Name: in vitro culture of epithelial cells from different anatomical regions of the human amniotic membrane
Uploaded: 2019-11-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane at JoVE.com

私たちの研究は、インスティトゥート・ナシオナル・デ・ペリナトリオ・デ・メヒコ(21041年と21081年)とCONACYT(A1-S-8450および252756)からの助成金によって支援されました。ジェシカ・ゴンサレス・ノリスとリディア・ユーリリア・パレデス・ビヴァスのテクニカルサポートに感謝します。

このプロトコルは、メキシコシティのナシオナル・デ・ペリナトロジアの倫理委員会によって承認されました(レジストリ番号212250-21041)。これらの研究で行われたすべての手順は、ナシオナル・デ・ペリナトロジーア内科学会の倫理基準、ヘルシンキ宣言、および保健省の公式メキシコ規格に定められたガイドラインに従っていました。
1. 準備
<ol><li>EDTAで1x PBSの溶液を...

<ol>
	<li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li><li>Garcia-Lopez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amniotic+epithelium+(HAE)+as+a+possible+source+of+stem+cells+(SC).">Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC).</a> Gaceta Medica de Mexico. 151 (1), 66-74 (2015).</li><li>Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Human+Amnion+Epithelial+Cells+According+to+Current+Good+Manufacturing+Procedures.">Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).</li><li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amnion+epithelial+cell+isolation+and+characterization+for+clinical+use.">Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).</li><li>Garcia-Castro, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+Pluripotency+in+Human+Amniotic+Epithelial+Cells+and+Their+Differentiation+to+Progenitor+of+Cortical+Neurons.">Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons.</a> PLoS One. 10 (12), 0146082 (2015).</li><li>Garcia-Lopez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+markers+in+tissue+and+cultivated+cells+in+vitro+of+different+regions+of+human+amniotic+epithelium.">Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium.</a> Experimental Cell Research. 375 (1), 31-41 (2019).</li><li>Yang, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+characterization+of+human+amniotic+epithelial+cells+in+a+serum-free+system+and+their+safety+evaluation.">Biological characterization of human amniotic epithelial cells in a serum-free system and their safety evaluation.</a> Acta Pharmacological Sinica. 39 (8), 1305-1316 (2018).</li><li>Zou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA32+silences+WWP2+expression+to+maintain+the+pluripotency+of+human+amniotic+epithelial+stem+cells+and+beta+isletlike+cell+differentiation.">MicroRNA32 silences WWP2 expression to maintain the pluripotency of human amniotic epithelial stem cells and beta isletlike cell differentiation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 41 (4), 1983-1991 (2018).</li><li>Avila-Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+ephemeral+human+pluripotent+state.">Capturing the ephemeral human pluripotent state.</a> Developmental Dynamics. 245 (7), 762-773 (2016).</li><li>Niknejad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+amniotic+membrane+for+potential+use+in+tissue+engineering.">Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering.</a> European Cells &amp; Materials. 15, 88-99 (2008).</li><li>Miki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+characteristics+and+the+therapeutic+potential+of+amniotic+epithelial+cells.">Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 80 (4), 13003 (2018).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+proliferation,+migration+and+angiogenic+properties+of+human+amniotic+epithelial+and+mesenchymal+stem+cells+and+their+effects+on+endothelial+cells.">Comparison of the proliferation, migration and angiogenic properties of human amniotic epithelial and mesenchymal stem cells and their effects on endothelial cells.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 918-926 (2017).</li><li>Hammer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amnion+epithelial+cells,+in+contrast+to+trophoblast+cells,+express+all+classical+HLA+class+I+molecules+together+with+HLA-G.">Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I molecules together with HLA-G.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 37 (2), 161-171 (1997).</li><li>Benirschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+Pathology+of+the+Placental+Membranes.">Anatomy and Pathology of the Placental Membranes.</a> Pathology of the Human Placenta. , 268-318 (1995).</li><li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+metabolic+activity+in+placental+and+reflected+regions+of+the+human+amniotic+membrane.">Different metabolic activity in placental and reflected regions of the human amniotic membrane.</a> Placenta. 36 (11), 1329-1332 (2015).</li><li>Kim, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-143+regulation+of+prostaglandin-endoperoxidase+synthase+2+in+the+amnion:+implications+for+human+parturition+at+term.">miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term.</a> PLoS One. 6 (9), 24131 (2011).</li><li>Han, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+gene+expression+profiling:+novel+evidence+for+biological+heterogeneity+of+the+human+amnion.">Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heterogeneity of the human amnion.</a> Biology of Reproduction. 79 (5), 954-961 (2008).</li><li>Alcaraz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+TGF-beta+induces+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+human+amniotic+epithelial+cells.">Autocrine TGF-beta induces epithelial to mesenchymal transition in human amniotic epithelial cells.</a> Cell Transplantation. 22 (8), 1351-1367 (2013).</li><li>Canciello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+prevents+epithelial-mesenchymal+transition+of+ovine+amniotic+epithelial+cells+and+enhances+their+immunomodulatory+properties.">Progesterone prevents epithelial-mesenchymal transition of ovine amniotic epithelial cells and enhances their immunomodulatory properties.</a> Scientific Reports. 7 (1), 3761 (2017).</li><li>Canciello, A., Greco, L., Russo, V., Barboni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+Epithelial+Cell+Culture.">Amniotic Epithelial Cell Culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1817, 67-78 (2018).</li><li>Singh, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+network+crosstalk+in+human+pluripotent+cells:+a+Smad2/3-regulated+switch+that+controls+the+balance+between+self-renewal+and+differentiation.">Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 312-326 (2012).</li><li>Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Focal+Adhesion+Kinase+Signaling+by+Integrin+alpha6beta1+Supports+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Self-Renewal.">Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal.</a> Stem Cells. 34 (7), 1753-1764 (2016).</li><li>Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+regional+distribution+of+aquaporins+in+amnion+of+normal+and+gestational+diabetic+pregnancies.">Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies.</a> Physiological Reports. 3 (3), 12320 (2015).</li><li>Avila-Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amniotic+epithelial+cells+as+feeder+layer+to+derive+and+maintain+human+embryonic+stem+cells+from+poor-quality+embryos.">Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos.</a> Stem Cell Research. 15 (2), 322-324 (2015).</li></ol>

HAECを用語膜から分離する新しいプロトコルを実装した。各膜は、各膜から細胞を分析するために分離する前に、その3つの解剖学的領域に分割されたという点で、以前の報告とは異なります。
プロトコルの最も重要なステップの1つは、上皮細胞を分離する際にトリプシンの活性を妨げる可能性があるため、すべての血栓を除去する膜の洗浄である。このステップを適切?...

ヒト羊膜上皮細胞(HAEC)は、胚発生の初期段階で、約8日後の受精で生じる。それらは、羊膜1の最も内側の層から派生するエピブラストの扁平上皮細胞の集団から生じる。従って、HAECは、胚2の3つの生殖層に分化する可能性を有するエピブラスト由来の多能性細胞の残骸と考えられる。過去10年間に、多様な研究グループは、これらの細胞を妊娠期の羊膜から分離し、インビトロ3、4の培養モデルにおける推定多能性関連特性を特徴付ける方法を開発した。
従って、表面抗原SSEA-3、SSEA-4、TRA 1-60、TRA 1-81などのヒト多能性幹細胞(HPSC)のHAEC特徴特性が判明した。多能性転写因子OCT4、SOX2、およびNANOGのコア;増殖マーカーKI67は、それらが自己更新していることを示唆する5、6、7。さらに、これらの細胞は、3つの生殖層(外胚葉、中胚葉、内胚葉)の系統特異的マーカーに対して陽性の細胞を得るために分化プロトコルを用いて挑戦されてきた4、5、8、ならびにヒト疾患の動物モデルにおいて。最後に、HAECエクスプレスE-カドヘリンは、HPSC5、9と同様に上皮的な性質を保持していることを実証します。
胚起源とは別に、HAECは、抗炎症分子および抗菌分子10、11、成長因子およびサイトカイン放出12の分泌、HPSC2とは対照的に免疫不全マウスに移植された場合の奇形腫の形成、および免疫学的耐性など、異なる臨床用途に適した他の本質的特性を有する。移植13.
しかし、これまでの報告では、ヒト羊膜は同種の膜であると仮定しており、解剖学的および生理学的に3つの領域に分けられることを考慮せずに:胎盤(デシドゥア基底を覆う羊膜)、臍帯(臍帯を包む部分)、および反射(膜の残りの部分は胎盤に付着していない)14。羊膜の胎盤および反射領域は、形態、ミトコンドリア活性、活性酸素種15の検出、miRNA発現16、およびシグナル伝達経路17の活性化における変化を示すことを示している。これらの結果は、ヒト羊膜が異なる機能を有する異種集団によって統合され、その結果またはインビトロモデルのいずれかで行われるさらなる研究のために考慮されるべきであることを示唆している。他の研究室は、膜全体からHAECを分離するためのプロトコルを設計していますが、我々の研究室は、異なる解剖学的領域から細胞を分離、培養、および特徴付けるプロトコルを確立しました。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>55 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>12430054</td>
			<td>Supplemented with high glucose and HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Ambion</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>0.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonic stem-cell FBS, qualified</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>10439024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution (sodium chloride 0.9%)</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>with conical bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 &#181;l, 200 &#181;l and 10 &#181;l.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton gauzes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical gloves</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Pipet Filler/Dispenser</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile beakers of 500 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic cutting board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile stainless steel container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tray</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>MaCSmix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies and Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Antibody ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-cadherin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td>RRID:AB_3975</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KI67</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>23900</td>
			<td>RRID:AB_627859)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NANOG</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>500-P236</td>
			<td>RRID:AB_1268274</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OCT4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab19857</td>
			<td>RRID:AB_44517</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5603</td>
			<td>RRID:AB_2286686</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SSEA-4</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4755</td>
			<td>RRID:AB_1264259</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRA-1-60</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4746</td>
			<td>RRID:AB_2119059</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>RRID:AB_2534088</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11036</td>
			<td>RRID:AB_10563566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunel Assay Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>66110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro culture of epithelial cells from different anatomical regions of the human amniotic membrane

ヒト羊膜上皮細胞(HAEC)の単離および培養のための文献にはいくつかのプロトコルが報告されている。しかしながら、これらは羊膜上皮が均質な層であると仮定する。ヒト羊膜は、反射、胎盤、臍の3つの解剖学的領域に分けることができる。各領域は、病理学的状態などで異なる生理学的役割を有する。ここでは、ヒト羊膜組織を3つのセクションで解剖し、インビトロで維持するプロトコルについて説明する。培養では、反射した羊膜に由来する細胞は立方体形態を示し、胎盤領域と臍領域の両方の細胞は扁平上皮であった。それにもかかわらず、得られた全ての細胞は上皮表現型を有し、E−カドヘリンの免疫検出によって実証される。したがって、その場での胎盤領域と反射領域は細胞成分と分子機能が異なるため、IN vitro試験ではHAECの使用に生理的な影響を及ぼす可能性があるため、これらの違いを考慮する必要がある場合があります。生物医学研究と再生医療におけるこれらの細胞の有望な応用

HAECは、羊膜の3つの解剖学的領域のそれぞれから単離し、インビトロで個別に培養した。48時間培養した後、上皮表現型を有する細胞がプレートの表面に付着し、培地には細胞破片や浮遊細胞も含まれていたが、培地が変化すると除去した(図3)。
一次培養(通路ゼロ、P0)の処理中に、実験データ分析を妨げる可能性のあるいくつかの合併症が生じる可...

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In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

このプロトコルは、ヒト羊膜の異なる解剖学的領域からの上皮細胞の単離を記述し、臨床および生理学的病理学モデルにおける可能な適用のための異質性および機能的特性を決定する。

ヒト羊膜の異なる解剖学的領域からの上皮細胞のインビトロ培養

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...

このプロトコルは、羊膜から分離されたヒト羊膜上皮細胞の異質性および機能的特性に関する重要な質問に答える助けとなる。以前のプロトコルは、領域間を識別することなく共羊膜から細胞を単離したが、我々のプロトコルは、3つの異なる解剖学的領域から分離された細胞集団の培養を可能にする。羊膜を領域別に分離するには、無菌条件下でバイオセーフティキャビネットにおいて、臍帯を包む臍羊膜、デシドゥア基底を覆う胎盤羊膜、および胎盤に付着していない残りの羊膜と考えられる反射領域を特定する。臍帯の領域を解剖するには、解剖鉗子を使用して胎盤と臍帯の接合部を覆う羊膜の部分を保持し、カメスを使用してコードを取り囲む領域を解剖し、延伸しながら領域をコリオンから分離する。次いで、100ミリリットルの生理食塩水を標識ビーカーに分離した組織を沈着させる。胎盤羊膜領域を解剖するには、無菌綿ガーゼを使用して、胎盤を覆う絨毛/羊膜の表面から血栓を取り除きます。そして、解剖鉗子を使用して、胎盤と反射領域の境界上の膜を把握する。メスを使って胎盤の周囲を切り取り、胎盤から血管を切らないで、胎盤の羊膜を切り離します。分離した組織を、300ミリリットルの生理食塩水を用いて別の標識ビーカーに入れる。そして、胎盤に付着していない羊膜の残りの部分を絨毛膜から分離する。次に、300ミリリットルの生理食塩水を用いて、別の標識ビーカーに反射領域を入れる。膜を洗浄するには、ピンセットを使用して滅菌表面に置き、組織の各容器から生理液を廃棄できるようにします。容器に戻して膜を置き、100ミリリットルの新鮮な生理食塩水を臍帯領域に加え、300ミリリットルの新鮮な生理食塩水を胎盤および反射領域に加えます。解剖鉗子を使用して膜をかき混ぜて血液残留物を除去し、生理液を廃棄できるように無菌表面に膜を置きます。次に、組織が半透明になるまで、少なくとも2回、実証したように、膜を洗浄します。異なる羊膜領域の酵素消化のために、反射および胎盤領域を2つまたは3つの断片に切断する。そして、断片と臍帯領域を個々の50ミリリットル遠心管に入れる。0.5%トリプシン-EDTAの20ミリリットルを、反射および胎盤領域組織断片の各チューブに加え、0.5%トリプシン-EDTAの5ミリリットルを臍領域組織を含むチューブに加える。チューブを30秒間軽く振ります。その後、滅菌表面に膜を置き、トリプシン-EDTA溶液を廃棄し、反射および胎盤領域組織断片の新鮮な0.5%トリプシン-EDTAの30ミリリットルと臍帯組織の新鮮な0.5%トリプシン-EDTAの15ミリリットルに置き換えます。その後、チューブをインキュベーター内のローテーターに入れ、摂氏37度で毎分20回転で40分回転します。インキュベーションの終わりに、細胞溶液の全容を新しい円錐形の管に移す。そして、氷上の各チューブに37°CのヒトAE細胞培地の2倍の体積を加えます。ちょうど実証したように、新鮮な0.5%トリプシン-EDTAで元のチューブ内の残りの組織断片を消化します。2回目の消化の終わりに、切除鉗子のペアを使用して羊膜部分の一端を保持し、2番目の1組の解剖鉗子を残りの組織に沿って絞り、前のインキュベーション期間中に完全に剥がれなかった上皮細胞の行を除去する。次いで、第2の消化液を遠心分離管の第2のセットに移すことができるように膜を取り除く。そして、氷の上の新鮮な37°CのヒトAE細胞培地の2倍の体積で消化酵素を不活性化する。ヒトAE細胞単離のために、遠心分離によって細胞を沈下する。そして、新鮮な37°CのヒトAE細胞培地の10ミリリットルで各チューブのペレットを再懸濁する。消化の各ペアを1つのチューブに引き込み、100マイクロメートルのストレーナーを通して懸濁液を濾過し、細胞外マトリックスの破片を取り除きます。計数後、3つの領域のヒトAE細胞を個々の100ミリメートルプレートに3倍の100ミリメートルプレートに播種し、37°CのヒトAE細胞培地で4センチメートル平方濃度に、ヒト表皮成長因子の1ミリリットル当たり10ナノグラムを添加する。次に、目的の下流分析まで加湿インキュベーターでノルモキシ条件下で37°Cで培養をインキュベートする。48時間培養後、上皮表現型を有するヒトAE細胞はプレートの表面に付着し、上清には培地が変化した後に除去できる細胞デブリおよび浮遊細胞が含まれる。細菌汚染の存在を特定する際に培養を廃棄し、別の膜を処理し、膜の洗浄が不十分なために赤血球を過剰に、欠乏または非接着性細胞、または線維芽細胞形態を有する細胞を同定することが推奨される。ヒトAE細胞形態は細胞の起源に依存し、反射領域からの細胞は立方体形態を示し、石畳の単層で成長し、胎盤および臍帯からの細胞は平坦で扁平上皮である。Eカドヘリンに対する免疫蛍光は、主要な培養およびサブ培養物が上皮表現型を維持していることを明らかにし、別の細胞型の汚染がないことを示唆している。さらに、細胞は、Ki-67増殖マーカーの発現によって証明されるように、生存可能である。羊膜からの亜集団は形態や機能が異なるが、多能性因子のコアの発現および存在は、胎盤および反射領域に由来するヒトAE細胞では変化しない。ヒト羊膜上皮細胞は多能性幹細胞の供給源として考えられるため、各領域の細胞が異なる可能性を持っているかどうかを解明するために、特定の定義プロトコルのラインを通じてそれらに挑戦することができます。開始されたプロトコルの前に、組織が感染の微生物学的特性を示さないことを確認するために患者の病歴を見直す。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

ウズラ胚の卵黄嚢の膜からの一次内胚葉上皮細胞培養

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

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開発<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイは、間葉細胞受けた上皮間葉移行の収縮機能を評価します

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

再現性の高い小分子ベースの分化プロトコルを使用したヒト多能性幹細胞から心筋細胞の大規模生産

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

トランスポゾンのシステムを用いたマウスの羊水細胞から多能性幹細胞の作製

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

マウス子宮内膜上皮と間質細胞の単離のために<em&gt;インビトロ</em&gt;脱落膜化

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

主な羊水および膜 Xeno 無料条件で多能性細胞をリプログラミング

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

造血の発達における大動脈生殖巣中植文化システムのアプリケーション

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

高齢者人間ブルッフ膜のEx Vivoモデルの網膜色素上皮細胞の培養

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...