Name: in vitro culture of epithelial cells from different anatomical regions of the human amniotic membrane
Uploaded: 2019-11-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane at JoVE.com

Vores forskning blev støttet af tilskud fra Instituto Nacional de Perinatología de México (21041 og 21081) og CONACYT (a1-S-8450 og 252756). Vi takker Jessica González Norris og Lidia Yuriria Paredes Vivas for den tekniske støtte.

Denne protokol blev godkendt af det etiske udvalg i Instituto Nacional de Perinatología i Mexico City (registreringsnummer 212250-21041). Alle procedurer i disse undersøgelser var i overensstemmelse med de etiske standarder for Instituto Nacional de Perinatología, Helsingfors-erklæringen, og de retningslinjer, der er fastsat i Sundhedsministeriet officielle mexicanske standard.
1. forberedelse
<ol><li>Forbered en opløsning af 1x PBS med EDTA. For at gøre dette, tilsættes 500 μL 0,5 M...

<ol>
	<li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li><li>Garcia-Lopez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amniotic+epithelium+(HAE)+as+a+possible+source+of+stem+cells+(SC).">Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC).</a> Gaceta Medica de Mexico. 151 (1), 66-74 (2015).</li><li>Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Human+Amnion+Epithelial+Cells+According+to+Current+Good+Manufacturing+Procedures.">Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).</li><li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amnion+epithelial+cell+isolation+and+characterization+for+clinical+use.">Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).</li><li>Garcia-Castro, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+Pluripotency+in+Human+Amniotic+Epithelial+Cells+and+Their+Differentiation+to+Progenitor+of+Cortical+Neurons.">Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons.</a> PLoS One. 10 (12), 0146082 (2015).</li><li>Garcia-Lopez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+markers+in+tissue+and+cultivated+cells+in+vitro+of+different+regions+of+human+amniotic+epithelium.">Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium.</a> Experimental Cell Research. 375 (1), 31-41 (2019).</li><li>Yang, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+characterization+of+human+amniotic+epithelial+cells+in+a+serum-free+system+and+their+safety+evaluation.">Biological characterization of human amniotic epithelial cells in a serum-free system and their safety evaluation.</a> Acta Pharmacological Sinica. 39 (8), 1305-1316 (2018).</li><li>Zou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA32+silences+WWP2+expression+to+maintain+the+pluripotency+of+human+amniotic+epithelial+stem+cells+and+beta+isletlike+cell+differentiation.">MicroRNA32 silences WWP2 expression to maintain the pluripotency of human amniotic epithelial stem cells and beta isletlike cell differentiation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 41 (4), 1983-1991 (2018).</li><li>Avila-Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+ephemeral+human+pluripotent+state.">Capturing the ephemeral human pluripotent state.</a> Developmental Dynamics. 245 (7), 762-773 (2016).</li><li>Niknejad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+amniotic+membrane+for+potential+use+in+tissue+engineering.">Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering.</a> European Cells &amp; Materials. 15, 88-99 (2008).</li><li>Miki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+characteristics+and+the+therapeutic+potential+of+amniotic+epithelial+cells.">Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 80 (4), 13003 (2018).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+proliferation,+migration+and+angiogenic+properties+of+human+amniotic+epithelial+and+mesenchymal+stem+cells+and+their+effects+on+endothelial+cells.">Comparison of the proliferation, migration and angiogenic properties of human amniotic epithelial and mesenchymal stem cells and their effects on endothelial cells.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 918-926 (2017).</li><li>Hammer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amnion+epithelial+cells,+in+contrast+to+trophoblast+cells,+express+all+classical+HLA+class+I+molecules+together+with+HLA-G.">Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I molecules together with HLA-G.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 37 (2), 161-171 (1997).</li><li>Benirschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+Pathology+of+the+Placental+Membranes.">Anatomy and Pathology of the Placental Membranes.</a> Pathology of the Human Placenta. , 268-318 (1995).</li><li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+metabolic+activity+in+placental+and+reflected+regions+of+the+human+amniotic+membrane.">Different metabolic activity in placental and reflected regions of the human amniotic membrane.</a> Placenta. 36 (11), 1329-1332 (2015).</li><li>Kim, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-143+regulation+of+prostaglandin-endoperoxidase+synthase+2+in+the+amnion:+implications+for+human+parturition+at+term.">miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term.</a> PLoS One. 6 (9), 24131 (2011).</li><li>Han, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+gene+expression+profiling:+novel+evidence+for+biological+heterogeneity+of+the+human+amnion.">Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heterogeneity of the human amnion.</a> Biology of Reproduction. 79 (5), 954-961 (2008).</li><li>Alcaraz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+TGF-beta+induces+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+human+amniotic+epithelial+cells.">Autocrine TGF-beta induces epithelial to mesenchymal transition in human amniotic epithelial cells.</a> Cell Transplantation. 22 (8), 1351-1367 (2013).</li><li>Canciello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+prevents+epithelial-mesenchymal+transition+of+ovine+amniotic+epithelial+cells+and+enhances+their+immunomodulatory+properties.">Progesterone prevents epithelial-mesenchymal transition of ovine amniotic epithelial cells and enhances their immunomodulatory properties.</a> Scientific Reports. 7 (1), 3761 (2017).</li><li>Canciello, A., Greco, L., Russo, V., Barboni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+Epithelial+Cell+Culture.">Amniotic Epithelial Cell Culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1817, 67-78 (2018).</li><li>Singh, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+network+crosstalk+in+human+pluripotent+cells:+a+Smad2/3-regulated+switch+that+controls+the+balance+between+self-renewal+and+differentiation.">Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 312-326 (2012).</li><li>Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Focal+Adhesion+Kinase+Signaling+by+Integrin+alpha6beta1+Supports+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Self-Renewal.">Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal.</a> Stem Cells. 34 (7), 1753-1764 (2016).</li><li>Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+regional+distribution+of+aquaporins+in+amnion+of+normal+and+gestational+diabetic+pregnancies.">Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies.</a> Physiological Reports. 3 (3), 12320 (2015).</li><li>Avila-Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amniotic+epithelial+cells+as+feeder+layer+to+derive+and+maintain+human+embryonic+stem+cells+from+poor-quality+embryos.">Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos.</a> Stem Cell Research. 15 (2), 322-324 (2015).</li></ol>

Vi har implementeret en ny protokol for at isolere HAEC fra term membraner. Det adskiller sig fra tidligere rapporter i, at hver membran var opdelt i sine tre anatomiske regioner forud for isolation til at analysere celler fra hver enkelt.
En af de mest kritiske trin i protokollen er vask af membranen til at fjerne alle blodpropper, fordi de kan forstyrre aktiviteten af trypsin, når adskille epiteliale celler. Undladelse af at udføre dette trin ordentligt kan føre til opnåelse af en primæ...

Humane amniotiske epitelceller (haec) har oprindelse i de tidlige stadier af fosterudviklingen, på omkring otte dage efter befrugtning. De opstår fra en population af plade epiteliale celler i epiblast, der stammer fra det inderste lag af den amniotiske membran1. Således betragtes HAEC som rester af pluripotente celler fra epiblast, der har potentialet til at differentiere sig til de tre kimlag i embryonet2. I de sidste ti år har forskellige forskergrupper udviklet metoder til at isolere disse celler fra Foster membranen ved drænings perioden for at karakterisere deres formodede pluripotrelaterede egenskaber i en kulturmodel in vitro3,4.
Det er derfor blevet konstateret, at HAEC har egenskaber, der er karakteristiske for humane pluripotente stamceller (HPSC), såsom overfladeantigener SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; kernen i pluripotens transkriptionsfaktorer OCT4, SOX2 og NANOG; og spredning markør KI67, tyder på, at de er selvfornyende5,6,7. Desuden er disse celler blevet udfordret ved hjælp af differentierings protokoller for at opnå celler positive for Lineage-specifikke markører for de tre kimlag (ectoderm, mesoderm, og endoderm)4,5,8, samt i dyremodeller af sygdomme hos mennesker. Endelig haec Express E-cadherin, som viser, at de bevarer en epitelial natur meget gerne hpsc5,9.
Ud over deres embryonale oprindelse har haec andre iboende egenskaber, der gør dem velegnede til forskellige kliniske anvendelser, såsom udskillelsen af antiinflammatoriske og antibakterielle molekyler10,11, vækstfaktorer og cytokinfrigivelse12, ingen dannelse af Teratomer, når de transplanteres til immunodedygtige mus i modsætning til hpsc2, og immunologisk tolerance, fordi de udtrykker HLA-G, hvilket nedsætter risikoen for afvisning efter transplantation13.
Tidligere rapporter har imidlertid antaget, at den humane amnion er en homogen membran, uden at overveje, at det kan være anatomisk og fysiologisk opdelt i tre regioner: placenta (den amnion, der dækker lærk basalis), navlestrengen (den del, der indhyller navlestrengen), og reflekteres (resten af membranen ikke er fastgjort til placenta)14. Det har vist sig, at de placentale og reflekterede områder af amnion viser forskelle i morfologi, mitokondriel aktivitet, påvisning af reaktive ilt arter15, Mirna udtryk16, og aktivering af signalering veje17. Disse resultater tyder på, at den menneskelige amnion er integreret af en heterogen population med forskellig funktionalitet, der bør overvejes for yderligere undersøgelser udført i enten in situ-eller in vitro-modeller. Mens andre laboratorier har designet protokoller til isolering af HAEC fra hele membranen, vores laboratorium har etableret en protokol til at isolere, kultur, og karakterisere celler fra forskellige anatomiske regioner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>55 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>12430054</td>
			<td>Supplemented with high glucose and HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Ambion</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>0.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonic stem-cell FBS, qualified</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>10439024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution (sodium chloride 0.9%)</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>with conical bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 &#181;l, 200 &#181;l and 10 &#181;l.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton gauzes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical gloves</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Pipet Filler/Dispenser</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile beakers of 500 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic cutting board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile stainless steel container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tray</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>MaCSmix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies and Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Antibody ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-cadherin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td>RRID:AB_3975</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KI67</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>23900</td>
			<td>RRID:AB_627859)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NANOG</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>500-P236</td>
			<td>RRID:AB_1268274</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OCT4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab19857</td>
			<td>RRID:AB_44517</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5603</td>
			<td>RRID:AB_2286686</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SSEA-4</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4755</td>
			<td>RRID:AB_1264259</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRA-1-60</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4746</td>
			<td>RRID:AB_2119059</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>RRID:AB_2534088</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11036</td>
			<td>RRID:AB_10563566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunel Assay Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>66110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro culture of epithelial cells from different anatomical regions of the human amniotic membrane

Flere protokoller er blevet rapporteret i litteraturen for isolation og kultur af humane amniotiske epiteliale celler (HAEC). Men, disse antager, at Foster epitelet er et homogent lag. Den menneskelige amnion kan opdeles i tre anatomiske regioner: reflekteret, placenta og navle. Hver region har forskellige fysiologiske roller, såsom i patologiske tilstande. Her beskriver vi en protokol til dissekere humant amnion væv i tre sektioner og vedligeholde det in vitro. I kulturen viste celler afledt af den reflekterede amnion en cuboidal morfologi, mens celler fra både placenta og navle lige regioner var skællede. Ikke desto mindre, alle de opnåede celler har en epitelial fænotype, demonstreret ved immunodetektion af E-cadherin. Da placenta og reflekterede regioner in situ adskiller sig fra hinanden i celle komponenter og molekylære funktioner, kan det derfor være nødvendigt for in vitro-undersøgelser at tage hensyn til disse forskelle, fordi de kan have fysiologiske konsekvenser for brugen af HAEC i biomedicinsk forskning og den lovende anvendelse af disse celler i regenerativ medicin.

HAEC blev isoleret fra hver af de tre anatomiske regioner i den amniotiske membran og individuelt dyrkede in vitro. Efter 48 h af kultur, celler med en epitelial fænotype klæbet til overfladen af pladen, selv om medierne også indeholdt celleaffald og flydende celler, som blev fjernet, når mediet blev ændret (figur 3).
Under behandlingen af primær kulturen (passage Zero, p0) kan der opstå komplikationer, som kan forstyrre den eksperimentelle dataanalyse (<st...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane at JoVE.com

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

Denne protokol beskriver isolationen af epiteliale celler fra forskellige anatomiske områder af den menneskelige amniotiske membran til at bestemme deres heterogenitet og funktionelle egenskaber for mulige anvendelse i kliniske og fysiopatologiske modeller.

In vitro-kultur af Epiteliale celler fra forskellige anatomiske områder af den humane amniotiske membran

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...

Denne protokol kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål om heterogenitet og funktionelle egenskaber af humane fostervand epitelceller isoleret fra fosterhinde. Mens tidligere protokoller isolerede celler fra co-fosterhinde uden at skelne mellem regioner, giver vores protokol kulturen i cellepopulationen isoleret fra tre forskellige anatomiske regioner. At adskille fosterhinden efter region, i et biosikkerhedsskab under sterile forhold, identificere navlestrengen omsluttende navlestrengen, placentaal amnion, der dækker decidua basalis, og den reflekterede region, som betragtes som resten af amnion, der ikke er knyttet til moderkagen.At dissekere navlestrengen amnion region, bruge dissekere kraftbefængsler til at holde den del af amnionmembranen, der dækker krydset af moderkagen og navlestrengen, og bruge en skalpel til at dissekere den region, der omgiver ledningen, mens strækker sig til at adskille regionen fra chorion. Derefter deponeres det adskilte væv i et mærket bægerglas med 100 milliliter saltvandsopløsning. For at dissekere placenta amnion regionen, bruge en steril bomuld gaze til at fjerne blodpropper fra overfladen af chorion / amnion, der dækker moderkagen.Og brug dissekere kraftaffænge dele til at gribe membranen på grænsen mellem moderkagen og den reflekterede region. Brug en skalpel til at skære langs omkredsen af moderkagen og adskille moderkagen amnion fra chorion, passe på ikke at skære nogen fartøjer fra moderkagen. Det adskilte væv i et andet mærket bægerglas med 300 milliliter saltvandsopløsning.Og adskille resten af fosterhinden, der ikke er knyttet til moderkagen fra chorion. Derefter placeres det reflekterede område i et andet mærket bægerglas med 300 milliliter saltvandsopløsning. For at vaske membranerne skal du bruge en pincet til at placere dem på en steril overflade for at kunne kassere saltvandsopløsningen fra hver vævsbeholder.100 milliliter frisk saltvandsopløsning sættes tilbage i beholderen og tilsættes 100 milliliter frisk saltvandsopløsning til navlestrengen og 300 milliliter frisk saltvandsopløsning til placentaen og de reflekterede områder. Brug dissekere kraftbefængte til at røre membranerne for at fjerne eventuelle rester af blod og placere membranerne på den sterile overflade for at kunne kassere saltvandsopløsningerne. Derefter vaskes membranerne mindst to gange mere, som det netop er påvist, indtil vævene er gennemskinnelige.For enzymatisk fordøjelse af de forskellige fosterhinderegioner skæres de reflekterede og placentaregionerne i to eller tre fragmenter. Og læg fragmenterne og navlestrengen i individuelle 50-milliliter centrifugerør. Der tilsættes 20 milliliter 0,5 % trypsin-EDTA til hvert rør af reflekterede og placenale vævsfragmenter og fem milliliter 0,5 % trypsin-EDTA til røret, der indeholder navlestrengens væv.Ryst rørene forsigtigt i 30 sekunder. Derefter placeres membranerne på en steril overflade, kasseres trypsin-EDTA-opløsningen og erstattes med 30 milliliter frisk 0,5% trypsin-EDTA for det reflekterede og placenale område vævsfragmenter og 15 milliliter frisk 0,5% Trypsin-EDTA til navlestrengen væv. Derefter placere rørene i en rotator inde i en kuvøse for en 40-minutters rotation ved 20 rotationer i minuttet ved 37 grader Celsius.Ved inkubationens afslutning overføres hele celleopløsningens volumen til nye koniske rør. Og tilsæt to gange mængden af 37-graders-Celsius humane AE celler medium til hvert rør på is. Fordøje eventuelle rester væv fragmenter i de oprindelige rør med friske 0,5% trypsin-EDTA, som netop påvist.I slutningen af den anden fordøjelse skal du bruge et par dissekere kraftbeføjelser til at holde den ene ende af amniondelen og et andet par dissekere kraftbeføjelser til at klemme langs det resterende væv for at fjerne eventuelle rækker af epitelceller, der ikke helt skrællede af i de foregående inkubationsperioder. Fjern derefter membranerne for at kunne overføre den anden fordøjelsesopløsning til et andet sæt centrifugerør. Og inaktivere fordøjelsesenzymer med to gange mængden af frisk 37-graders-Celsius humant AE cellemedium på is.For human ae celleisolering, sediment cellerne ved centrifugering. Og resuspend pellet i hvert rør med 10 milliliter frisk 37-graders-Celsius humane AE celle medium. Træk hvert par fordøjelser ind i et enkelt rør og filtrer suspensionerne gennem 100-mikrometerspatorer for at fjerne eventuelle ekstracellulære matrixrester.Efter optælling, frø de menneskelige AE celler fra hver af de tre regioner i individuelle 100-millimeter plader på en tre gange 10 til de fjerde celler per centimeter kvadreret koncentration i 37-graders-Celsius humane AE celle medium, suppleret med 10 nanogram per milliliter af menneskelige epidermal vækstfaktor. Derefter inkuberes kulturerne ved 37 grader Celsius under normoxiske forhold i en befugtet inkubator, indtil downstream-analysen af interesse. Efter 48 timers kultur klæber humane AE-celler med et epitelfænotype til pladens overflade, mens supernatanten indeholder cellerester og flydende celler, der kan fjernes, når mediet er ændret.Det er tilrådeligt at kassere kulturer og behandle en anden membran ved at identificere tilstedeværelsen af bakteriel forurening, overdreven erythrocytter på grund af utilstrækkelig vask af membraner, mangelfuldt eller ikke-vedhæftige celler, eller celler med en fibroblast morfologi. Human AE celle morfologi afhænger af oprindelsen af cellerne, som celler fra den reflekterede zone demonstrere en kuboid morfologi og vokse i en brostensbelagt monolag, og celler fra placenta og navlestrengsområder er fladere og planocellulær. Immunfluorescens mod E-cadherin afslører, at de primære kulturer og subkulturer opretholde deres epitel fænotype, hvilket tyder på, at der ikke er nogen forurening af en anden celletype.Desuden er cellerne levedygtige, som det fremgår af deres udtryk for Ki-67 spredningsmarkøren. Selv om subpopulationerne fra amnion adskiller sig i deres morfologi og funktion, udtrykket og tilstedeværelsen af kernen af pluripotency faktorer ændrer sig ikke i humane AE celler stammer fra placenta og reflekterede regioner. Da humane fosterursepitelceller er en mulig kilde til pluripotente stamceller, kan vi udfordre dem gennem en række specifikke definitionsprotokoller for at belyse, om disse celler fra hver region har forskellige potentialer.Forud for en startet protokol, gennemgå patientens sygehistorie for at være sikker på, at vævet udviser ingen mikrobiologiske egenskaber af infektion.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Primær endodermal epithelcellekultur fra blommesækken membran af japanske vagtelembryoner

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Udvikling af et<em&gt; In vitro</em&gt; Assay til Evaluer kontraktionsfunktion af mesenchvmal-celler der undergik Epithelial-Mesenchymal Overgangseffekter

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storstilet produktion af cardiomyocytter fra menneskelige pluripotente stamceller Ved hjælp af en meget reproducerbar lille molekyle-Based Differentiering Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Produktionen af ​​pluripotente stamceller fra mus fostervand Celler Ved hjælp af en Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolering af Mouse Endometrial epitel- og stromacellers for<em&gt; In vitro</em&gt; decidualisering

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Instrueret differentiering af Primitive og endelige hæmatopoietisk ophav fra humane pluripotente stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Omprogrammering primære fostervand og membran celler til Pluripotency i Xeno-fri betingelser

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Hurtig, instrueret differentiering af retinale Pigment epitel celler fra menneskelige embryonale eller induceret pluripotente stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

Anvendelse af Aorta-gonade-mesonephros eksplantat kultur System i udviklingsmæssige bloddannelsen

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Dyrkning af retinale Pigment epitel celler på en Ex Vivo Model af alderen menneskelige Bruchs membran

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...