Name: in vitro culture of epithelial cells from different anatomical regions of the human amniotic membrane
Uploaded: 2019-11-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane at JoVE.com

우리의 연구는 인스티투토 나시오날 드 페리나토로지아 데 멕시코 (21041 및 21081) 및 CONACYT (A1-S-8450 및 252756)의 보조금에 의해 지원되었습니다. 기술 지원을 위해 제시카 곤잘레스 노리스와 리디아 유리리아 파레데스 비바스에게 감사드립니다.

이 프로토콜은 멕시코 시티의 인스티투토 나시오날 드 페리나토로지아의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다 (레지스트리 번호 212250-21041). 이러한 연구에서 수행된 모든 절차는 Instituto Nacional de Perinatología, 헬싱키 선언 및 보건부의 공식 멕시코 표준에 명시된 지침의 윤리적 기준에 따라 수행되었습니다.
1. 준비
<ol><li>EDTA를 통해 1x PBS 솔루션을 준비합니다. 이렇게 하려면 0....

<ol>
	<li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li><li>Garcia-Lopez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amniotic+epithelium+(HAE)+as+a+possible+source+of+stem+cells+(SC).">Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC).</a> Gaceta Medica de Mexico. 151 (1), 66-74 (2015).</li><li>Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Human+Amnion+Epithelial+Cells+According+to+Current+Good+Manufacturing+Procedures.">Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).</li><li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amnion+epithelial+cell+isolation+and+characterization+for+clinical+use.">Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).</li><li>Garcia-Castro, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+Pluripotency+in+Human+Amniotic+Epithelial+Cells+and+Their+Differentiation+to+Progenitor+of+Cortical+Neurons.">Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons.</a> PLoS One. 10 (12), 0146082 (2015).</li><li>Garcia-Lopez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+markers+in+tissue+and+cultivated+cells+in+vitro+of+different+regions+of+human+amniotic+epithelium.">Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium.</a> Experimental Cell Research. 375 (1), 31-41 (2019).</li><li>Yang, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+characterization+of+human+amniotic+epithelial+cells+in+a+serum-free+system+and+their+safety+evaluation.">Biological characterization of human amniotic epithelial cells in a serum-free system and their safety evaluation.</a> Acta Pharmacological Sinica. 39 (8), 1305-1316 (2018).</li><li>Zou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA32+silences+WWP2+expression+to+maintain+the+pluripotency+of+human+amniotic+epithelial+stem+cells+and+beta+isletlike+cell+differentiation.">MicroRNA32 silences WWP2 expression to maintain the pluripotency of human amniotic epithelial stem cells and beta isletlike cell differentiation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 41 (4), 1983-1991 (2018).</li><li>Avila-Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+ephemeral+human+pluripotent+state.">Capturing the ephemeral human pluripotent state.</a> Developmental Dynamics. 245 (7), 762-773 (2016).</li><li>Niknejad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+amniotic+membrane+for+potential+use+in+tissue+engineering.">Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering.</a> European Cells &amp; Materials. 15, 88-99 (2008).</li><li>Miki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+characteristics+and+the+therapeutic+potential+of+amniotic+epithelial+cells.">Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 80 (4), 13003 (2018).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+proliferation,+migration+and+angiogenic+properties+of+human+amniotic+epithelial+and+mesenchymal+stem+cells+and+their+effects+on+endothelial+cells.">Comparison of the proliferation, migration and angiogenic properties of human amniotic epithelial and mesenchymal stem cells and their effects on endothelial cells.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 918-926 (2017).</li><li>Hammer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amnion+epithelial+cells,+in+contrast+to+trophoblast+cells,+express+all+classical+HLA+class+I+molecules+together+with+HLA-G.">Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I molecules together with HLA-G.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 37 (2), 161-171 (1997).</li><li>Benirschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+Pathology+of+the+Placental+Membranes.">Anatomy and Pathology of the Placental Membranes.</a> Pathology of the Human Placenta. , 268-318 (1995).</li><li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+metabolic+activity+in+placental+and+reflected+regions+of+the+human+amniotic+membrane.">Different metabolic activity in placental and reflected regions of the human amniotic membrane.</a> Placenta. 36 (11), 1329-1332 (2015).</li><li>Kim, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-143+regulation+of+prostaglandin-endoperoxidase+synthase+2+in+the+amnion:+implications+for+human+parturition+at+term.">miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term.</a> PLoS One. 6 (9), 24131 (2011).</li><li>Han, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+gene+expression+profiling:+novel+evidence+for+biological+heterogeneity+of+the+human+amnion.">Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heterogeneity of the human amnion.</a> Biology of Reproduction. 79 (5), 954-961 (2008).</li><li>Alcaraz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+TGF-beta+induces+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+human+amniotic+epithelial+cells.">Autocrine TGF-beta induces epithelial to mesenchymal transition in human amniotic epithelial cells.</a> Cell Transplantation. 22 (8), 1351-1367 (2013).</li><li>Canciello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+prevents+epithelial-mesenchymal+transition+of+ovine+amniotic+epithelial+cells+and+enhances+their+immunomodulatory+properties.">Progesterone prevents epithelial-mesenchymal transition of ovine amniotic epithelial cells and enhances their immunomodulatory properties.</a> Scientific Reports. 7 (1), 3761 (2017).</li><li>Canciello, A., Greco, L., Russo, V., Barboni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+Epithelial+Cell+Culture.">Amniotic Epithelial Cell Culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1817, 67-78 (2018).</li><li>Singh, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+network+crosstalk+in+human+pluripotent+cells:+a+Smad2/3-regulated+switch+that+controls+the+balance+between+self-renewal+and+differentiation.">Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 312-326 (2012).</li><li>Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Focal+Adhesion+Kinase+Signaling+by+Integrin+alpha6beta1+Supports+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Self-Renewal.">Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal.</a> Stem Cells. 34 (7), 1753-1764 (2016).</li><li>Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+regional+distribution+of+aquaporins+in+amnion+of+normal+and+gestational+diabetic+pregnancies.">Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies.</a> Physiological Reports. 3 (3), 12320 (2015).</li><li>Avila-Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amniotic+epithelial+cells+as+feeder+layer+to+derive+and+maintain+human+embryonic+stem+cells+from+poor-quality+embryos.">Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos.</a> Stem Cell Research. 15 (2), 322-324 (2015).</li></ol>

우리는 용어 막에서 HAEC를 격리하는 새로운 프로토콜을 구현했습니다. 각 막은 각 세포에서 세포를 분석하기 위해 격리되기 전에 세 가지 해부학 영역으로 분할되었다는 점에서 이전 보고서와 다릅니다.
프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나는 상피 세포를 분리 할 때 트립신의 활성을 방해 할 수 있기 때문에 모든 혈전을 제거하는 멤브레인의 세척입니다. 이 단계를 제대?...

인간 양수 상피 세포 (HAEC)는 배아 발달의 초기 단계 동안, 약 8 일 후 추론에서 발생합니다. 그들은 양막1의가장 안쪽 층에서 파생되는 상피 세포의 편평상피 세포 집단에서 발생합니다. 따라서, HAEC는 배아2의3개의 생식층으로 분화할 수 있는 잠재력을 가진 에피블라스트로부터 다능성 세포의 잔재로 간주된다. 지난 10년간, 다양한 연구그룹은 임신 기간 동안 양막으로부터 이들 세포를 분리하는 방법을 개발하여 시험관 내 배양 모델에서 그들의 추정 다능성 관련 특성을 특성화하였다3,4.
따라서, HAEC는 표면 항원 SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81과 같은 인간 다능성 줄기 세포(HPSC)의 특성특성이 있음을 알 수 있다; 다능 전사 인자 OCT4, SOX2, 및 NANOG의 핵심; 및 증식 마커 KI67, 그들은 자기 갱신 제안5,6,7. 더욱이, 이들 세포는 인간 질병의 동물 모델뿐만 아니라 3개의 생식층(ectoderm, mesoderm, 및내배엽)의계보 특이적 마커에 대해 양성 세포를 얻기 위해 분화 프로토콜을 사용하여 도전해 왔다. 마지막으로, HAEC는 HPSC5,9와같은 상피 성질을 유지한다는 것을 입증하는 E-cadherin을 표현합니다.
그들의 배아 기원 에서, HAEC는 항염증 및 항균 분자의분비10,11,성장 인자 및 사이토카인 방출12,면역 결핍 마우스로 이식될 때 기형종의 형성이 없고, HPSC2와대조적으로 면역 결핍 마우스로 이식될 때, 그리고 HLA 를 발현하기 때문에 면역 학적 내성, 그리고 면역 학적 내성을 표현하기 때문에 면역 학적 내성, 및 면역 학적 내성과 같은 다른 임상 응용 프로그램에 적합하게하는 다른 본질적 특성을 가지고 있습니다. 이식13.
그러나, 이전 보고는 인간 양막이 해부학적으로 생리적으로 세 가지 영역으로 나눌 수 있다는 것을 고려하지 않고 균질한 막이라고 가정했습니다: 태반 (데시두아 기저를덮는 양막), 탯줄 (탯줄을 감싸는 부분), 및 반영 (태반에 부착되지 않은 막의 나머지 부분)14. 양수의 태반 및 반사 부위는 형태, 미토콘드리아 활성, 반응성 산소 종15의검출, miRNA 발현16,및 신호 경로(17)의 활성화에서 차이를 나타낸다. 이 결과는 인간 양박이 상이체 또는 시험관 내 모델에서 수행된 추가 연구를 위해 고려되어야 하는 다른 기능을 가진 이기종 인구에 의해 통합된다는 것을 건의합니다. 다른 실험실은 전체 막에서 HAEC의 격리를 위한 프로토콜을 설계하는 동안, 우리의 실험실은 다른 해부학 적인 지구에서 세포를 격리하고, 배양하고, 특성화하는 프로토콜을 설치했습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>55 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>12430054</td>
			<td>Supplemented with high glucose and HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Ambion</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>0.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonic stem-cell FBS, qualified</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>10439024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution (sodium chloride 0.9%)</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>with conical bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 &#181;l, 200 &#181;l and 10 &#181;l.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton gauzes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical gloves</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Pipet Filler/Dispenser</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile beakers of 500 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic cutting board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile stainless steel container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tray</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>MaCSmix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies and Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Antibody ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-cadherin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td>RRID:AB_3975</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KI67</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>23900</td>
			<td>RRID:AB_627859)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NANOG</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>500-P236</td>
			<td>RRID:AB_1268274</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OCT4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab19857</td>
			<td>RRID:AB_44517</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5603</td>
			<td>RRID:AB_2286686</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SSEA-4</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4755</td>
			<td>RRID:AB_1264259</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRA-1-60</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4746</td>
			<td>RRID:AB_2119059</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>RRID:AB_2534088</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11036</td>
			<td>RRID:AB_10563566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunel Assay Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>66110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro culture of epithelial cells from different anatomical regions of the human amniotic membrane

몇몇 프로토콜은 인간 양수 상피 세포의 분리 및 배양에 대한 문헌에서 보고되었다(HAEC). 그러나, 이들은 양상상피가 균질한 층이라고 가정합니다. 인간 양막은 반사, 태반 및 배꼽의 세 가지 해부학 영역으로 나눌 수 있습니다. 각 지역은 병리학 적 조건에서와 같은 다른 생리적 역할을 가지고 있습니다. 여기서, 우리는 3개의 단면도에서 인간 양수 조직을 해부하고 시험관내에서 유지하는 프로토콜을 기술한다. 배양에서, 반사된 양막에서 유래된 세포는 입방체 형태를 나타내었고, 태반 및 배꼽 영역 모두에서 세포는 편평상피였다. 그럼에도 불구하고, 수득된 모든 세포는 상피 표현형을 가지며, E-카데린의 면역 검출에 의해 입증되었다. 따라서, 자리에서 태반 및 반사 된 영역은 세포 구성 요소와 분자 기능이 다르기 때문에, HAEC의 사용에 대한 생리적 영향을 가질 수 있기 때문에 시험관 내 연구에서 이러한 차이를 고려해야 할 수도 있습니다. 생물 의학 연구 및 재생 의학에서 이러한 세포의 유망한 응용 프로그램.

HAEC는 양막의 3개의 해부학적 영역 각각으로부터 분리되었고 개별적으로 시험관내에서 배양하였다. 배양 48시간 후, 상피 표현형을 가진 세포는 플레이트의 표면에 부착되었지만, 배지가 변경되면 제거된 세포 파편 및 부유 세포도 포함되어있지만(도 3).
1 차 배양 (passage zero, P0)의 처리 동안, 실험 데이터 분석을 방해 할 수있는 몇 가지 합병증이 발생할 ?...

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In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

이 프로토콜은 임상 및 생리병리학 적 모델에서 가능한 적용을위한 그들의 이질성 및 기능적 특성을 결정하기 위해 인간 양막의 상이한 해부학 적 영역에서 상피 세포의 분리를 설명합니다.

인간 양막의 다른 해부학 적 영역에서 상피 세포의 시험관 내 배양

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...

이 프로토콜은 양수 막에서 분리된 인간 양수 상피 세포의 이질성 및 기능적 특성에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이전 프로토콜은 지역 간의 안목없이 공동 양수 막에서 세포를 격리하는 동안, 우리의 프로토콜은 세 가지 별개의 해부학 적 영역에서 분리 된 세포 집단의 배양을 허용합니다. 양막을 지역별로 분리하기 위해, 멸균 조건하에서 생물안전 성 캐비닛에서, 탯줄을 감싸는 탯줄, 데시두아 기저증을 덮는 태반 양막 및 태반에 부착되지 않은 양막의 나머지 부분으로 간주되는 반사 부위를 식별한다.배꼽 양막 영역을 해부하려면 해부 된 집게를 사용하여 태반과 탯줄의 접합을 덮는 양막의 일부를 잡고 메스를 사용하여 코드를 둘러싼 영역을 해부하면서 영역을 초리온에서 분리하십시오. 그런 다음, 염수 용액의 100 밀리리터로 라벨이 붙은 비커에 분리 된 조직을 증착합니다. 태반 양막 부위를 해부하려면 멸균 면 거즈를 사용하여 태반을 덮는 초리온 /양막 표면에서 혈전을 제거하십시오.그리고 해부 집게를 사용하여 태반과 반사 된 영역 사이의 경계의 멤브레인을 파악합니다. 태반의 둘레를 따라 잘라 태반 의 둘레를 따라 절단하고 태반 양막에서 태반 양언을 분리하는 메스를 사용하여 태반에서 어떤 혈관을 절단하지 않도록주의하십시오. 분리된 조직을 다른 라벨이 붙은 비커에 300밀리리터의 식염수 용액을 배치합니다.그리고 태반에 부착되지 않은 양수막의 나머지 부분을 초리온으로부터 분리한다. 그런 다음 반사된 영역을 300밀리리터의 식염수 용액으로 다른 라벨이 붙은 비커에 배치합니다. 멤브레인을 세척하려면 핀셋을 사용하여 멸균 표면에 배치하여 조직의 각 용기에서 식염수 용액을 버릴 수 있습니다.멤브레인을 용기에 다시 넣고 배꼽 부위에 100 밀리리터의 신선한 식염수와 300 밀리리터의 신선한 식염수 용액을 태반 및 반사 된 영역에 추가합니다. 해부 포셉을 사용하여 막을 교반하여 혈액 잔류물을 제거하고 멸균 표면에 멤브레인을 배치하여 식염수 용액을 버릴 수 있습니다. 그런 다음 조직이 반투명 할 때까지 방금 설명 한 대로 멤브레인을 적어도 두 번 더 씻으십하십시오.다른 양수 막 영역의 효소 소화를 위해 반사된 태반 부위를 2개 또는 3개의 조각으로 자릅니다. 그리고 파편과 탯줄을 개별 50 밀리리터 원심분리기 튜브에 배치합니다. 20 밀리리터0.5%의 트립신-EDTA를 각 튜브에 반사 및 태반 부위 조직 단편과 배꼽 영역 조직을 포함하는 튜브에 0.5%의 트립신-EDTA 5밀리리터를 첨가한다.튜브를 30초 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 그런 다음 멤브레인을 멸균 표면에 놓고 트립신-EDTA 용액을 버리고 반사 및 태반 부위 조직 단편에 대한 신선한 0.5 %의 트립신-EDTA의 30 밀리리터와 배꼽 조직 부위에 대한 신선한 0.5 %의 트립신-EDTA15 밀리리터로 대체하십시오. 그런 다음 튜브를 인큐베이터 내부에 회전기에 넣고 섭씨 37도에서 분당 20 회전에서 40 분 회전합니다.인큐베이션이 끝나면 전체 셀 용액을 새로운 원문 튜브로 옮기습니다. 그리고 얼음에 각 튜브에 37도-섭씨 인간 AE 세포의 두 배를 추가합니다. 원래 튜브의 남은 조직 조각을 신선한 0.5%의 트립신-EDTA로 소화합니다.두 번째 소화의 끝에서, 양막 부분의 한쪽 끝을 보유하기 위해 해부 집게의 쌍을 사용하고 이전 잠복 기간 동안 완전히 벗겨지지 않은 상피 세포의 행을 제거하기 위해 나머지 조직을 따라 짜내기 위해 양해 봉면의 두 번째 쌍을 사용합니다. 그런 다음 두 번째 소화 용액을 두 번째 원심분리관 세트로 이송할 수 있도록 멤브레인을 제거합니다. 그리고 얼음에 신선한 37도 -섭씨 인간 AE 세포 매체의 두 배의 부피와 소화 효소를 비활성화.인간 AE 세포 절연을 위해, 원심분리에 의한 세포를 퇴적시한다. 그리고 신선한 37도-섭씨 인간 AE 세포 배지의 10 밀리리터로 각 튜브에 펠릿을 다시 놓아. 각 소화기를 단일 튜브로 당기고 100 마이크로미터 스트레이너를 통해 서스펜션을 필터링하여 세포외 매트릭스 이물질을 제거합니다.카운트 후, 인간 AE 세포를 3배 100밀리미터 플레이트로 3배 10내지 제4세포로 37도-섭씨 인간 AE 세포 배지로, 인간 표피 성장 인자의 밀리리터당 10나노그램으로 보충하였다. 그런 다음, 관심의 다운스트림 분석까지 가습 인큐베이터에서 노목 조건에서 섭씨 37도에서 배양. 48시간의 배양 후, 상피 표현형을 가진 인간 AE 세포는 플레이트의 표면에 부착되고, 수퍼네이트에는 배지가 변경되면 제거할 수 있는 세포 파편과 부동 세포가 포함되어 있다.배양을 버리고 세균 오염의 존재를 식별할 때 다른 막을 처리하고, 막의 세척이 부족하거나, 부족하거나 비부착적인 세포 또는 섬유아세포 형태를 가진 세포로 인한 과도한 적혈구를 처리하는 것이 좋습니다. 인간 AE 세포 형태는 반사 된 영역에서 세포가 입체 형태를 입증하고 자갈 단층에서 성장하고, 태반 및 배꼽 영역에서 세포가 아첨과 편평상피이기 때문에 세포의 기원에 따라 달라집니다. E-cadherin에 대한 면역 형광은 1 차 배양과 하위 배양이 상피 표현형을 유지한다는 것을 밝혀, 다른 세포 유형의 오염이 없다는 것을 시사.또한, 세포는 Ki-67 증식 마커의 발현에 의해 입증된 바와 같이 실행 가능하다. 양막에서 하위 인구는 그들의 형태와 기능에 다르지만, 흉부 요인의 핵심의 발현 그리고 존재는 태반 및 반사 된 지역에서 파생된 인간 AE 세포에서 변경되지 않습니다. 인간 양수 상피 세포는 다능성 줄기 세포의 가능한 근원이기 때문에, 우리는 각 지역에서 이 세포가 다른 잠재력을 가지고 있는지 를 해명하기 위하여 특정 정의 프로토콜의 줄을 통해 그(것)들을 도전할 수 있습니다.개시된 프로토콜에 앞서, 조직의 감염의 미생물 특성을 나타내지 않도록 환자의 병력을 검토한다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

일본 메추라기 배아의 노 른 골목 막에서 차 내배엽 상피 세포 배양

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

연구

발생학

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

개발<em&gt; 체외</em&gt; 분석은 중간 엽 세포를 시행 한 상피 - 중간 엽 전환의 수축 기능을 평가하는

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

트랜스포존 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포로부터 다 능성 줄기 세포의 제조

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

마우스 자궁 내막 상피와 기질 세포의 분리에 대한<em&gt; 체외</em&gt; 탈락

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

기본 양수 및 Pluripotency 이종 무료 조건에서 막 셀 프로그래밍

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

대동맥-생식-mesonephros Explant 문화 시스템 개발 조에의 응용

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

세 인간 Bruch 막의 Ex Vivo 모델에서 망막 안료 상피 세포의 배양

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...