Name: in vitro culture of epithelial cells from different anatomical regions of the human amniotic membrane
Uploaded: 2019-11-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane at JoVE.com

המחקר שלנו נתמך על ידי מענקים ממכון הלאומי לחקר הנאסיונאל דה מקסיקו (21041 ו-21081) ו-CONACYT (A1-S-8450 ו-252756). אנו מודים לג גונזלס נוריס ו לידיה יוריה Paredes Vivas לתמיכה טכנית.

פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה האתית של המכון הלאומי דה פראטולוגיניה במקסיקו סיטי (רישום מספר 212250-21041). כל ההליכים שבוצעו במחקרים אלה היו בהתאם לסטנדרטים האתיים של המכון הלאומי לפראינואטולוגיה, הצהרת הלסינקי, וההנחיות שנקבעו בתקן המקסיקני הרשמי של משרד הבריאות.
1. הכנה
<ol><li>...

<ol>
	<li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li><li>Garcia-Lopez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amniotic+epithelium+(HAE)+as+a+possible+source+of+stem+cells+(SC).">Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC).</a> Gaceta Medica de Mexico. 151 (1), 66-74 (2015).</li><li>Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Human+Amnion+Epithelial+Cells+According+to+Current+Good+Manufacturing+Procedures.">Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).</li><li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amnion+epithelial+cell+isolation+and+characterization+for+clinical+use.">Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).</li><li>Garcia-Castro, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+Pluripotency+in+Human+Amniotic+Epithelial+Cells+and+Their+Differentiation+to+Progenitor+of+Cortical+Neurons.">Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons.</a> PLoS One. 10 (12), 0146082 (2015).</li><li>Garcia-Lopez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+markers+in+tissue+and+cultivated+cells+in+vitro+of+different+regions+of+human+amniotic+epithelium.">Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium.</a> Experimental Cell Research. 375 (1), 31-41 (2019).</li><li>Yang, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+characterization+of+human+amniotic+epithelial+cells+in+a+serum-free+system+and+their+safety+evaluation.">Biological characterization of human amniotic epithelial cells in a serum-free system and their safety evaluation.</a> Acta Pharmacological Sinica. 39 (8), 1305-1316 (2018).</li><li>Zou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA32+silences+WWP2+expression+to+maintain+the+pluripotency+of+human+amniotic+epithelial+stem+cells+and+beta+isletlike+cell+differentiation.">MicroRNA32 silences WWP2 expression to maintain the pluripotency of human amniotic epithelial stem cells and beta isletlike cell differentiation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 41 (4), 1983-1991 (2018).</li><li>Avila-Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+ephemeral+human+pluripotent+state.">Capturing the ephemeral human pluripotent state.</a> Developmental Dynamics. 245 (7), 762-773 (2016).</li><li>Niknejad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+amniotic+membrane+for+potential+use+in+tissue+engineering.">Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering.</a> European Cells &amp; Materials. 15, 88-99 (2008).</li><li>Miki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+characteristics+and+the+therapeutic+potential+of+amniotic+epithelial+cells.">Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 80 (4), 13003 (2018).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+proliferation,+migration+and+angiogenic+properties+of+human+amniotic+epithelial+and+mesenchymal+stem+cells+and+their+effects+on+endothelial+cells.">Comparison of the proliferation, migration and angiogenic properties of human amniotic epithelial and mesenchymal stem cells and their effects on endothelial cells.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 918-926 (2017).</li><li>Hammer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amnion+epithelial+cells,+in+contrast+to+trophoblast+cells,+express+all+classical+HLA+class+I+molecules+together+with+HLA-G.">Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I molecules together with HLA-G.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 37 (2), 161-171 (1997).</li><li>Benirschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+Pathology+of+the+Placental+Membranes.">Anatomy and Pathology of the Placental Membranes.</a> Pathology of the Human Placenta. , 268-318 (1995).</li><li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+metabolic+activity+in+placental+and+reflected+regions+of+the+human+amniotic+membrane.">Different metabolic activity in placental and reflected regions of the human amniotic membrane.</a> Placenta. 36 (11), 1329-1332 (2015).</li><li>Kim, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-143+regulation+of+prostaglandin-endoperoxidase+synthase+2+in+the+amnion:+implications+for+human+parturition+at+term.">miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term.</a> PLoS One. 6 (9), 24131 (2011).</li><li>Han, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+gene+expression+profiling:+novel+evidence+for+biological+heterogeneity+of+the+human+amnion.">Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heterogeneity of the human amnion.</a> Biology of Reproduction. 79 (5), 954-961 (2008).</li><li>Alcaraz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+TGF-beta+induces+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+human+amniotic+epithelial+cells.">Autocrine TGF-beta induces epithelial to mesenchymal transition in human amniotic epithelial cells.</a> Cell Transplantation. 22 (8), 1351-1367 (2013).</li><li>Canciello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+prevents+epithelial-mesenchymal+transition+of+ovine+amniotic+epithelial+cells+and+enhances+their+immunomodulatory+properties.">Progesterone prevents epithelial-mesenchymal transition of ovine amniotic epithelial cells and enhances their immunomodulatory properties.</a> Scientific Reports. 7 (1), 3761 (2017).</li><li>Canciello, A., Greco, L., Russo, V., Barboni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+Epithelial+Cell+Culture.">Amniotic Epithelial Cell Culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1817, 67-78 (2018).</li><li>Singh, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+network+crosstalk+in+human+pluripotent+cells:+a+Smad2/3-regulated+switch+that+controls+the+balance+between+self-renewal+and+differentiation.">Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 312-326 (2012).</li><li>Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Focal+Adhesion+Kinase+Signaling+by+Integrin+alpha6beta1+Supports+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Self-Renewal.">Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal.</a> Stem Cells. 34 (7), 1753-1764 (2016).</li><li>Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+regional+distribution+of+aquaporins+in+amnion+of+normal+and+gestational+diabetic+pregnancies.">Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies.</a> Physiological Reports. 3 (3), 12320 (2015).</li><li>Avila-Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amniotic+epithelial+cells+as+feeder+layer+to+derive+and+maintain+human+embryonic+stem+cells+from+poor-quality+embryos.">Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos.</a> Stem Cell Research. 15 (2), 322-324 (2015).</li></ol>

אנו מיושמים פרוטוקול חדש כדי לבודד HAEC מקרום המונח. הוא שונה מדיווחים קודמים בכך שכל ממברנה חולקה לשלושת האזורים האנטומיים שלה לפני בידוד כדי לנתח תאים מכל אחד מהם.
אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הוא רחיצת הקרום כדי להסיר את כל קרישי הדם, כי הם יכולים להפריע לפעילות של ט...

תאים האפיתל השפיר האדם (HAEC) מקורם בשלבים המוקדמים של התפתחות עובריים, בסביבות שמונה ימים הפריה. הם נובעים מאוכלוסייה של תאים אפיתל הקשקש של אפיפיצוץ שנובעים השכבה הפנימית ביותר של קרום השפיר1. כך, HAEC נחשבים שאריות של תאים בעלי עוצמה מאפיפיצוץ כי יש פוטנציאל להבדיל לתוך שלוש שכבות הנבט של העובר2. בעשור האחרון פיתחו קבוצות מחקר מגוונות שיטות לבידוד תאים אלה מקרום השפיר בתקופת ההיריון על מנת לאפיין את המאפיינים הקשורים לשוערת פלאוריאון שלהם במודל תרבות מחוץ לתחום3,4.
בהתאם, הוא נמצא כי התכונות התכונות HAEC מאפיין של תאי גזע האדם pluriפוטנטי (HPSC), כגון אנטיגנים פני השטח SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; הליבה של מרכיבי תמלול שעתוק OCT4, SOX2, ו-NANOG; ומסמן ההתפשטות KI67, הרומז שהם מחדשים את עצמם5,6,7. יתר על כן, תאים אלה כבר מאותגרים באמצעות פרוטוקולי בידול להשיג תאים חיוביים עבור סמנים ספציפיים שושלת היוחסין של שלוש שכבות הנבט (העור, מזועור, ואנדועור)4,5,8, כמו גם במודלים של בעלי חיים של מחלות אנושיות. לבסוף, haec אקספרס E-קדהרין, אשר מדגימים כי הם שומרים על טבע אפיתל בדיוק כמו hsc5,9.
מלבד המוצא העובריים, haec יש תכונות פנימיות אחרות העושות אותם מתאים ליישומים קליניים שונים, כגון הפרשה של מולקולות אנטי דלקתיות ו-אנטיבקטריאלי10,11, גורמי גדילה ושחרור ציטוקינים12, אין היווצרות של teratomas כאשר הם מושתלים לתוך עכברים לקויה בניגוד עם hpsc2, ואת הסובלנות החיסונית כי הם לבטא hla-G, אשר מקטין את הסיכון של דחייה לאחר השתלת13.
עם זאת, הדיווחים הקודמים הניחו כי המין האנושי הוא קרום הומוגנית, מבלי להתחשב בכך שהוא יכול להיות מחולק מבחינה אנטומית ופיזיולוגית לשלושה אזורים: משטחי השפיר המכסים את הדציבלים, הטבור (החלק שעוטף את חבל הטבור), ומשתקף (שאר הקרום אינו מוצמד לשליה)14. הוכח כי האזורים המשחיים ומשתקפים של השפיר על הבדלים בתצוגה מורפולוגיה, פעילות מיטוכונדריאלי, זיהוי של מינים חמצן תגובתי15, mirna ביטוי16, והפעלה של מסלולים איתות17. תוצאות אלה מרמזות על כך שהשפיר האנושי משולב על ידי אוכלוסיה הטרוגנית עם פונקציונליות שונה שיש להתייחס אליה למחקרים נוספים שבוצעו בתוך מודלים מחוץ לבית או במודלים של מבחנה. בעוד מעבדות אחרות עיצבו פרוטוקולים לבידוד של HAEC מהקרום כולו, המעבדה שלנו הקימה פרוטוקול לבידוד, תרבות, ואפיון תאים מאזורים אנטומיים שונים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>55 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>12430054</td>
			<td>Supplemented with high glucose and HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Ambion</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>0.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonic stem-cell FBS, qualified</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>10439024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution (sodium chloride 0.9%)</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>with conical bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 &#181;l, 200 &#181;l and 10 &#181;l.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton gauzes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical gloves</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Pipet Filler/Dispenser</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile beakers of 500 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic cutting board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile stainless steel container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tray</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>MaCSmix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies and Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Antibody ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-cadherin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td>RRID:AB_3975</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KI67</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>23900</td>
			<td>RRID:AB_627859)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NANOG</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>500-P236</td>
			<td>RRID:AB_1268274</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OCT4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab19857</td>
			<td>RRID:AB_44517</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5603</td>
			<td>RRID:AB_2286686</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SSEA-4</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4755</td>
			<td>RRID:AB_1264259</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRA-1-60</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4746</td>
			<td>RRID:AB_2119059</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>RRID:AB_2534088</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11036</td>
			<td>RRID:AB_10563566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunel Assay Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>66110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro culture of epithelial cells from different anatomical regions of the human amniotic membrane

מספר פרוטוקולים דווחו בספרות על הבידוד והתרבות של תאים האפיתל השפיר האדם (HAEC). עם זאת, אלה להניח כי האפיתל השפיר היא שכבה הומוגנית. ניתן לחלק את השפיר האנושית לשלושה אזורים אנטומיים: השתקפות, הפלפה והטבור. לכל אזור יש תפקידים פיזיולוגיים שונים, כמו בתנאים פתולוגיים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לנתח את. הרקמה האנושית בשלוש מחלקות ולתחזק אותה בתרבות, תאים שמקורם בשפיר משתקף על הציגו מורפולוגיה בוטאידית, בעוד תאים משני האזורים ואזורי הטבור היו קשקשיים. עם זאת, כל התאים המתקבלים יש פנוטיפ אפיתל, הפגינו על ידי זיהוי חיסוני של E-קדהרין. לפיכך, מכיוון שהאזורים השונים והמשתקפים באתרו שונים ברכיבים סלולריים ובתפקודים מולקולריים, ייתכן שיהיה צורך בלימודי מבחנה כדי לשקול הבדלים אלה, משום שיכולים להיות להם השלכות פיזיולוגיות לשימוש ב-haec ב מחקר ביו ויישום מבטיח של תאים אלה ברפואה רגנרטיבית.

HAEC היו מבודדים מכל אחד משלושת האזורים האנטומיים של קרום השפיר ומתורבת באופן אינדיבידואלי בתוך מבחנה. לאחר 48 h של התרבות, תאים עם פנוטיפים אפיתל על פני השטח של הצלחת, למרות התקשורת גם הכיל פסולת תא תאים צפים, אשר הוסרו לאחר המדיום השתנה (איור 3).
במהלך העיבוד של ?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane at JoVE.com

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של תאים אפיתל מאזורים אנטומיים שונים של קרום השפיר האנושי כדי לקבוע את התכונות הטרוגניות והפונקציונליות שלהם עבור יישום אפשרי במודלים קליניים וphysiopathological.

בתרבות מבחנה של תאים אפיתל מאזורים אנטומיים שונים של קרום הפיר האנושי

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...

פרוטוקול זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח על הטרוגניות ומאפיינים פונקציונליים של תאי אפיתל מי המפיר האנושיים מבודדים ממברנת מי המפירה. בעוד שפרוטוקולים קודמים בודדו תאים מממברנה מימר שותף מבלי להבחין בין אזורים, הפרוטוקול שלנו מאפשר את תרבות אוכלוסיית התאים המבודדת משלושה אזורים אנטומיים נפרדים. כדי להפריד את קרום מי השפיר לפי אזור, בקבינט biosafety בתנאים סטריליים, לזהות את amnion הטבור עוטף את חבל הטבור, אמניון שליה המכסה את הבסליס decidua, ואת האזור משתקף, אשר נחשב שאר amnion כי אינו מחובר שליה.כדי לנתח את אזור אמניון הטבור, השתמש במטסות ניתוח כדי להחזיק את החלק של קרום אמניון המכסה את צומת שליה ואת חבל הטבור, ולהשתמש אזמל לנתח את האזור המקיף את חבל הטבור, תוך מתיחה כדי להפריד את האזור מן chorion. לאחר מכן, להפקיד את הרקמה המופרדת בסקילר שכותרתו עם 100 מיליליטר של תמיסת מלח. כדי לנתח את אזור אמניון שליה, להשתמש גזה כותנה סטרילית כדי להסיר את קרישי הדם מפני השטח של chorion / אמניון המכסה את שליה.ולהשתמש במטסים לנתח כדי לתפוס את הממברנה על הגבול בין שליה לאזור משתקף. השתמש אזמל לחתוך לאורך היקף שליה ולהפריד את אמניון שליה מן chorion, נזהר לא לחתוך כל כלי מן שליה. מניחים את הרקמה המופרדת בסקלר אחר שכותרתו עם 300 מיליליטר של תמיסת מלח.ולהפריד את שאר קרום מי שפיר כי אינו מחובר שליה מן chorion. לאחר מכן, למקם את האזור משתקף אחר שכותרתו beaker עם 300 מיליליטר של תמיסת מלח. כדי לשטוף את הממברנות, השתמש פינצטה כדי למקם אותם על משטח סטרילי כדי להיות מסוגל להשליך את הפתרון מלוחים מכל מיכל של רקמה.מניחים את הממברנות בחזרה במיכל ומוסיפים 100 מיליליטר של תמיסת מלח טרייה לאזור הטבור ו -300 מיליליטר של תמיסת מלח טרייה לאזורי שליה ומשתקפים. השתמש מטחנים לנתח כדי לערבב את הממברנות כדי להסיר את כל שאריות הדם ולהציב את הממברנות על פני השטח סטרילי כדי להיות מסוגל להשליך את הפתרונות מלוחים. לאחר מכן, לשטוף את הממברנות לפחות עוד פעמיים, כפי שהוכח רק, עד הרקמות שקופות.לעיכול אנזימטי של אזורי הממברנה מי השפיר השונים, חותכים את האזורים המשתקפים ואת אזורי שליה לשניים או שלושה שברים. ומ מניחים את השברים ואת אזור הטבור בצינורות צנטריפוגה בודדים של 50 מיליליטר. הוסף 20 מיליליטר של 0.5% טריפסין-EDTA לכל צינור של שברי רקמת אזור משתקפים שליה וחמישה מיליליטר של 0.5% טריפסין-EDTA לצינור המכיל את רקמת אזור הטבור.לנער את הצינורות בעדינות במשך 30 שניות. לאחר מכן מניחים את הממברנות על משטח סטרילי, משליכים את פתרון טריפסין-EDTA ומחליפים אותו ב-30 מיליליטר של טריים 0.5%trypsin-EDTA עבור שברי רקמת האזור המשתקפים והשליה ו-15 מיליליטר של 0.5%טריפסין-EDTA טריים עבור רקמת האזור הטבור. ואז למקם את הצינורות בסובב בתוך אינקובטור לסיבוב של 40 דקות ב 20 סיבובים לדקה ב 37 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, להעביר את כל נפח של פתרון התא לתוך צינורות חרוט חדשים. ולהוסיף פעמיים את הנפח של 37 מעלות צלזיוס תאים אנושיים AE בינוני לכל צינור על קרח. לעכל את כל שברי רקמת שאריות בצינורות המקוריים עם טרי 0.5% trypsin-EDTA, כפי שהודגם רק.בסוף העיכול השני, השתמש בזוג מדפים מנותח כדי להחזיק קצה אחד של חלק amnion וזוג שני של מעצורי ניתוח לסחוט לאורך הרקמה הנותרת כדי להסיר את כל השורות של תאי אפיתל שלא לגמרי לקלף במהלך תקופות הדגירה הקודמות. לאחר מכן, להסיר את הממברנות כדי להיות מסוגל להעביר את פתרון העיכול השני לקבוצה שנייה של צינורות צנטריפוגה. ולהשבית את אנזימי העיכול עם נפח גדול פי שניים של מדיום AE אנושי טרי של 37 מעלות צלזיוס על קרח.לבידוד תאי AE אנושיים, מסיסים את התאים על ידי צנטריפוגה. ולתלות מחדש את גלולה בכל צינור עם 10 מיליליטר של טרי 37 מעלות צלזיוס אנושי AE תא בינוני. משוך כל זוג של עיכול לתוך צינור אחד ולסנן את המתלים דרך מסנני 100 מיקרומטר כדי להסיר את כל פסולת מטריצה חוץ תאית.לאחר הספירה, זרע את תאי AE האנושיים מכל אחד משלושת האזורים לתוך לוחות בודדים של 100 מילימטרים בשלוש פעמים 10 לתאים הרביעיים אחוזים בריבוע ריכוז ב 37 מעלות צלזיוס אנושי AE תא בינוני, בתוספת 10 ננוגרם למיליליטר של גורם הגדילה האפידרמלי האנושי. לאחר מכן, להדגים את התרבויות ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים נורמוקסיים באינקובטור לח עד ניתוח במורד הזרם של עניין. לאחר 48 שעות של תרבות, תאי AE אנושיים עם פנוטיפ אפיתל לדבוק על פני השטח של הלוח, בעוד supernatant מכיל פסולת תאים ותאים צפים שניתן להסיר לאחר המדיום משתנה.מומלץ להשליך את התרבות ולעבד קרום נוסף בעת זיהוי נוכחות של זיהום חיידקי, אריתרוציטים מוגזמים עקב שטיפה לא מספקת של הממברנות, תאים לקויים או לא עקביים, או תאים עם מורפולוגיה פיברובלסט. מורפולוגיה של תאי AE אנושיים תלויה במקור התאים, בכך שתאים מהאזור המשתקף מדגימים מורפולוגיה קובואידית וגדלים במונולייה מרוצפת, ותאים מאזורי שליה וטיבור הם מחמיאים ומוזקלים. Immunofluorescence נגד E-cadherin מגלה כי התרבויות העיקריות ותת התרבות לשמור על פנוטיפ האפיתל שלהם, מה שמרמז כי אין זיהום של סוג תא אחר.בנוסף, התאים הם קיימא, כפי שמוצג על ידי הביטוי שלהם של סמן התפשטות Ki-67. למרות שהתת-תפקודים מהעימה שונים במורפולוגיה ובתפקוד שלהם, הביטוי והנוכחות של ליבת גורמי הפלוריפוטנטיות אינם משתנים בתאי AE אנושיים הנגזרים מאזורי שליה ומשתקפים. מכיוון שתאי אפיתל מי מיון אנושיים הם מקור אפשרי לתאי גזע פלוריפוטנטיים, אנו יכולים לאתגר אותם באמצעות שורה של פרוטוקולי הגדרה ספציפיים כדי להבהר אם לתאים אלה מכל אזור יש פוטנציאל שונה.לפני פרוטוקול התחיל, לסקור את ההיסטוריה הרפואית של המטופל כדי להיות בטוח כי הרקמה מציגה שום מאפיינים מיקרוביולוגיים של זיהום.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

הראשי Endodermal אפיתל תרבית תאים מן קרום צק החלמון של עוברים יפניים שליו

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

פיתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay לאבחון תפקוד התכווצות של תאי mesenchymal שעבר אפיתל-mesenchymal מעבר

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

ייצור בקנה מידה גדולה של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם באמצעות פרוטוקול בידול מולקולה קטן המבוססת לשחזור ביותר

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

את ייצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מתאי מי שפירים עכבר באמצעות מערכת transposon

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

בידוד של עכבר רירית הרחם אפיתל סטרומה תאים עבור<em&gt; במבחנה</em&gt; Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

התכנות ראשי מי שפיר ו ממברנות התאים כדי Pluripotency בתנאים קסנו-חופשית

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

היישום של מערכת העורקים-בלוטת המין-mesonephros Explant התרבות Hematopoiesis התפתחותית

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Culturing תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית על מודל לשעבר Vivo של הממברנה של ברוך בן אנוש

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...