Name: cell-cell fusion of genome edited cell lines for perturbation of cellular structure and function
Uploaded: 2019-12-07T17:00:00
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Este trabajo fue financiado por una beca Wellcome Trust Henry Wellcome a R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant número 100090/12/Z). El fundero no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. Agradecemos a Ashok Venkitaraman y Paul French por su asesoramiento y orientación crítica sobre el proyecto. Agradecemos a Chiara Cossetti y Gabriela Grondys-Kotarba en las instalaciones de citometría Cambridge Institute for Medical Research Flow por su excelente apoyo. Agradecemos a Liam Cassiday, Thomas Miller y Gianmarco Contino por revisar el manuscrito.

1. Etiquetado diferencial de celdas fluorescentes
<ol><li>Etiquetado genético con CRISPR Cas9<ol>
<li>Utilice la edición del genoma CRISPR Cas9 para etiquetar la rootletina (u otros genes de interés) con las proteínas fluorescentes meGFP o mScarlet-I en líneas celulares de cáncer humano. NOTA: Los protocolos detallados para la edición del genoma se tratan en otros lugares24,25,26.</li>
	</ol>
</li>
	...

<ol>
	<li>Lane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , (2006).</li><li>Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cells+fuse.">How cells fuse.</a> The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).</li><li>K&#246;hler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li><li>Rao, P. N., Johnson, R. 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M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+control+of+cell+pairing+and+fusion.">Microfluidic control of cell pairing and fusion.</a> Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).</li><li>Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylene+glycol+rapidly+restores+physiological+functions+in+damaged+sciatic+nerves+of+guinea+pigs.">Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs.</a> Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).</li><li>Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primate+virus+generates+transformed+human+cells+by+fusion.">A primate virus generates transformed human cells by fusion.</a> The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).</li><li>Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cells+suppress+oncogene-dependent+apoptosis.">Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis.</a> Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).</li><li>Duelli, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virus+causes+cancer+by+inducing+massive+chromosomal+instability+through+cell+fusion.">A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion.</a> Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).</li><li>Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratin+intermediate+filament+dynamics+in+cell+heterokaryons+reveals+diverse+behaviour+of+different+keratins.">Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins.</a> Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).</li><li>Lentz, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG+as+a+tool+to+gain+insight+into+membrane+fusion.">PEG as a tool to gain insight into membrane fusion.</a> European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).</li><li>Lentz, B. R., Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+glycol)+(PEG)-mediated+fusion+between+pure+lipid+bilayers:+a+mechanism+in+common+with+viral+fusion+and+secretory+vesicle+release?.">Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release?.</a> Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).</li><li>Pontecorvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+mammalian+somatic+cell+hybrids+by+means+of+polyethylene+glycol+treatment.">Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment.</a> Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).</li><li>Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+giant+polynuclear+cell+formation+caused+by+HVJ+virus+from+Ehrlich's+ascites+tumor+cells.+I.+Microscopic+observation+of+giant+polynuclear+cell+formation.">Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich's ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation.</a> Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).</li><li>Zimmermann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-mediated+fusion+and+related+electrical+phenomena.">Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).</li><li>Hu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+cells+by+flipped+SNAREs.">Fusion of cells by flipped SNAREs.</a> Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).</li><li>Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+cellular+fusion+using+optically+trapped+plasmonic+nano-heaters.">Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters.</a> Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211 (2016).</li><li>Kao, K. N., Michayluk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-frequency+intergeneric+fusion+of+plant+protoplasts.">A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts.</a> Planta. 115 (4), 355-367 (1974).</li><li>Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cell+fusion.">Mechanisms of cell fusion.</a> Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).</li><li>Mahen, R., Venkitaraman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+centrosome+assembly.">Pattern formation in centrosome assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).</li><li>Mahen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+centrosomal+roots+disentangle+to+allow+interphase+centriole+independence.">Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence.</a> PLoS Biology. 16 (4), e2003998 (2018).</li><li>Mahen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+assessment+of+fluorescent+transgene+methods+for+quantitative+imaging+in+human+cells.">Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Yang, J., Shen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylene+glycol-mediated+cell+fusion.">Polyethylene glycol-mediated cell fusion.</a> Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).</li><li>Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+pairing+and+polyethylene+glycol+(PEG)-mediated+cell+fusion+using+two-step+centrifugation-assisted+single-cell+trapping+(CAScT).">Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT).</a> Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).</li><li>Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+Cell-Cell+Fusion+Assay+for+Cytoplasmic+and+Organelle+Intermixing+Studies.">Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies.</a> Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61 (2018).</li><li>Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+of+polyethylene+glycol-induced+cell+fusion+and+hybridization+in+lymphoid+cell+lines.">Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines.</a> Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).</li><li>Frye, L. D., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rapid+intermixing+of+cell+surface+antigens+after+formation+of+mouse-human+heterokaryons.">The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons.</a> Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).</li><li>Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+mitochondria+in+mammalian+cells+is+dependent+on+the+mitochondrial+inner+membrane+potential+and+independent+of+microtubules+or+actin.">Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin.</a> FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).</li><li>Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+fusion+in+vivo+between+normal+host+and+tumor+cells:+possible+contribution+to+tumor+progression+and+metastasis+studied+with+a+lectin-resistant+mutant+tumor.">Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor.</a> Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).</li></ol>

Demostramos un protocolo fácil y rentable para fusionar células y visualizar la arquitectura posterior de los híbridos celulares con microscopía, tardando aproximadamente dos días de principio a fin. Las partes críticas de este protocolo son el enriquecimiento de células fusionadas por clasificación celular (sección 3 del protocolo), y la validación cuidadosa de las células fusionadas por microscopía (sección 4 del protocolo). Estas secciones aseguran que las células fusionadas se obtengan fácilmente y sea...

El mantenimiento homeostático de la estructura celular es fundamental para la vida. Las células tienen morfologías características, números de orgánulos subcelulares y composición bioquímica interna. Entender cómo se generan estas propiedades fundamentales y cómo van mal durante la enfermedad requiere herramientas de laboratorio para perturbarlas.
La fusión celular es la fusión de dos o más celdas separadas. La fusión celular puede haber sido crítica para la aparición de la vida eucariota1. En el cuerpo humano, la fusión celular es relativamente rara, que ocurre durante circunstancias de desarrollo restringidas y tipos de tejido, como durante la fertilización o la formación de músculo, hueso y la placenta2. Este protocolo describe la inducción de la fusión célula-célula en líneas celulares de cultivo de tejido con orgánulos etiquetados fluorescentemente diferencialmente, como una herramienta para entender los mecanismos que controlan la estructura y la función celular.
La fusión in vitro de células celulares es fundamental para la producción de anticuerpos monoclonales3, una herramienta importante para la investigación biológica y el tratamiento de enfermedades. La fusión celular también se ha utilizado para hacer muchas preguntas biológicas fundamentales fundamentales sobre la dominancia del ciclo celular4, aneuploidía5,6, reprogramación celular7,8, la reparación de las neuronas dañadas9, proliferación viral10, apoptosis11, tumorigénesis12, dinámica citoesquelética13, y membrana de fusión14,15. Los métodos basados en laboratorio para inducir la fusión célula-célula16,17,18,19 inducen la carbonescencia de la membrana lipídica a través de la fusión física de dos bicapas en una. La fusión celular puede ser inducida por electricidad18, métodos virales basados17, calentamiento termoplasmónico20, expresión transgénica19, y productos químicos incluyendo polietilenglicol (PEG)16,21,22.
Los centros son centros organizadores de microtúbulos que controlan la forma celular, la motilidad, la polarización y la división23. Las raíces centrosómicas son estructuras fibrosas que se extienden a partir de centrosomas que contienen la proteína rootletina24 (codificada por el gen CROCC). Recientemente usamos la fusión de células celulares para entender cómo la posición y el número de centrosomas varían dentro de heterocaryons en relación con las células parentales24. La razón de ser de este método es rastrear la célula de origen de las raíces dentro de un heterokaryon después de la fusión de células parentales etiquetadas diferencialmente fluorescentes, y así imaginar la fusión y físsion de los orgánulos. Las proteínas etiquetadas fluorescentes rootletin-meGFP o rootletin-mScarlet-I se crean mediante la edición del genoma en líneas celulares separadas que luego se fusionan mediante la fusión celular mediada por PEG. Describimos el uso de tintes celulares(Tabla de Materiales)para identificar células fusionadas por citometría de flujo y posterior identificación microscópica de fluorescencia de células centrosomasdes de origen y morfología (Figura 1). Este enfoque es un método robusto y único para estudiar cómo los cambios importantes en el estado celular incluyendo el número de organélilos afectan a la homeostasis celular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62554502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well imaging dishes</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>gba-488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Influx Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Filters (70um)</td>
			<td>Biofil</td>
			<td>CSS010070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Far Red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Violet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody</td>
			<td>NanoTag Biotechnologies</td>
			<td>N1302-At565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15 CO2 independent imaging medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red free DMEM, high glucose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21063029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (1 x PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP151</td>
			<td>nonionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP337</td>
			<td>nonionic detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-cell fusion of genome edited cell lines for perturbation of cellular structure and function

La vida se divide espacialmente dentro de las membranas lipídicas para permitir la formación aislada de estados moleculares distintos dentro de las células y orgánulos. La fusión celular es la fusión de dos o más celdas para formar una sola celda. Aquí proporcionamos un protocolo para la fusión celular de dos tipos de células diferentes. Las células híbridas fusionadas se enriquecen mediante la clasificación basada en citometría de flujo, seguida de la microscopía de fluorescencia de la estructura y función de las células híbridas. Las proteínas etiquetadas fluorescentes generadas por la edición del genoma se utilizan en el interior de las células fusionadas, lo que permite identificar las estructuras celulares en función de la emisión de fluorescencia y hacer referencia al tipo de origen de la célula. Este método robusto y general se puede aplicar a diferentes tipos de células u orgánulos de interés, para entender la estructura celular y la función a través de una gama de cuestiones biológicas fundamentales.

Las células etiquetadas adecuadamente son visibles durante la citometría de flujo por señal de fluorescencia superior a las células de control no etiquetadas(Figura 2A). Las puertas están configuradas para la clasificación de células dobles positivas, enriqueciendo a esta población directamente en platos de imágenes para análisis microscópicos adicionales. Las células fundidas son detectables como células dobles fluorescentes pos...

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Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

El propósito de este protocolo es fusionar dos tipos de células diferentes para crear células híbridas. El análisis de microscopía de fluorescencia de células fusionadas se utiliza para rastrear la célula de origen de los orgánulos celulares. Este ensayo se puede utilizar para explorar cómo la estructura celular y la función responden a la perturbación por fusión celular.

Célula-célula Fusión de Líneas Celulares Editadas genoma para la Perturbación de la Estructura Celular y la Función

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...

Este método permite que la estructura celular y la función se perturen a través de la fusión de dos tipos de células diferentes para abordar preguntas tales como cómo responden las células a los cambios en el número de orgánulo. Mediante la toma de imágenes de proteínas etiquetadas fluorescentmente dentro de las células fusionadas, las estructuras celulares se pueden hacer referencia de nuevo a su tipo de célula de origen para estudiar los mecanismos de la homeostasis y la función del orgánulo. Para el etiquetado de tintes fluorescentes, vea las poblaciones de células cancerosas humanas de interés de tal manera que cada cultivo se habrá expandido a por lo menos seis veces 10 a las sextas células en una confluencia de 70 a 90% para la mañana siguiente.El día del etiquetado, lave dos veces las células de rootletina eGFP y rootletin-mScarlet con 10 mililitros de PBS por lavado. Diluir el tinte celular violeta a 500 nanomolares en PBS y teñido de células rojas lejanas a 200 nanomolares en PBS. Etiquete las células de rootletin eGFP con el tinte celular violeta diluido y las células de rootletin-mScarlet con el tinte de células rojos lejanos diluido durante un minuto a temperatura ambiente.Al final de las incubaciones, detenga las reacciones con 10 mililitros de DMEM durante cinco minutos. Lave tanto cultivos celulares etiquetados como un cultivo celular parental sin etiquetar con 10 mililitros de PBS fresco antes de incubar todos los cultivos con un mililitro de trippsina precalentada. Al final de la incubación, transfiera las soluciones celulares separadas a tubos cónicos individuales de 15 mililitros para centrifugación y resuspende suavemente los pellets etiquetados con tinte en un mililitro de PBS y las células sin etiquetar en un mililitro de DMEM.A continuación, devuelva todas las muestras de celda a la incubadora de cultivo celular. Para el experimento de fusión celular, mezcle 500 microlitros de células etiquetadas con tinte violeta con 500 microlitros de células etiquetadas con tinte Rojo Lejano en un nuevo tubo de 15 mililitros y sedimente las células etiquetadas no mezcladas restantes por centrifugación. Resuspender los pellets en un mililitro de DMEM fresco y colocar las células de nuevo en la incubadora.Recoger las células mixtas por centrifugación y añadir 700 microlitros de 50%1450 PEG de una manera gota a la bola durante un período de 30 segundos. Después de 3,5 minutos a temperatura ambiente, agregue 10 mililitros de DMEM sin suero en un período de 30 segundos y coloque los tubos en la incubadora durante 10 minutos. Al final de la incubación, sedimentar las células mixtas por centrifugación y resuspend suavemente el pellet en un mililitro de medio completo.Para enriquecer para la población de células fusionadas por FACS, filtre suavemente todas las células en tubos FACS individuales a través de un colador de 70 micrómetros y cree tramas de dispersión hacia adelante frente frente a dispersión lateral y discriminación de doblete en el software del citometro. Ejecute las celdas sin etiquetar para registrar su intensidad de fluorescencia y crear puertas para identificar las celdas fusionadas. A continuación, ejecute el único tinte Violet positivo etiquetado con las células para confirmar que no hay derrame de señal violeta en el canal Rojo Lejano y el único tinte rojo Lejano positivo etiquetado células para confirmar que no hay señal de rojo lejano en el canal Violeta.Luego ejecute brevemente la muestra de fusión para confirmar que las células fusionadas son visibles con estas puertas. Cuando se hayan establecido los parámetros de clasificación, alinee el flujo de clasificación de forma centralizada en una placa de imágenes de ocho pozos que contenga 100 microlitros de medio de crecimiento y clasif sino las células fusionadas positivas dobles directamente en el plato. Cuando todas las células hayan sido ordenadas, coloque inmediatamente el plato en la incubadora de cultivo celular durante dos a 16 horas.Para la tinción inmunofluorescente, primero reemplace el sobrenadante de cultivo celular por 200 microlitros de 4%paraformaldehído para una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente. Al final de la fijación, lave las células tres veces con 200 microlitros de PBS por lavado antes de permeabilizar las células en 200 microlitros de 0.1%surfactante no iónico durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, bloquee la unión inespecífico con 200 microlitros de albúmina sérica bovina al 3% bovina en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de un etiquetado con los anticuerpos de interés en 150 microlitros de tampón de tinción.Después de una hora a temperatura ambiente, lave las células dos veces en 300 microlitros de PBS durante cinco minutos por lavado. Después del último lavado, sustituya el lavado por 200 microlitros de PBS fresco. Para adquirir imágenes de las células fusionadas, utilice un microscopio de fluorescencia adecuado capaz de imágenes de cuatro colores y recopile imágenes tridimensionales.Las células debidamente etiquetadas son visibles durante la citometría de flujo por señal fluorescente a un nivel más alto que las células de control sin etiquetar. Las puertas se pueden configurar para la clasificación para enriquecer para la población de células dobles positivas directamente en platos de imagen para un análisis microscópico adicional. La fusión induce una reorganización importante de la arquitectura celular a través de la mezcla de dos células en una.Los heterokaryons se identifican como células que contienen ambas señales de tinte fluorescente mezcladas dentro de una sola célula sin intervenir membranas plasmáticas. Además, dos núcleos también pueden ser visibles en las células fusionadas por imágenes de Brightfield. La estructura y la función celulares pueden investigarse más a través de la fusión de células que contienen proteínas etiquetadas con meGFP y mScarlet.La fusión da como resultado una duplicación del número centrosome dentro de los heterokaryons visibles como al menos cuatro focos de material pericentriolar cuando el componente pericentriolar centrosome NEDD1 está etiquetado fluorescentemente. La fusión de células con rootletina endógenamente etiquetada fluorescentemente permite identificar la célula de origen de cada centroomante en un heterokaryon. Este protocolo demuestra cómo fusionar líneas celulares etiquetadas diferencialmente y cómo crear imágenes de sus orgánulos para comprender su estructura y función.Este protocolo robusto es relativamente fácil y relativamente barato de realizar en comparación con métodos similares. Esta técnica se puede utilizar para hacer una serie de preguntas tales como cómo se regula la fusión de organelos y cómo las células responden a los cambios en el número de orgánulo subcelular.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Investigación

Biología del Desarrollo

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