Name: in vitro culture of epithelial cells from different anatomical regions of the human amniotic membrane
Uploaded: 2019-11-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane at JoVE.com

Nos recherches ont été soutenues par des subventions de l'Instituto Nacional de Perinatologa de México (21041 et 21081) et du CONACYT (A1-S-8450 et 252756). Nous remercions Jessica Gonzalez Norris et Lidia Yuriria Paredes Vivas pour le soutien technique.

Ce protocole a été approuvé par le comité d'éthique de l'Instituto Nacional de Perinatologa à Mexico (numéro d'enregistrement 212250-21041). Toutes les procédures effectuées dans le cours de ces études étaient conformes aux normes éthiques de l'Instituto Nacional de Perinatologa, de la Déclaration d'Helsinki et des lignes directrices énoncées dans la Norme officielle mexicaine du ministère de la Santé.
1. Préparation
<ol><li>Préparer une solution de 1x PBS avec EDTA. Pour ...

<ol>
	<li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li><li>Garcia-Lopez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amniotic+epithelium+(HAE)+as+a+possible+source+of+stem+cells+(SC).">Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC).</a> Gaceta Medica de Mexico. 151 (1), 66-74 (2015).</li><li>Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Human+Amnion+Epithelial+Cells+According+to+Current+Good+Manufacturing+Procedures.">Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).</li><li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amnion+epithelial+cell+isolation+and+characterization+for+clinical+use.">Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).</li><li>Garcia-Castro, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+Pluripotency+in+Human+Amniotic+Epithelial+Cells+and+Their+Differentiation+to+Progenitor+of+Cortical+Neurons.">Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons.</a> PLoS One. 10 (12), 0146082 (2015).</li><li>Garcia-Lopez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+markers+in+tissue+and+cultivated+cells+in+vitro+of+different+regions+of+human+amniotic+epithelium.">Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium.</a> Experimental Cell Research. 375 (1), 31-41 (2019).</li><li>Yang, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+characterization+of+human+amniotic+epithelial+cells+in+a+serum-free+system+and+their+safety+evaluation.">Biological characterization of human amniotic epithelial cells in a serum-free system and their safety evaluation.</a> Acta Pharmacological Sinica. 39 (8), 1305-1316 (2018).</li><li>Zou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA32+silences+WWP2+expression+to+maintain+the+pluripotency+of+human+amniotic+epithelial+stem+cells+and+beta+isletlike+cell+differentiation.">MicroRNA32 silences WWP2 expression to maintain the pluripotency of human amniotic epithelial stem cells and beta isletlike cell differentiation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 41 (4), 1983-1991 (2018).</li><li>Avila-Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+ephemeral+human+pluripotent+state.">Capturing the ephemeral human pluripotent state.</a> Developmental Dynamics. 245 (7), 762-773 (2016).</li><li>Niknejad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+amniotic+membrane+for+potential+use+in+tissue+engineering.">Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering.</a> European Cells &amp; Materials. 15, 88-99 (2008).</li><li>Miki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+characteristics+and+the+therapeutic+potential+of+amniotic+epithelial+cells.">Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 80 (4), 13003 (2018).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+proliferation,+migration+and+angiogenic+properties+of+human+amniotic+epithelial+and+mesenchymal+stem+cells+and+their+effects+on+endothelial+cells.">Comparison of the proliferation, migration and angiogenic properties of human amniotic epithelial and mesenchymal stem cells and their effects on endothelial cells.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 918-926 (2017).</li><li>Hammer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amnion+epithelial+cells,+in+contrast+to+trophoblast+cells,+express+all+classical+HLA+class+I+molecules+together+with+HLA-G.">Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I molecules together with HLA-G.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 37 (2), 161-171 (1997).</li><li>Benirschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+Pathology+of+the+Placental+Membranes.">Anatomy and Pathology of the Placental Membranes.</a> Pathology of the Human Placenta. , 268-318 (1995).</li><li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+metabolic+activity+in+placental+and+reflected+regions+of+the+human+amniotic+membrane.">Different metabolic activity in placental and reflected regions of the human amniotic membrane.</a> Placenta. 36 (11), 1329-1332 (2015).</li><li>Kim, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-143+regulation+of+prostaglandin-endoperoxidase+synthase+2+in+the+amnion:+implications+for+human+parturition+at+term.">miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term.</a> PLoS One. 6 (9), 24131 (2011).</li><li>Han, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+gene+expression+profiling:+novel+evidence+for+biological+heterogeneity+of+the+human+amnion.">Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heterogeneity of the human amnion.</a> Biology of Reproduction. 79 (5), 954-961 (2008).</li><li>Alcaraz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+TGF-beta+induces+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+human+amniotic+epithelial+cells.">Autocrine TGF-beta induces epithelial to mesenchymal transition in human amniotic epithelial cells.</a> Cell Transplantation. 22 (8), 1351-1367 (2013).</li><li>Canciello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+prevents+epithelial-mesenchymal+transition+of+ovine+amniotic+epithelial+cells+and+enhances+their+immunomodulatory+properties.">Progesterone prevents epithelial-mesenchymal transition of ovine amniotic epithelial cells and enhances their immunomodulatory properties.</a> Scientific Reports. 7 (1), 3761 (2017).</li><li>Canciello, A., Greco, L., Russo, V., Barboni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+Epithelial+Cell+Culture.">Amniotic Epithelial Cell Culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1817, 67-78 (2018).</li><li>Singh, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+network+crosstalk+in+human+pluripotent+cells:+a+Smad2/3-regulated+switch+that+controls+the+balance+between+self-renewal+and+differentiation.">Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 312-326 (2012).</li><li>Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Focal+Adhesion+Kinase+Signaling+by+Integrin+alpha6beta1+Supports+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Self-Renewal.">Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal.</a> Stem Cells. 34 (7), 1753-1764 (2016).</li><li>Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+regional+distribution+of+aquaporins+in+amnion+of+normal+and+gestational+diabetic+pregnancies.">Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies.</a> Physiological Reports. 3 (3), 12320 (2015).</li><li>Avila-Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amniotic+epithelial+cells+as+feeder+layer+to+derive+and+maintain+human+embryonic+stem+cells+from+poor-quality+embryos.">Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos.</a> Stem Cell Research. 15 (2), 322-324 (2015).</li></ol>

Nous avons mis en œuvre un nouveau protocole pour isoler HAEC des membranes à terme. Il diffère des rapports précédents en ce que chaque membrane a été divisée en ses trois régions anatomiques avant l'isolement pour analyser des cellules de chacun.
Une des étapes les plus critiques dans le protocole est le lavage de la membrane pour enlever tous les caillots sanguins, car ils peuvent interférer avec l'activité de la trypsine lors de la séparation des cellules épithéliales. Le d?...

Les cellules d'épithélium amniotique humaine (HAEC) proviennent des premiers stades du développement embryonnaire, à environ huit jours de postfertilisation. Ils proviennent d'une population de cellules épithéliales squameuses de l'épiblaste qui dérivent de la couche la plus interne de la membrane amniotique1. Ainsi, HAEC sont considérés comme des restes de cellules pluripotentes de l'épiblaste qui ont le potentiel de se différencier en trois couches germinales de l'embryon2. Au cours de la dernière décennie, divers groupes de recherche ont mis au point des méthodes pour isoler ces cellules de la membrane amniotique à la période de gestation afin de caractériser leurs propriétés présomptives liées à la pluripotence dans un modèle culturel in vitro3,4.
En conséquence, il a été constaté que HAEC caractéristiques caractéristiques des cellules souches pluripotentes humaines (HPSC), tels que les antigènes de surface SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; le noyau des facteurs de transcription de pluripotence OCT4, SOX2, et NANOG ; et le marqueur de prolifération KI67, suggérant qu'ils sont auto-renouvellement5,6,7. En outre, ces cellules ont été contestées en utilisant des protocoles de différenciation pour obtenir des cellules positives pour les marqueurs spécifiques à la lignée des trois couches germinales (ectoderm, mesoderm et endoderm)4,5,8, ainsi que dans les modèles animaux des maladies humaines. Enfin, HAEC exprime E-cadherin, qui démontrent qu'ils conservent une nature épithéliale un peu comme le HPSC5,9.
En dehors de leur origine embryonnaire, HAEC ont d'autres propriétés intrinsèques qui les rendent adaptés à différentes applications cliniques, telles que la sécrétion de molécules anti-inflammatoires et antibactériennes10,11, facteurs de croissance et la libération de cytokine12, aucune formation de tératomes quand ils sont transplantés dans des souris immunodéficientes en contraste avec HPSC2, et la tolérance immunologique parce qu'ils expriment HLA-G, qui diminue le risque de rejet après transplantation13.
Cependant, les rapports précédents ont supposé que l'amnion humain est une membrane homogène, sans considérer qu'il peut être anatomiquement et physiologiquement divisé en trois régions : placentaire (l'amnion qui couvre le basalis de cidua),ombilical (la partie qui enveloppe le cordon ombilical), et réfléchi (le reste de la membrane non attachée au placenta)14. Il a été démontré que les régions placentales et réfléchies de l'amnion présentent des différences dans la morphologie, l'activité mitochondriale, la détection des espèces réactives d'oxygène15, l'expression miRNA16, et l'activation des voies de signalisation17. Ces résultats suggèrent que l'amnion humain est intégré par une population hétérogène avec des fonctionnalités différentes qui devraient être considérées pour d'autres études menées dans des modèles in situ ou in vitro. Alors que d'autres laboratoires ont conçu des protocoles pour l'isolement de HAEC de toute la membrane, notre laboratoire a établi un protocole pour isoler, culturer et caractériser les cellules de différentes régions anatomiques.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>55 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>12430054</td>
			<td>Supplemented with high glucose and HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Ambion</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>0.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonic stem-cell FBS, qualified</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>10439024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution (sodium chloride 0.9%)</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>with conical bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 &#181;l, 200 &#181;l and 10 &#181;l.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton gauzes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical gloves</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Pipet Filler/Dispenser</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile beakers of 500 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic cutting board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile stainless steel container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tray</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>MaCSmix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies and Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Antibody ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-cadherin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td>RRID:AB_3975</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KI67</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>23900</td>
			<td>RRID:AB_627859)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NANOG</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>500-P236</td>
			<td>RRID:AB_1268274</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OCT4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab19857</td>
			<td>RRID:AB_44517</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5603</td>
			<td>RRID:AB_2286686</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SSEA-4</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4755</td>
			<td>RRID:AB_1264259</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRA-1-60</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4746</td>
			<td>RRID:AB_2119059</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>RRID:AB_2534088</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11036</td>
			<td>RRID:AB_10563566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunel Assay Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>66110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro culture of epithelial cells from different anatomical regions of the human amniotic membrane

Plusieurs protocoles ont été rapportés dans la littérature pour l'isolement et la culture des cellules épithéliales amniotiques humaines (HAEC). Cependant, ceux-ci supposent que l'épithélium amniotique est une couche homogène. L'amnion humain peut être divisé en trois régions anatomiques : réfléchie, placentaire et ombilicale. Chaque région a des rôles physiologiques différents, tels que dans des conditions pathologiques. Ici, nous décrivons un protocole pour disséquer le tissu humain d'amnion dans trois sections et le maintenir in vitro. Dans la culture, les cellules dérivées de l'amnion réfléchi ont montré une morphologie cuboïde, alors que les cellules des régions placentaires et ombilicales étaient squamous. Néanmoins, toutes les cellules obtenues ont un phénotype épithélial, démontré par l'immunodétection de l'E-cadherin. Ainsi, étant donné que les régions placentales et réfléchies in situ diffèrent dans les composants cellulaires et les fonctions moléculaires, il peut être nécessaire que les études in vitro tiennent compte de ces différences, car elles pourraient avoir des implications physiologiques pour l'utilisation de l'AOHC dans biomédecine et l'application prometteuse de ces cellules en médecine régénérative.

HAEC ont été isolés de chacune des trois régions anatomiques de la membrane amniotique et individuellement cultivés in vitro. Après 48 h de culture, les cellules avec un phénotype épithélial ont adhéré à la surface de la plaque, bien que le milieu ait également contenu des débris de cellules et des cellules flottantes, qui ont été enlevés une fois que le milieu a été changé (figure 3).
Pendant le traitement de la culture primaire (passage zéro...

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In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

Ce protocole décrit l'isolement des cellules épithéliales de différentes régions anatomiques de la membrane amniotique humaine pour déterminer leur hétérogénéité et leurs propriétés fonctionnelles pour l'application possible dans les modèles cliniques et physiopathologiques.

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...

Ce protocole peut aider à répondre à des questions clés sur l’hétérogénéité et les propriétés fonctionnelles des cellules épithéliales amniotiques humaines isolées de la membrane amniotique. Tandis que les protocoles précédents ont isolé des cellules de la membrane co-amniotique sans discerner entre les régions, notre protocole permet la culture de la population cellulaire isolée de trois régions anatomiques distinctes. Pour séparer la membrane amniotique par région, dans un cabinet de biosécurité dans des conditions stériles, identifier l’amnion ombilical enveloppant le cordon ombilical, l’amnion placentaire couvrant la decidua basalis, et la région réfléchie, qui est considérée comme le reste de l’amnion qui n’est pas attaché au placenta.Pour disséquer la région d’amnion ombilical, utilisez des forceps disséquants pour tenir la partie de la membrane d’amnion qui recouvre la jonction du placenta et du cordon ombilical, et utilisez un scalpel pour disséquer la région qui entoure le cordon, tout en s’étendant pour séparer la région de la chorion. Ensuite, déposez le tissu séparé dans un bécher étiqueté avec 100 millilitres de solution saline. Pour disséquer la région placentaire d’amnion, utilisez une gaze stérile de coton pour enlever les caillots sanguins de la surface de la chorion/amnion qui recouvre le placenta.Et utilisez des forceps disséquants pour saisir la membrane à la frontière entre le placenta et la région réfléchie. Utilisez un scalpel pour couper le long de la circonférence du placenta et séparer l’amnion placentaire de la chorion, en prenant soin de ne pas couper les vaisseaux du placenta. Placez le tissu séparé dans un autre bécher étiqueté avec 300 millilitres de solution saline.Et séparer le reste de la membrane amniotique qui n’est pas attachée au placenta de la chorion. Ensuite, placez la région réfléchie dans un autre bécher étiqueté avec 300 millilitres de solution saline. Pour laver les membranes, utilisez des pinces à épiler pour les placer sur une surface stérile afin de pouvoir jeter la solution saline de chaque contenant de tissu.Remettre les membranes dans le récipient et ajouter 100 millilitres de solution saline fraîche à la région ombilicale et 300 millilitres de solution saline fraîche aux régions placentaires et réfléchies. Utilisez des forceps disséquants pour remuer les membranes pour éliminer tout résidu de sang et placer les membranes sur la surface stérile pour être en mesure de jeter les solutions salines. Ensuite, lavez les membranes au moins deux fois de plus, comme nous venons de le démontrer, jusqu’à ce que les tissus soient translucides.Pour la digestion enzymatique des différentes régions de membrane amniotique, coupez les régions réfléchies et placentaires en deux ou trois fragments. Et placez les fragments et la région ombilicale dans des tubes de centrifugeuse individuels de 50 millilitres. Ajouter 20 millilitres de trypsine-EDTA de 0,5 % à chaque tube de fragments de tissus de la région réfléchie et placentaire et cinq millilitres de trypsine-EDTA de 0,5 % au tube contenant le tissu de la région ombilicale.Secouez doucement les tubes pendant 30 secondes. Placez ensuite les membranes sur une surface stérile, en jetant la solution trypsine-EDTA et remplacez-la par 30 millilitres de trypsine-EDTA fraîche de 0,5 % pour les fragments de tissus de la région réfléchie et placentaire et 15 millilitres de trypsine-EDTA frais de 0,5 % pour le tissu de la région ombilicale. Placez ensuite les tubes dans un rotateur à l’intérieur d’un incubateur pour une rotation de 40 minutes à 20 rotations par minute à 37 degrés Celsius.À la fin de l’incubation, transférer tout le volume de la solution cellulaire dans de nouveaux tubes coniques. Et ajouter deux fois le volume de 37 degrés Celsius cellules humaines AE moyen à chaque tube sur la glace. Digérer les restes de fragments de tissu dans les tubes d’origine avec frais 0,5%trypsine-EDTA, comme vient de le démontrer.À la fin de la deuxième digestion, utilisez une paire de forceps disséquants pour tenir une extrémité de la partie amnion et une deuxième paire de forceps disséquants pour presser le long du tissu restant pour enlever toutes les rangées de cellules épithéliales qui ne se sont pas complètement décollées pendant les périodes d’incubation précédentes. Ensuite, retirez les membranes pour pouvoir transférer la deuxième solution de digestion à un deuxième ensemble de tubes de centrifugeuse. Et inactiver les enzymes de digestion avec deux fois le volume de 37 degrés Celsius frais milieu cellulaire humain AE sur la glace.Pour l’isolement cellulaire de l’AE humaine, sédimenter les cellules par centrifugation. Et resuspendez la pastille dans chaque tube avec 10 millilitres de milieu frais de cellule humaine AE de 37 degrés Celsius. Tirez chaque paire de digestions dans un seul tube et filtrez les suspensions à travers des passoires de 100 micromètres pour enlever les débris de matrice extracellulaire.Après comptage, ensemencer les cellules humaines d’AE de chacune des trois régions en plaques individuelles de 100 millimètres à une concentration de trois fois 10 à la quatrième cellule par centimètre au carré dans le milieu cellulaire humain d’AE de 37 degrés Celsius, complétée par 10 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance épidermique humain. Ensuite, incuber les cultures à 37 degrés Celsius dans des conditions normoxiques dans un incubateur humidifié jusqu’à l’analyse en aval de l’intérêt. Après 48 heures de culture, les cellules AE humaines avec un phénotype épithélial adhèrent à la surface de la plaque, tandis que le supernatant contient des débris cellulaires et des cellules flottantes qui peuvent être enlevées une fois que le milieu est changé.Il est conseillé de jeter les cultures et de traiter une autre membrane en identifiant la présence de contamination bactérienne, d’érythrocytes excessifs dus à un lavage insuffisant des membranes, de cellules déficientes ou non héherentes, ou de cellules ayant une morphologie fibroblaste. La morphologie cellulaire de l’AE humain dépend de l’origine des cellules, car les cellules de la zone réfléchie démontrent une morphologie cuboïde et se développent dans un monocouche pavé, et les cellules des régions placentaires et ombilicales sont plus plates et squameuses. L’immunofluorescence contre l’E-cadhérine révèle que les cultures primaires et les sous-cultures maintiennent leur phénotype épithélial, suggérant qu’il n’y a pas de contamination d’un autre type de cellule.En outre, les cellules sont viables, comme en témoigne leur expression du marqueur de prolifération Ki-67. Bien que les sous-populations de l’amnion diffèrent dans leur morphologie et leur fonction, l’expression et la présence du noyau des facteurs de pluripotence ne changent pas dans les cellules humaines d’AE dérivées des régions placentaires et réfléchies. Puisque les cellules épithéliales amniotiques humaines sont une source possible de cellules souches pluripotentes, nous pouvons les défier par une ligne de protocoles de définition spécifiques pour élucider si ces cellules de chaque région ont des potentiels différents.Avant un protocole commencé, passez en revue les antécédents médicaux du patient pour s’assurer que le tissu ne présente aucune caractéristique microbiologique de l’infection.

Research

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Developmental Biology

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