytometri-basert sortering, etterfulgt av fluorescens mikroskopi av hybrid cellestruktur og funksjon. Fluorescensmerkete Tagged proteiner generert av Genova redigering er avbildet inne smeltet celler, slik at cellulære strukturer for å bli identifisert basert på fluorescens utslipp og referert tilbake til cellen type opprinnelse. Denne robuste og generelle metoden kan brukes på ulike celletyper eller organeller av interesse, for å forstå cellulære struktur og funksjon på tvers av en rekke grunnleggende biologiske spørsmål.

Passende merkede celler er synlige underflyt flowcytometri av fluorescens signal høyere enn umerkede kontroll celler (figur 2A). Gates er satt for sortering av doble positive celler, berikende denne befolkningen direkte i Imaging retter for videre mikroskopiske analyser. Smeltet celler er synlig som distinkte doble fluorescensmerkete positive celler og utgjør ca ~ 1% av befolkningen.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=...

Watch this Scientific Journal Video about Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function at JoVE.com

Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

Formålet med denne protokollen er å fusjonere to forskjellige celletyper for å opprette hybride celler. Fluorescens mikroskopi analyse av smeltet celler brukes til å spore cellen av opprinnelsen til mobilnettet organeller. Denne analysen kan brukes til å utforske hvordan cellulære struktur og funksjon reagerer på forstyrrelsene av celle fusjon.

Cellen-cellen smelting av Genova redigert cellen linjer for forstyrrelsene av Cellular struktur og funksjonen

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...

Denne metoden gjør at cellulær struktur og funksjon kan perturbed gjennom fusjon av to forskjellige celletyper for å løse spørsmål som hvordan cellene reagerer på endringer i organelle nummer. Ved å avbilde fluorescerende merkede proteiner i smeltede celler, kan cellulære strukturer refereres tilbake til deres celletype opprinnelse for å studere mekanismene for organelle homeostase og funksjon. For fluorescerende fargestoff merking, se de menneskelige kreftcellepopulasjoner av interesse slik at hver kultur vil ha utvidet til minst seks ganger 10 til de sjette cellene på en 70 til 90% samløpet innen neste morgen.På merkedagen vasker du rootletin eGFP- og rootletin-mScarlet-cellene to ganger med 10 milliliter PBS per vask. Fortynn Fiolett cellefarge til 500 nanomlar i PBS og Far Red cellefargestoff til 200 nanomolar i PBS. Merk rootletin eGFP-cellene med fortynnet Violet-cellefargestoff og rootletin-mScarlet-cellene med fortynnet Far Red-cellefarge i ett minutt ved romtemperatur.På slutten av inkubasjonene, stopp reaksjonene med 10 milliliter DMEM i fem minutter. Vask både merkede cellekulturer og en umerket foreldrecellekultur med 10 milliliter fersk PBS før du inkuberer alle kulturene med en milliliter førkrigsforsøk. På slutten av inkubasjonen, overføre frittliggende celleløsninger til individuelle 15 milliliter koniske rør for sentrifugering og forsiktig gjenbruke fargestoff merket pellets i en milliliter PBS og umerkede celler i en milliliter DMEM.Deretter returnerer du alle celleprøvene til cellekulturinkubatoren. For cellefusjonseksperiment blander du 500 mikroliter violetfargemerkede celler med 500 mikroliter far rød fargestoff merket celler i et nytt 15 milliliter rør og sediment de resterende ubkrediterte merkede cellene ved sentrifugering. Resuspend pellets i en milliliter frisk DMEM og plassere cellene tilbake i inkubatoren.Samle de blandede cellene ved sentrifugering og tilsett 700 mikroliter på 50% 1450 PEG på en drop-wise måte til pellet over en periode på 30 sekunder. Etter 3,5 minutter ved romtemperatur, tilsett 10 milliliter serumfri DMEM drop-wise over en periode på 30 sekunder og plasser rørene i inkubatoren i 10 minutter. På slutten av inkubasjonen sediment de blandede cellene ved sentrifugering og forsiktig resuspend pellet i en milliliter av komplett medium.For å berike for den smeltede cellepopulasjonen ved FACS, må du forsiktig filtrere alle cellene i individuelle FACS-rør gjennom en 70 mikrometersil og skape fremoversp scatter versus sidesp scatter og doble diskrimineringsplott i cytometerprogramvaren. Kjør de umerkede cellene for å registrere fluorescensintensiteten og opprette porter for å identifisere de smeltede cellene. Deretter kjører du de enkle positive Violet-fargestoffene merket celler for å bekrefte at det ikke er søl av Violet-signal inn i Far Red-kanalen og de eneste positive Far Red-fargestoffene merket celler for å bekrefte at det ikke er noe Far Red-signal i Violet-kanalen.Kjør deretter fusjonsprøven kort for å bekrefte at de smeltede cellene er synlige med disse portene. Når sorteringsparametrene er satt, justerer du sorteringsstrømmen sentralt inn i en åttebrønns bildetallsrett som inneholder 100 mikroliter vekstmedium og sorterer de doble positive smeltede cellene direkte inn i parabolen. Når alle cellene er sortert, legg umiddelbart parabolen i cellekulturinkubatoren i to til 16 timer.For immunofluorescerende farging, først erstatte cellekulturen supernatant med 200 mikroliter på 4% paraformaldehyd for en 15-minutters inkubasjon ved romtemperatur. På slutten av fikseringen vasker cellene tre ganger med 200 mikroliter PBS per vask før de gjennomsyrer cellene i 200 mikroliter på 0,1% ikke-ionisk overflateaktivt middel i 10 minutter ved romtemperatur. Deretter blokkerer du den uspesifikke bindingen med 200 mikroliter på 3 % storfe serumalbumin i PBS i 30 minutter ved romtemperatur etterfulgt av merking med antistoffer av interesse i 150 mikroliter med fargebuffer.Etter en time ved romtemperatur, vask cellene to ganger i 300 mikroliter PBS i fem minutter per vask. Etter siste vask, skift vasken med 200 mikroliter frisk PBS. For å skaffe bilder av de smeltede cellene, bruk et passende fluorescensmikroskop som er i stand til firefargers bildebehandling og samle tredimensjonale bilder.Passende merkede celler er synlige under strømningscytometri ved fluorescerende signal på et høyere nivå enn umerkede kontrollceller. Portene kan settes for sortering for å berike for den doble positive cellepopulasjonen direkte inn i bilderetter for ytterligere mikroskopisk analyse. Fusion induserer en stor omorganisering av cellulær arkitektur gjennom blanding av to celler i en.Heterokaryoner identifiseres som celler som inneholder både fluorescerende fargesignaler blandet inne i en enkelt celle uten å gripe inn plasmamembraner. I tillegg kan to kjerner også være synlige i smeltede celler ved Brightfield-avbildning. Cellestrukturen og funksjonen kan undersøkes videre gjennom sammenslåing av celler som inneholder meGFP og mScarlet-taggede proteiner.Fusion resulterer i en dobling av centrosome tallet inne heterokaryons synlig som minst fire pericentriolar materiale foci når centrosome pericentriolar komponent NEDD1 er fluorescerende merket. Fusjonen av celler med endogene fluorescerende merket rootletin gjør at opprinnelsescellen til hver centrosome kan identifiseres i en heterokaryon. Denne protokollen viser hvordan man smelter differensialt merkede cellelinjer og hvordan man kan bilde av organeller for å forstå deres struktur og funksjon.Denne robuste protokollen er både relativt enkel og relativt billig å utføre sammenlignet med lignende metoder. Denne teknikken kan brukes til å stille en rekke spørsmål som hvordan er organelle fusjon regulert og hvordan cellene reagerer på endringer i subcellulær organelle nummer.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Metode for å studere Palatal Fusion bruker Static Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Etablering av Genome-redigerte Menneskelig Pluripotent Stem Cell Lines: Fra Targeting å Isolering

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Mikroinjeksjon for transgenesis og Genome redigering i Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Generering av Parabiotic Sebrafisk embryoer ved Kirurgisk Fusion of Utvikling Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Cell Lineage Analyser og gen-funksjon studier med Twin-spot MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Struktur-funksjon studier i mus embryonale stamceller Bruke recombinase-mediert Cassette Veksling

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Avledning av stamcelleforskningen linjer fra mus Preimplantation embryo

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Vurdering av skaden-indusert Senescence og i Vivo omprogrammering i skjelettmuskelen

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisering av mobilnettet elektrisk aktivitet i sebrafisk tidlig embryo og svulster

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...