Name: cell-cell fusion of genome edited cell lines for perturbation of cellular structure and function
Uploaded: 2019-12-07T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function at JoVE.com

Bu çalışma Wellcome Trust Henry Wellcome Bursu ile R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant numarası 100090/12/Z) tarafından finanse edilmiştir. Funder çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayımlama kararı, ya da el yazması hazırlanmasında hiçbir rolü vardı. Ashok Venkitaraman ve Paul French'e proje hakkında eleştirel tavsiyeler ve rehberlik için teşekkür ederiz. Biz mükemmel destek için Cambridge Enstitüsü Tıbbi Araştırma Akış Cytometry tesisinde Chiara Cossetti ve Gabriela Grondys-Kotarba teşekkür ederiz. Taslağı doğruldukları için Liam Cassiday, Thomas Miller ve Gianmarco Contino'ya teşekkür ederiz.

1. Diferansiyel Floresan Hücre Etiketleme
<ol><li>CRISPR Cas9 ile gen etiketleme<ol>
<li>CrispR Cas9 genom düzenlemesini kullanarak insan kanser hücresi hatlarındaki floresan proteinler meGFP veya mScarlet-I ile rootletin (veya diğer ilgi genlerini) etiketleyin. NOT: Genom düzenleme için ayrıntılı protokoller başka bir yerde24,25,26kapsamaktadır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Floresan boya etiketleme<o...

<ol>
	<li>Lane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , (2006).</li><li>Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cells+fuse.">How cells fuse.</a> The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).</li><li>K&#246;hler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li><li>Rao, P. N., Johnson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Cell+Fusion:+Studies+on+the+Regulation+of+DNA+Synthesis+and+Mitosis.">Mammalian Cell Fusion: Studies on the Regulation of DNA Synthesis and Mitosis.</a> Nature. 225 (5228), 159-164 (1970).</li><li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+instability+in+colorectal+cancers.">Genetic instability in colorectal cancers.</a> Nature. 386 (6625), 623-627 (1997).</li><li>Fournier, R. E., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcell-mediated+transfer+of+murine+chromosomes+into+mouse,+Chinese+hamster,+and+human+somatic+cells.">Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (1), 319-323 (1977).</li><li>Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+germ+cells+induce+epigenetic+reprogramming+of+somatic+nucleus+in+hybrid+cells.">Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells.</a> The EMBO Journal. 16 (21), 6510-6520 (1997).</li><li>Skelley, A. M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+control+of+cell+pairing+and+fusion.">Microfluidic control of cell pairing and fusion.</a> Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).</li><li>Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylene+glycol+rapidly+restores+physiological+functions+in+damaged+sciatic+nerves+of+guinea+pigs.">Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs.</a> Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).</li><li>Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primate+virus+generates+transformed+human+cells+by+fusion.">A primate virus generates transformed human cells by fusion.</a> The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).</li><li>Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cells+suppress+oncogene-dependent+apoptosis.">Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis.</a> Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).</li><li>Duelli, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virus+causes+cancer+by+inducing+massive+chromosomal+instability+through+cell+fusion.">A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion.</a> Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).</li><li>Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratin+intermediate+filament+dynamics+in+cell+heterokaryons+reveals+diverse+behaviour+of+different+keratins.">Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins.</a> Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).</li><li>Lentz, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG+as+a+tool+to+gain+insight+into+membrane+fusion.">PEG as a tool to gain insight into membrane fusion.</a> European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).</li><li>Lentz, B. R., Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+glycol)+(PEG)-mediated+fusion+between+pure+lipid+bilayers:+a+mechanism+in+common+with+viral+fusion+and+secretory+vesicle+release?.">Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release?.</a> Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).</li><li>Pontecorvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+mammalian+somatic+cell+hybrids+by+means+of+polyethylene+glycol+treatment.">Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment.</a> Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).</li><li>Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+giant+polynuclear+cell+formation+caused+by+HVJ+virus+from+Ehrlich's+ascites+tumor+cells.+I.+Microscopic+observation+of+giant+polynuclear+cell+formation.">Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich's ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation.</a> Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).</li><li>Zimmermann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-mediated+fusion+and+related+electrical+phenomena.">Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).</li><li>Hu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+cells+by+flipped+SNAREs.">Fusion of cells by flipped SNAREs.</a> Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).</li><li>Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+cellular+fusion+using+optically+trapped+plasmonic+nano-heaters.">Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters.</a> Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211 (2016).</li><li>Kao, K. N., Michayluk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-frequency+intergeneric+fusion+of+plant+protoplasts.">A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts.</a> Planta. 115 (4), 355-367 (1974).</li><li>Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cell+fusion.">Mechanisms of cell fusion.</a> Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).</li><li>Mahen, R., Venkitaraman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+centrosome+assembly.">Pattern formation in centrosome assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).</li><li>Mahen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+centrosomal+roots+disentangle+to+allow+interphase+centriole+independence.">Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence.</a> PLoS Biology. 16 (4), e2003998 (2018).</li><li>Mahen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+assessment+of+fluorescent+transgene+methods+for+quantitative+imaging+in+human+cells.">Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Yang, J., Shen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylene+glycol-mediated+cell+fusion.">Polyethylene glycol-mediated cell fusion.</a> Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).</li><li>Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+pairing+and+polyethylene+glycol+(PEG)-mediated+cell+fusion+using+two-step+centrifugation-assisted+single-cell+trapping+(CAScT).">Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT).</a> Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).</li><li>Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+Cell-Cell+Fusion+Assay+for+Cytoplasmic+and+Organelle+Intermixing+Studies.">Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies.</a> Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61 (2018).</li><li>Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+of+polyethylene+glycol-induced+cell+fusion+and+hybridization+in+lymphoid+cell+lines.">Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines.</a> Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).</li><li>Frye, L. D., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rapid+intermixing+of+cell+surface+antigens+after+formation+of+mouse-human+heterokaryons.">The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons.</a> Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).</li><li>Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+mitochondria+in+mammalian+cells+is+dependent+on+the+mitochondrial+inner+membrane+potential+and+independent+of+microtubules+or+actin.">Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin.</a> FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).</li><li>Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+fusion+in+vivo+between+normal+host+and+tumor+cells:+possible+contribution+to+tumor+progression+and+metastasis+studied+with+a+lectin-resistant+mutant+tumor.">Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor.</a> Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).</li></ol>

Hücreleri eritmek ve hücre melezlerinin sonraki mimarisini mikroskopi ile görselleştirmek için kolay ve uygun maliyetli bir protokol gösteriyoruz, baştan sona yaklaşık iki gün sürüyor. Bu protokolün kritik bölümleri, erimiş hücrelerin hücre sıralaması (protokol bölüm 3) ile zenginleşmesi ve erimiş hücrelerin mikroskopi ile dikkatli bir şekilde doğrulanmasıdır (protokol bölümü 4). Bu bölümler, erimiş hücrelerin kolayca elde edilmesini ve iyi niyetli heterokaryonlar olmasını sağlar. K...

Hücresel yapının homeostatik bakımı yaşam için çok önemlidir. Hücreler karakteristik morfolojilere, hücre altı organel sayılarına ve iç biyokimyasal bileşimlere sahiptir. Bu temel özelliklerin nasıl oluşturulduğunu ve hastalık sırasında nasıl ters gittiklerini anlamak, onları tedirgin etmek için laboratuvar araçları gerektirir.
Hücre füzyonu iki veya daha fazla ayrı hücrenin birleşmesidir. Hücre füzyonu ökaryotik yaşamın ortaya çıkması için kritik olabilir1. İnsan vücudunda, hücre füzyonu nispeten nadirdir, sınırlı gelişimsel durumlar ve doku tipleri sırasında meydana gelen, döllenme veya kas oluşumu sırasında gibi, kemik ve plasenta2. Bu protokol, hücre yapısını ve işlevini kontrol eden mekanizmaları anlamak için bir araç olarak, farklı floresan olarak etiketlenmiş organeller ile doku kültürü hücre hatlarında hücre-hücre füzyoninin indüksiyonunu tanımlar.
In vitro indüklenen hücre-hücre füzyonu monoklonalantikorlarınüretiminde merkezi 3 , biyolojik araştırma ve hastalık tedavisi için önemli bir araçtır. Hücre füzyonu da hücre döngüsü hakimiyeti hakkında birçok farklı temel hücre biyolojik sorular sormak için kullanılmıştır4, aneuploidy5,6, hücresel yeniden programlama7,8, hasarlı nöronlarınonarımı 9, viral proliferasyon10, apoptoz11, tümörigenesis12, sitoskeletal dinamik13, ve membran füzyon14,15. Hücre-hücre füzyonu ikna etmek için laboratuvar tabanlı yöntemler16,17,18,19 bir iki iki katmanlı fiziksel birleştirme yoluyla lipid membran birleşmesi neden. Hücre füzyonu elektrik tarafından indüklenen olabilir18, viral tabanlı yöntemler17, termoplazmaik ısıtma20, transgen ekspresyonu19, ve polietilen glikol dahil kimyasallar (PEG)16,21,22.
Centrozsomes hücresel şekil, hareketlilik, polarizasyon ve bölüm23kontrol mikrotübül organize merkezleri vardır. Centrozomal kökler,24 protein rootletini içeren centrozomlardan yayılan lifli yapılardır (CROCCgeni tarafından kodlanmıştır). Biz son zamanlarda nasıl centrosome pozisyon ve sayı ebeveyn hücreleri24göre heterokaryoniçinde değişir anlamak için hücre-hücre füzyon kullanılır. Bu yöntemin kullanımının arkasındaki mantığı farklıfloresan floresan etiketli ebeveyn hücrelerinin füzyon sonra bir heterokaryon içinde köklerin kökeni hücre izlemek için, ve böylece görüntü organel füzyon ve fizyon için. Floresan etiketli proteinler rootletin-meGFP veya rootletin-mScarlet-I, daha sonra PEG aracılı hücre füzyonu ile eritilen ayrı hücre hatlarında genom düzenleme tarafından oluşturulur. Akış sitometrisi ve daha sonraki floresan mikroskobu ile erimiş hücreleri tanımlamak için hücre boyalarının(Malzeme Tablosu)kullanımını ve daha sonra menşe ve morfolojisentrozom hücresinin tanımlanmasını tanımlarız (Şekil 1). Bu yaklaşım, hücre homeostazı üzerine organel sayısı da dahil olmak üzere hücresel devlet büyük değişiklikler nasıl incelenmesi için sağlam ve benzersiz bir yöntemdir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62554502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well imaging dishes</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>gba-488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Influx Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Filters (70um)</td>
			<td>Biofil</td>
			<td>CSS010070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Far Red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Violet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody</td>
			<td>NanoTag Biotechnologies</td>
			<td>N1302-At565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15 CO2 independent imaging medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red free DMEM, high glucose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21063029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (1 x PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP151</td>
			<td>nonionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP337</td>
			<td>nonionic detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-cell fusion of genome edited cell lines for perturbation of cellular structure and function

Yaşam, hücre ve organeller içinde farklı moleküler durumların izole oluşumunu sağlamak için lipid membranları içinde mekansal olarak bölümlenir. Hücre füzyonu, tek bir hücreyi oluşturmak için iki veya daha fazla hücrenin birleşmesidir. Burada iki farklı hücre türünün hücre füzyonu için bir protokol salıyoruz. Erimiş hibrid hücreler akış sitometri tabanlı sıralama ile zenginleştirilmiş, hibrid hücre yapısı ve fonksiyonufloresan mikroskobu takip. Genom düzenleme tarafından üretilen floresan etiketli proteinler erimiş hücrelerin içinde görüntülenir, hücre yapıları floresan emisyona göre tespit ve kökeni hücre tipine geri başvurulmasını sağlar. Bu sağlam ve genel yöntem, hücresel yapıyı ve işlevi bir dizi temel biyolojik soru da anlamak için farklı hücre tiplerine veya ilgi organlarına uygulanabilir.

Uygun şekilde etiketlenmiş hücreler akış sitometrisi sırasında floresan sinyali ile etiketlenmemiş kontrol hücrelerinden daha yüksek görünür(Şekil 2A). Kapılar çift pozitif hücrelerin ayıklanması için ayarlanmış, daha fazla mikroskobik analizler için görüntüleme yemekleri doğrudan bu popülasyon zenginleştirmek. Erimiş hücreler farklı çift floresan pozitif hücreler olarak saptanabilir ve nüfusun yaklaşık ~ ...

Watch this Scientific Journal Video about Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function at JoVE.com

Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

Bu protokolün amacı, melez hücreler oluşturmak için iki farklı hücre türünü birleştirmektir. Erimiş hücrelerin floresan mikroskobu analizi hücresel organellerin menşe hücresini izlemek için kullanılır. Bu tetki, hücre yapısı nın ve fonksiyonun hücre füzyonu ile tedirginlik lere nasıl tepki verdiğinin araştırılması için kullanılabilir.

Hücresel Yapı ve Fonksiyonun Perturbasyonu için Genom Düzenlenmiş Hücre Hatları hücre-hücre Füzyon

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...

Bu yöntem, hücrelerin organel sayısındaki değişikliklere nasıl tepki verdiği gibi soruları yanıtlamak için iki farklı hücre türünün birleşmesi yoluyla hücresel yapı ve fonksiyonun tedirgin olmasını sağlar. Erimiş hücreler içinde floresan etiketli proteinlergörüntüleme ile, hücresel yapılar organel homeostaz ve fonksiyon mekanizmaları çalışma için kökeni kendi hücre tipine geri başvurulabilir. Floresan boya etiketleme için, her kültür en az altı kez 10 altıncı hücrelere ertesi sabah% 70-90 biraraya kadar genişletilmiş olacak gibi ilgi insan kanser hücresi popülasyonları bakın.Etiketleme gününde, rootletin eGFP ve rootletin-mScarlet hücreleri yıkama başına 10 mililitre PBS ile iki kez yıkayın. PBS'de 500 nanomolar ve PBS'de 200 nanomolar için Far Red hücre boyasına seyreltin. Seyreltilmiş Menekşe hücre boyası ve rootletin-mScarlet hücreleri ile seyreltilmiş Uzak Kırmızı hücre boyası ile oda sıcaklığında bir dakika için rootletin eGFP hücreleri etiketleyin.Kuluçkaların sonunda, 10 mililitre DMEM ile reaksiyonları beş dakika durdurun. Tüm kültürleri bir mililitre önceden ısıtılmış tripsin ile kuluçkaya yatırmadan önce hem etiketli hücre kültürlerini hem de etiketsiz bir ebeveyn hücre kültürünü 10 mililitre taze PBS ile yıkayın. Kuluçka sonunda, müstakil hücre çözümlerini santrifüj için tek tek 15 mililitrelik konik tüplere aktarın ve pbs bir mililitre ve DMEM bir mililitre etiketsiz hücreleri yavaşça boya etiketli pelet ler yeniden askıya.Sonra tüm hücre örneklerini hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün. Hücre füzyonu deneyi için, 500 mikrolitre Mor boya etiketli hücreleri 500 mikrolitre Far Red boya etiketli hücrelerle yeni bir 15 mililitrelik tüpte karıştırın ve kalan karıştırılmamış etiketli hücreleri santrifüj le çökün. Bir mililitre taze DMEM'deki peletleri yeniden askıya alın ve hücreleri tekrar kuvöze yerleştirin.Santrifüj ile karışık hücreleri toplayın ve 30 saniye lik bir süre boyunca pelete damla şeklinde 50%1450 PEG 700 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında 3,5 dakika kaldıktan sonra, 30 saniye lik bir süre boyunca 10 mililitre serumsuz DMEM damlası ekleyin ve tüpleri 10 dakika boyunca kuvöze yerleştirin. Kuluçka sonunda, santrifüj ile karışık hücreleri tortu ve yavaşça tam orta bir mililitre pelet resuspend.FACS tarafından erimiş hücre popülasyonu için zenginleştirmek için, 70 mikrometrelik bir süzgeç aracılığıyla tüm hücreleri tek tek FACS tüpleri halinde hafifçe filtreleyin ve sitometre yazılımında yan dağılıma karşı ileri dağılım ve çift ayrımcılık çizimleri oluşturun. Floresan yoğunluğunu kaydetmek ve erimiş hücreleri tanımlamak için kapılar oluşturmak için etiketlenmemiş hücreleri çalıştırın. Daha sonra, Uzak Kırmızı kanala Violet sinyalinin dökülmediğini doğrulamak için tek pozitif Violet boya etiketli hücreleri ve Violet kanalında Uzak Kırmızı sinyali olmadığını doğrulamak için tek pozitif Far Red boya etiketli hücreleri çalıştırın.Sonra kısa bir süre erimiş hücrelerin bu kapılar ile görünür olduğunu doğrulamak için füzyon örneği çalıştırın. Sıralama parametreleri ayarlandığında, sıralama akışını merkezi olarak 100 mikrolitre büyüme ortamı içeren sekiz kuyulu bir görüntüleme kabına hizalayın ve çift pozitif erimiş hücreleri doğrudan çanağa sıralayın. Tüm hücreler sıralandığında, hemen iki ila 16 saat boyunca hücre kültürü kuluçka içine çanak yerleştirin.İmmünofloresan boyama için, ilk oda sıcaklığında 15 dakikalık bir kuluçka için% 4 paraformaldehit 200 mikrolitre ile hücre kültürü supernatant değiştirin. Fiksasyon sonunda, hücreleri yıkama başına 200 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın ve hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %0,1'lik noniyonik yüzey aktif maddenin 200 mikrolitresinde geçirin. Daha sonra, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS'de %3'lük büyükbaş serum albuminin 200 mikrolitresi ile spesifik olmayan bağlamayı engelleyin ve ardından 150 mikrolitre boyama tamponunda ilgi antikorları ile etiketleyin.Oda sıcaklığında bir saat sonra, yıkama başına beş dakika boyunca PBS 300 mikrolitre hücreleri iki kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, 200 mikrolitre taze PBS ile yıkamayı değiştirin. Erimiş hücrelerin görüntülerini elde etmek için, dört renkli görüntüleme yeteneğine sahip uygun bir floresan mikroskobu kullanın ve üç boyutlu görüntüler toplayın.Uygun şekilde etiketlenmiş hücreler akış sitometrisi sırasında floresan sinyal le etiketlenmemiş kontrol hücrelerinden daha yüksek bir düzeyde görülebilir. Kapılar daha fazla mikroskobik analiz için görüntüleme yemekleri doğrudan çift pozitif hücre popülasyonu için zenginleştirmek için sıralama için ayarlanabilir. Füzyon, iki hücrenin bir araya getirilmesi yoluyla hücresel mimarinin büyük bir yeniden düzenlenmesini sağlar.Heterokaryonlar plazma membranları müdahale etmeden tek bir hücre içinde karışık hem floresan boya sinyalleri içeren hücreler olarak tanımlanır. Ayrıca, brightfield görüntüleme ile erimiş hücrelerde iki çekirdek de görülebilir. Hücre yapısı ve fonksiyonu daha fazla meGFP ve mScarlet etiketli proteinler içeren hücrelerin birleştirilmesi ile araştırılabilir.Füzyon, sentrozom perisentriolar bileşen NEDD1 floresan etiketli olduğunda en az dört perisentrioler malzeme foci olarak görülebilir heterokaryoniçinde sentrozom sayısının iki katına çıkar. Endojen floresan etiketli rootletin ile hücrelerin füzyon her centrozsome kökeni hücre bir heterokaryon tespit edilmesine olanak sağlar. Bu protokol, farklı olarak etiketlenmiş hücre çizgilerini nasıl birleştirirken, organellerinin yapılarını ve işlevlerini anlamak için nasıl görüntüleneceğimi göstermektedir.Bu sağlam protokol, benzer yöntemlerle karşılaştırıldığında gerçekleştirmek için hem nispeten kolay hem de nispeten ucuzdur. Bu teknik, organel füzyonunun nasıl düzenlendiği ve hücrelerin hücre altı organel sayısındaki değişikliklere nasıl tepki verebildiği gibi bir dizi soru sormak için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Statik Organ Kültürü kullanarak Palatal Fusion incelenmesi yöntemi

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Genom düzenlenmiş İnsan Pluripotent Kök Hücre Hatları oluşturulması: İzolasyon hedefleyen Gönderen

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Threespine Sticklebacks içinde Transgenesis ve Genom Kurgu Mikroenjeksiyon

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Blastulae Gelişmekte Cerrahi Fusion tarafından Parabiyotik balığı Embriyolar Üretimi

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Çift nokta MARCM kullanılması Hücre Lineage Analizleri ve Gen Fonksiyonu Çalışmaları

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Recombinase aracılı Kaset Değişimi Kullanarak Fare Embriyonik Kök Hücre yapı-fonksiyon Çalışmaları

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Fare İkincil Palin Füzyonunun Canlı Görüntüsü

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Fare Preimplantasyon embriyo kök hücre satırlarından türetme

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Yaralanma kaynaklı yaşlanma ve In Vivo kas iskelet yeniden programlama değerlendirilmesi

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...