Name: in vitro culture of epithelial cells from different anatomical regions of the human amniotic membrane
Uploaded: 2019-11-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane at JoVE.com

Unsere Forschung wurde durch Stipendien des Instituto Nacional de Perinatologa de México (21041 und 21081) und CONACYT (A1-S-8450 und 252756) unterstützt. Wir danken Jessica Gonzalez Norris und Lidia Yuriria Paredes Vivas für die technische Unterstützung.

Dieses Protokoll wurde von der Ethikkommission des Instituto Nacional de Perinatologa in Mexiko-Stadt (Registernummer 212250-21041) gebilligt. Alle in diesen Studien durchgeführten Verfahren entsprachen den ethischen Standards des Instituto Nacional de Perinatologa, der Erklärung von Helsinki und den Leitlinien des offiziellen mexikanischen Standards des Gesundheitsministeriums.
1. Vorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie eine Lösung von 1x PBS mit EDTA vor. Fügen Sie dazu 500 l 0,5 M EDTA-Best...

<ol>
	<li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li><li>Garcia-Lopez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amniotic+epithelium+(HAE)+as+a+possible+source+of+stem+cells+(SC).">Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC).</a> Gaceta Medica de Mexico. 151 (1), 66-74 (2015).</li><li>Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Human+Amnion+Epithelial+Cells+According+to+Current+Good+Manufacturing+Procedures.">Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).</li><li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amnion+epithelial+cell+isolation+and+characterization+for+clinical+use.">Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).</li><li>Garcia-Castro, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+Pluripotency+in+Human+Amniotic+Epithelial+Cells+and+Their+Differentiation+to+Progenitor+of+Cortical+Neurons.">Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons.</a> PLoS One. 10 (12), 0146082 (2015).</li><li>Garcia-Lopez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+markers+in+tissue+and+cultivated+cells+in+vitro+of+different+regions+of+human+amniotic+epithelium.">Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium.</a> Experimental Cell Research. 375 (1), 31-41 (2019).</li><li>Yang, P. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-143+regulation+of+prostaglandin-endoperoxidase+synthase+2+in+the+amnion:+implications+for+human+parturition+at+term.">miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term.</a> PLoS One. 6 (9), 24131 (2011).</li><li>Han, Y. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+network+crosstalk+in+human+pluripotent+cells:+a+Smad2/3-regulated+switch+that+controls+the+balance+between+self-renewal+and+differentiation.">Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 312-326 (2012).</li><li>Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Focal+Adhesion+Kinase+Signaling+by+Integrin+alpha6beta1+Supports+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Self-Renewal.">Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal.</a> Stem Cells. 34 (7), 1753-1764 (2016).</li><li>Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+regional+distribution+of+aquaporins+in+amnion+of+normal+and+gestational+diabetic+pregnancies.">Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies.</a> Physiological Reports. 3 (3), 12320 (2015).</li><li>Avila-Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amniotic+epithelial+cells+as+feeder+layer+to+derive+and+maintain+human+embryonic+stem+cells+from+poor-quality+embryos.">Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos.</a> Stem Cell Research. 15 (2), 322-324 (2015).</li></ol>

Wir haben ein neues Protokoll implementiert, um HAEC von Termmembranen zu isolieren. Es unterscheidet sich von früheren Berichten dadurch, dass jede Membran vor der Isolierung in ihre drei anatomischen Bereiche unterteilt wurde, um Zellen von jedem zu analysieren.
Einer der kritischsten Schritte im Protokoll ist das Waschen der Membran, um alle Blutgerinnsel zu entfernen, da sie die Aktivität von Trypsin bei der Trennung der Epithelzellen stören können. Wenn dieser Schritt nicht ordnungsge...

Menschliche Fruchtiotische Epithelzellen (HAEC) entstehen in den frühen Stadien der embryonalen Entwicklung, etwa acht Tage nach der Befruchtung. Sie entstehen aus einer Population von Plattenepithelzellen des Epiblasts, die sich aus der innersten Schicht der Fruchtwassermembran1ableiten. So gelten HAEC als Reste pluripotenter Zellen aus dem Epiblast, die das Potenzial haben, sich in die drei Keimschichten desEmbryos 2zu differenzieren. In den letzten zehn Jahren haben verschiedene Forschungsgruppen Methoden entwickelt, um diese Zellen aus der Fruchtwassermembran zum Term der Trächtigkeit zu isolieren, um ihre mutmaßlichen pluripotenzbedingten Eigenschaften in einem Kulturmodell in vitro3,4zu charakterisieren.
Dementsprechend wurde festgestellt, dass HAEC-Merkmale, die für humane pluripotente Stammzellen (HPSC) charakteristisch sind, wie die Oberflächenantigene SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; der Kern der Pluripotenz-Transkriptionsfaktoren OCT4, SOX2 und NANOG; und der Proliferationsmarker KI67, was darauf hindeutet, dass sie sich selbsterneuern5,6,7. Darüber hinaus wurden diese Zellen mit Differenzierungsprotokollen herausgefordert, um Zellen positiv für linienspezifische Marker der drei Keimschichten (Ektoderm, Mesoderm und Endoderm)4,5,8, sowie in Tiermodellen menschlicher Krankheiten zu erhalten. Schließlich, HAEC Express E-Cadherin, die zeigen, dass sie eine epitheliale Natur ähnlich wie die HPSC5,9behalten.
Abgesehen von ihrem embryonalen Ursprung haben HAEC andere intrinsische Eigenschaften, die sie für verschiedene klinische Anwendungen geeignet machen, wie die Sekretion von entzündungshemmenden und antibakteriellen Molekülen10,11, Wachstumsfaktoren und Zytokinfreisetzung12, keine Bildung von Teratomen, wenn sie in immundefizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizide Mäuse im Gegensatz zu HPSC2transplantiert werden, und immunologische Toleranz, weil sie HLA-G ausdrücken, was das Risiko der Abstoßung nach Transplantation13.
Frühere Berichte gingen jedoch davon aus, dass das menschliche Amnion eine homogene Membran ist, ohne zu berücksichtigen, dass es anatomisch und physiologisch in drei Regionen unterteilt werden kann: Plazenta (das Amnion, das die Decidua basalisbedeckt), Nabel (der Teil, der die Nabelschnur umschließt) und reflektiert (der Rest der Membran nicht an der Plazenta befestigt)14. Es wurde gezeigt, dass die Plazenta- und reflektierten Regionen des Amnion Unterschiede in der Morphologie, mitochondrialen Aktivität, Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies15, miRNA-Expression16und Aktivierung von Signalwegen17zeigen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das menschliche Amnion von einer heterogenen Population mit unterschiedlicher Funktionalität integriert wird, die für weitere Studien in In-situ- oder In-vitro-Modellen in Betracht gezogen werden sollte. Während andere Laboratorien Protokolle für die Isolierung von HAEC von der gesamten Membran entwickelt haben, hat unser Labor ein Protokoll zur Isolierung, Kultur und Charakterisierung von Zellen aus verschiedenen anatomischen Regionen erstellt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>55 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>12430054</td>
			<td>Supplemented with high glucose and HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Ambion</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>0.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonic stem-cell FBS, qualified</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>10439024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution (sodium chloride 0.9%)</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>with conical bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 &#181;l, 200 &#181;l and 10 &#181;l.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton gauzes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical gloves</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Pipet Filler/Dispenser</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile beakers of 500 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic cutting board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile stainless steel container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tray</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>MaCSmix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies and Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Antibody ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-cadherin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td>RRID:AB_3975</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KI67</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>23900</td>
			<td>RRID:AB_627859)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NANOG</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>500-P236</td>
			<td>RRID:AB_1268274</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OCT4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab19857</td>
			<td>RRID:AB_44517</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5603</td>
			<td>RRID:AB_2286686</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SSEA-4</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4755</td>
			<td>RRID:AB_1264259</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRA-1-60</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4746</td>
			<td>RRID:AB_2119059</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>RRID:AB_2534088</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11036</td>
			<td>RRID:AB_10563566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunel Assay Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>66110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro culture of epithelial cells from different anatomical regions of the human amniotic membrane

In der Literatur wurden mehrere Protokolle zur Isolierung und Kultur menschlicher Fruchtwasserepithelzellen (HAEC) berichtet. Diese gehen jedoch davon aus, dass es sich bei dem Fruchtioziumepithel um eine homogene Schicht handelt. Das menschliche Amnion kann in drei anatomische Regionen unterteilt werden: reflektiert, Plazenta und Nabel. Jede Region hat unterschiedliche physiologische Rollen, z. B. in pathologischen Bedingungen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um menschliches Amniongewebe in drei Abschnitten zu sezieren und in vitro zu pflegen. In der Kultur zeigten Zellen, die aus dem reflektierten Amnion abgeleitet wurden, eine quakodeale Morphologie, während Zellen aus Plazenta- und Nabelregionen plattenförmig waren. Nichtsdestotrotz haben alle erhaltenen Zellen einen epitheliale Phänotyp, der durch die Immundetektion von E-Cadherin nachgewiesen wird. Da sich die Plazenta- und reflektierten Regionen vor Ort in zellulären Komponenten und molekularen Funktionen unterscheiden, kann es daher für In-vitro-Studien notwendig sein, diese Unterschiede zu berücksichtigen, da sie physiologische Auswirkungen auf die Verwendung von HAEC in biomedizinische Forschung und die vielversprechende Anwendung dieser Zellen in der regenerativen Medizin.

HAEC wurden aus jedem der drei anatomischen Regionen der Fruchtwassermembran isoliert und in vitro einzeln kultiviert. Nach 48 h Kultur hafteten Zellen mit einem epithelialen Phänotyp an der Oberfläche der Platte, obwohl die Medien auch Zellablagerungen und schwimmende Zellen enthielten, die nach der Änderung des Mediums entfernt wurden(Abbildung 3).
Während der Verarbeitung der Primärkultur (Durchgang Null, P0) können einige Komplikationen auftreten, die di...

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In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Epithelzellen aus verschiedenen anatomischen Regionen der menschlichen Fruchtwassermembran, um deren Heterogenität und funktionelle Eigenschaften für eine mögliche Anwendung in klinischen und physiopathologischen Modellen zu bestimmen.

In Vitro Kultur von Epithelzellen aus verschiedenen anatomischen Regionen der menschlichen Amnionmembran

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...

Dieses Protokoll kann helfen, wichtige Fragen über Heterogenität und funktionelle Eigenschaften menschlicher Fruchtieinerepithelzellen zu beantworten, die aus der Fruchtwassermembran isoliert sind. Während frühere Protokolle Zellen aus der ko-amniotischen Membran isolierten, ohne zwischen den Regionen zu unterscheiden, erlaubt unser Protokoll die Kultur der Zellpopulation, die aus drei verschiedenen anatomischen Regionen isoliert ist. Um die Fruchtwassermembran nach Region zu trennen, in einem Biosicherheitsschrank unter sterilen Bedingungen, identifizieren Sie das Nabelam, das die Nabelschnur umhüllt, die Plazenta-Amnion, die die Decidua basalis bedeckt, und die reflektierte Region, die als der Rest des Amnions betrachtet wird, das nicht an der Plazenta befestigt ist.Um die Nabelamnionregion zu sezieren, verwenden Sie Sezieren von Zangen, um den Teil der Amnionmembran zu halten, der die Kreuzung der Plazenta und der Nabelschnur bedeckt, und verwenden Sie ein Skalpell, um die Region zu sezieren, die die Schnur umgibt, während sie sich streckt, um den Bereich von der Chorion zu trennen. Dann legen Sie das getrennte Gewebe in einem markierten Becher mit 100 Milliliter naline Lösung ab. Um die Plazenta-Amnion-Region zu sezieren, verwenden Sie eine sterile Baumwollgaze, um die Blutgerinnsel von der Oberfläche des Chorions/Amnions zu entfernen, das die Plazenta bedeckt.Und verwenden Sie sezierende Zangen, um die Membran an der Grenze zwischen der Plazenta und der reflektierten Region zu erfassen. Verwenden Sie ein Skalpell entlang des Umfangs der Plazenta zu schneiden und trennen Sie die Plazenta Amnion von der Chorion, achten Sie darauf, keine Gefäße aus der Plazenta zu schneiden. Legen Sie das abgetrennte Gewebe in einen anderen beschrifteten Becher mit 300 Milliliter neiner Salinelösung.Und trennen Sie den Rest der Fruchtwassermembran, die nicht an der Plazenta befestigt ist, von der Chorion. Legen Sie dann die reflektierte Region in einen anderen beschrifteten Becher mit 300 Milliliter naline Lösung. Um die Membranen zu waschen, verwenden Sie eine Pinzette, um sie auf eine sterile Oberfläche zu legen, um die Saline-Lösung aus jedem Behälter mit Gewebe zu entsorgen.Legen Sie die Membranen wieder in den Behälter und fügen Sie 100 Milliliter frische Salinelösung in die Nabelregion und 300 Milliliter frischer Salinelösung in die Plazenta- und reflektierten Regionen. Verwenden Sie Sezieren der Zangen, um die Membranen zu rühren, um alle Blutrückstände zu entfernen und legen Sie die Membranen auf die sterile Oberfläche, um die Saline-Lösungen zu entsorgen. Dann waschen Sie die Membranen mindestens zwei weitere Male, wie gerade gezeigt, bis das Gewebe durchscheinend ist.Zur enzymatischen Verdauung der verschiedenen Fruchtwassermembranregionen die reflektierten und plazentten Regionen in zwei oder drei Fragmente schneiden. Und legen Sie die Fragmente und den Nabelbereich in einzelne 50-Milliliter-Zentrifugenröhren. Fügen Sie 20 Milliliter 0,5%Trypsin-EDTA zu jeder Röhre von reflektierten und plazentaförmigen Gewebefragmenten und fünf Milliliter 0,5%Trypsin-EDTA in die Röhre, die das Nabelbereichsgewebe enthält.Schütteln Sie die Rohre 30 Sekunden lang sanft. Dann legen Sie die Membranen auf eine sterile Oberfläche, entsorgen Sie die Trypsin-EDTA-Lösung und ersetzen Sie sie durch 30 Milliliter frische0,5%Trypsin-EDTA für die reflektierten und plazentaförmigen Gewebefragmente und 15 Milliliter frische0,5%Trypsin-EDTA für das Nabelbereichsgewebe. Legen Sie die Rohre dann in einem Rotator in einem Inkubator für eine 40-minütige Drehung bei 20 Umdrehungen pro Minute bei 37 Grad Celsius.Übertragen Sie am Ende der Inkubation das gesamte Volumen der Zelllösung in neue konische Röhren. Und fügen Sie das Zweifache des Volumens von 37-Grad-Celsius menschlichen AE-Zellen medium zu jeder Röhre auf Eis hinzu. Verdauen Sie alle übrig gebliebenen Gewebefragmente in den Originalröhren mit frischen 0,5%Trypsin-EDTA, wie gerade gezeigt.Verwenden Sie am Ende der zweiten Verdauung ein Paar sezierender Zangen, um ein Ende des Amnion-Anteils zu halten, und ein zweites Paar sezierender Zangen, um entlang des verbleibenden Gewebes zu quetschen, um alle Reihen von Epithelzellen zu entfernen, die sich während der vorherigen Inkubationsperioden nicht vollständig abblätterten. Entfernen Sie dann die Membranen, um die zweite Verdauungslösung auf einen zweiten Satz Zentrifugenrohre übertragen zu können. Und inaktivieren Sie die Verdauungsenzyme mit dem zweifachen Volumen des frischen 37-Grad-Celsius-Human-AE-Zellmediums auf Eis.Für die Isolierung menschlicher AE-Zellen, SedimentdieZellen durch Zentrifugation. Und setzen Sie das Pellet in jedem Rohr mit 10 Milliliter frisches 37-Grad-Celsius menschliches AE-Zellmedium wieder auf. Ziehen Sie jedes Paar Verdauungsteile in ein einziges Rohr und filtern Sie die Suspensionen durch 100-Mikrometer-Siebe, um extrazelluläre Matrix-Trümmer zu entfernen.Nach dem Zählen säen Sie die menschlichen AE-Zellen aus jeder der drei Regionen in einzelne 100-Millimeter-Platten mit einer dreimal 10 bis vierten Zelle pro Zentimeter quadratischer Konzentration in 37-Grad-Celsius-Human-AE-Zellmedium, ergänzt mit 10 Nanogramm pro Milliliter des menschlichen epidermalen Wachstumsfaktors. Dann inkubieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius unter normoxischen Bedingungen in einem befeuchteten Inkubator bis zur nachgelagerten Analyse des Interesses. Nach 48 Stunden Kultur haften menschliche AE-Zellen mit einem epitheliale phänotypischen Anhaftungsfraktions, während der Überstand Zellablagerungen und schwimmende Zellen enthält, die entfernt werden können, sobald das Medium gewechselt wird.Es ist ratsam, die Kulturen zu verwerfen und eine andere Membran zu verarbeiten, wenn das Vorhandensein von bakteriellen Kontaminationen, übermäßigen Erythrozyten aufgrund unzureichender Waschen der Membranen, mangelhaftoder nicht haftende Zellen oder Zellen mit einer Fibroblastenmorphologie identifiziert wird. Die Morphologie menschlicher AE-Zellen hängt vom Ursprung der Zellen ab, da Zellen aus der reflektierten Zone eine quakotale Morphologie zeigen und in einer gepflasterten Monoschicht wachsen, und Zellen aus den Plazenta- und Nabelregionen flacher und plattenförmiger sind. Die Immunfluoreszenz gegen E-Cadherin zeigt, dass die Primärkulturen und Subkulturen ihren epitheliale Phänotyp beibehalten, was darauf hindeutet, dass es keine Kontamination eines anderen Zelltyps gibt.Darüber hinaus sind die Zellen lebensfähig, wie ihre Expression des Ki-67 Proliferationsmarkers belegt. Obwohl sich die Subpopulationen aus dem Amnion in ihrer Morphologie und Funktion unterscheiden, ändert sich der Ausdruck und die Präsenz des Kerns der Pluripotenzfaktoren in menschlichen AE-Zellen, die aus der Plazenta und reflektierten Regionen abgeleitet sind, nicht. Da menschliche Fruchtiozienepithelzellen eine mögliche Quelle pluripotenter Stammzellen sind, können wir sie durch eine Reihe spezifischer Definitionsprotokolle herausfordern, um zu klären, ob diese Zellen aus jeder Region unterschiedliche Potenziale haben.Überprüfen Sie vor einem begonnenen Protokoll die Krankengeschichte des Patienten, um sicherzustellen, dass das Gewebe keine mikrobiologischen Merkmale einer Infektion aufweist.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Entwicklungsbiologie

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