Name: in vitro culture of epithelial cells from different anatomical regions of the human amniotic membrane
Uploaded: 2019-11-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane at JoVE.com

Vår forskning ble støttet av tilskudd fra Instituto Nacional de Perinatología de México (21041 og 21081) og CONACYT (a1-S-8450 og 252756). Vi takker Jessica González Norris og Lidia Yuriria Paredes Vivas for teknisk støtte.

Denne protokollen ble godkjent av den etiske komiteen Instituto Nacional de Perinatología i Mexico City (registernummer 212250-21041). Alle prosedyrene som ble utført i disse studiene var i samsvar med de etiske standardene til Instituto Nacional de Perinatología, Helsingfors-erklæringen og de retningslinjer som er fastsatt i Helsedepartementet ' s Official Mexican standard.
1. forberedelse
<ol><li>Forbered en løsning av 1x PBS med EDTA. For å gjøre dette legger du til 500 μL av 0,5 ...

<ol>
	<li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li><li>Garcia-Lopez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amniotic+epithelium+(HAE)+as+a+possible+source+of+stem+cells+(SC).">Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC).</a> Gaceta Medica de Mexico. 151 (1), 66-74 (2015).</li><li>Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Human+Amnion+Epithelial+Cells+According+to+Current+Good+Manufacturing+Procedures.">Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).</li><li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amnion+epithelial+cell+isolation+and+characterization+for+clinical+use.">Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).</li><li>Garcia-Castro, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+Pluripotency+in+Human+Amniotic+Epithelial+Cells+and+Their+Differentiation+to+Progenitor+of+Cortical+Neurons.">Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons.</a> PLoS One. 10 (12), 0146082 (2015).</li><li>Garcia-Lopez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+markers+in+tissue+and+cultivated+cells+in+vitro+of+different+regions+of+human+amniotic+epithelium.">Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium.</a> Experimental Cell Research. 375 (1), 31-41 (2019).</li><li>Yang, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+characterization+of+human+amniotic+epithelial+cells+in+a+serum-free+system+and+their+safety+evaluation.">Biological characterization of human amniotic epithelial cells in a serum-free system and their safety evaluation.</a> Acta Pharmacological Sinica. 39 (8), 1305-1316 (2018).</li><li>Zou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA32+silences+WWP2+expression+to+maintain+the+pluripotency+of+human+amniotic+epithelial+stem+cells+and+beta+isletlike+cell+differentiation.">MicroRNA32 silences WWP2 expression to maintain the pluripotency of human amniotic epithelial stem cells and beta isletlike cell differentiation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 41 (4), 1983-1991 (2018).</li><li>Avila-Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+ephemeral+human+pluripotent+state.">Capturing the ephemeral human pluripotent state.</a> Developmental Dynamics. 245 (7), 762-773 (2016).</li><li>Niknejad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+amniotic+membrane+for+potential+use+in+tissue+engineering.">Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering.</a> European Cells &amp; Materials. 15, 88-99 (2008).</li><li>Miki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+characteristics+and+the+therapeutic+potential+of+amniotic+epithelial+cells.">Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 80 (4), 13003 (2018).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+proliferation,+migration+and+angiogenic+properties+of+human+amniotic+epithelial+and+mesenchymal+stem+cells+and+their+effects+on+endothelial+cells.">Comparison of the proliferation, migration and angiogenic properties of human amniotic epithelial and mesenchymal stem cells and their effects on endothelial cells.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 918-926 (2017).</li><li>Hammer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amnion+epithelial+cells,+in+contrast+to+trophoblast+cells,+express+all+classical+HLA+class+I+molecules+together+with+HLA-G.">Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I molecules together with HLA-G.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 37 (2), 161-171 (1997).</li><li>Benirschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+Pathology+of+the+Placental+Membranes.">Anatomy and Pathology of the Placental Membranes.</a> Pathology of the Human Placenta. , 268-318 (1995).</li><li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+metabolic+activity+in+placental+and+reflected+regions+of+the+human+amniotic+membrane.">Different metabolic activity in placental and reflected regions of the human amniotic membrane.</a> Placenta. 36 (11), 1329-1332 (2015).</li><li>Kim, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-143+regulation+of+prostaglandin-endoperoxidase+synthase+2+in+the+amnion:+implications+for+human+parturition+at+term.">miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term.</a> PLoS One. 6 (9), 24131 (2011).</li><li>Han, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+gene+expression+profiling:+novel+evidence+for+biological+heterogeneity+of+the+human+amnion.">Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heterogeneity of the human amnion.</a> Biology of Reproduction. 79 (5), 954-961 (2008).</li><li>Alcaraz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+TGF-beta+induces+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+human+amniotic+epithelial+cells.">Autocrine TGF-beta induces epithelial to mesenchymal transition in human amniotic epithelial cells.</a> Cell Transplantation. 22 (8), 1351-1367 (2013).</li><li>Canciello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+prevents+epithelial-mesenchymal+transition+of+ovine+amniotic+epithelial+cells+and+enhances+their+immunomodulatory+properties.">Progesterone prevents epithelial-mesenchymal transition of ovine amniotic epithelial cells and enhances their immunomodulatory properties.</a> Scientific Reports. 7 (1), 3761 (2017).</li><li>Canciello, A., Greco, L., Russo, V., Barboni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+Epithelial+Cell+Culture.">Amniotic Epithelial Cell Culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1817, 67-78 (2018).</li><li>Singh, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+network+crosstalk+in+human+pluripotent+cells:+a+Smad2/3-regulated+switch+that+controls+the+balance+between+self-renewal+and+differentiation.">Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 312-326 (2012).</li><li>Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Focal+Adhesion+Kinase+Signaling+by+Integrin+alpha6beta1+Supports+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Self-Renewal.">Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal.</a> Stem Cells. 34 (7), 1753-1764 (2016).</li><li>Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+regional+distribution+of+aquaporins+in+amnion+of+normal+and+gestational+diabetic+pregnancies.">Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies.</a> Physiological Reports. 3 (3), 12320 (2015).</li><li>Avila-Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amniotic+epithelial+cells+as+feeder+layer+to+derive+and+maintain+human+embryonic+stem+cells+from+poor-quality+embryos.">Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos.</a> Stem Cell Research. 15 (2), 322-324 (2015).</li></ol>

Vi implementerte en ny protokoll for å isolere HAEC fra term membraner. Det skiller seg fra tidligere rapporter i at hver membran ble delt inn i sine tre anatomiske områder før isolasjon for å analysere celler fra hver enkelt.
En av de mest kritiske trinnene i protokollen er vasking av membranen for å fjerne alle blodpropp, fordi de kan forstyrre aktiviteten av Trypsin når skille epitelceller. Unnlatelse av å gjennomføre dette trinnet riktig kan føre til å få en primær kultur med o...

Human fostervann epitelceller (HAEC) stamme under de tidlige stadiene av embryonale utvikling, på rundt åtte dager postfertilization. De oppstår fra en befolkning av plateepitel epitelceller i epiblast som stammer fra det innerste laget av fostervann membran1. Dermed HAEC anses rester av pluripotent celler fra epiblast som har potensial til å differensiere i tre bakterie lag av embryo2. I det siste tiåret har ulike forskningsgrupper utviklet metoder for å isolere disse cellene fra fostervann membran på begrepet av svangerskapet for å karakterisere deres presumptive pluripotency-relaterte egenskaper i en kultur modell in vitro3,4.
Følgelig har det blitt funnet at HAEC funksjon trekk karakteristisk for menneskelige Pluripotent stamceller (HPSC), slik som overflaten antigener SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; kjernen i pluripotency transkripsjon faktorer OCT4, SOX2, og NANOG; og spredning markør KI67, noe som tyder på at de er selv fornye5,6,7. Videre har disse cellene blitt utfordret ved hjelp av differensiering protokoller for å få celler positive for avstamning-spesifikke markører av de tre bakterie lag (ektoderm, mesoderm, og endoderm)4,5,8, så vel som i dyremodeller av menneskelige sykdommer. Til slutt, HAEC Express E-cadherin, som viser at de beholder en epitel natur mye som HPSC5,9.
Bortsett fra deres embryonale opprinnelse, HAEC har andre iboende egenskaper som gjør dem egnet for ulike kliniske anvendelser, slik som utskillelsen av anti-inflammatorisk og antibakterielle molekyler10,11, vekstfaktorer og cytokin Release12, ingen dannelse av teratomer når de er transplantert inn immunodeficient mus i kontrast med HPSC2, og immunologiske toleranse fordi de uttrykker HLA-G, noe som reduserer risikoen for avvisning etter transplantasjon13.
Men tidligere rapporter har antatt at den menneskelige amnion er en homogen membran, uten å vurdere at det kan være anatomisk og fysiologisk delt inn i tre regioner: placenta (den amnion som dekker Vertsplanter basalis), navle (den delen som omslutter den navlestreng), og reflektert (resten av membranen ikke festet til morkaken)14. Det har vist seg at de placenta og reflekterte regionene i amnion vise forskjeller i morfologi, mitokondrie aktivitet, påvisning av reaktive oksygen arter15, miRNA Expression16, og aktivering av signalering trasé17. Disse resultatene tyder på at den menneskelige amnion er integrert av en heterogen befolkning med ulik funksjonalitet som bør vurderes for videre studier utført i enten in situ eller in vitro-modeller. Mens andre laboratorier har utformet protokoller for isolering av HAEC fra hele membranen, har vårt laboratorium etablert en protokoll for å isolere, kultur og karakterisere celler fra ulike anatomiske områder.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>55 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>12430054</td>
			<td>Supplemented with high glucose and HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Ambion</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>0.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonic stem-cell FBS, qualified</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>10439024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution (sodium chloride 0.9%)</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>with conical bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 &#181;l, 200 &#181;l and 10 &#181;l.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton gauzes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical gloves</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Pipet Filler/Dispenser</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile beakers of 500 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic cutting board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile stainless steel container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tray</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>MaCSmix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies and Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Antibody ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-cadherin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td>RRID:AB_3975</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KI67</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>23900</td>
			<td>RRID:AB_627859)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NANOG</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>500-P236</td>
			<td>RRID:AB_1268274</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OCT4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab19857</td>
			<td>RRID:AB_44517</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5603</td>
			<td>RRID:AB_2286686</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SSEA-4</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4755</td>
			<td>RRID:AB_1264259</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRA-1-60</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4746</td>
			<td>RRID:AB_2119059</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>RRID:AB_2534088</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11036</td>
			<td>RRID:AB_10563566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunel Assay Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>66110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro culture of epithelial cells from different anatomical regions of the human amniotic membrane

Flere protokoller har blitt rapportert i litteraturen for isolering og kultur av humant fostervann epitelceller (HAEC). Men disse forutsetter at fostervann epitel er et homogen lag. Den menneskelige amnion kan deles inn i tre anatomiske områder: reflektert, placenta og navle. Hver region har ulike fysiologiske roller, for eksempel i patologiske tilstander. Her over, vi beskrive en protokollen å analysere Human amnion tissue inne tre avdelinger og vedlikeholde den inne vitro. I kultur, celler avledet fra reflektert amnion vist en kubisk morfologi, mens celler fra både placenta og navle områder ble plateepitel. Likevel, alle cellene innhentet har en epitel fenotype, demonstrert av immunodetection av E-cadherin. Derfor, fordi placenta og reflekterte regionene i situ varierer i cellulære komponenter og molekylære funksjoner, kan det være nødvendig for in vitro studier å vurdere disse forskjellene, fordi de kan ha fysiologiske implikasjoner for bruk av HAEC i biomedisinsk forskning og lovende anvendelse av disse cellene i regenererende medisin.

HAEC ble isolert fra hver av de tre anatomiske regionene i fostervann membranen og individuelt kultivert in vitro. Etter 48 h av kultur, celler med et epitel fenotype levd opp til overflaten av platen, selv om mediene også inneholdt celle rusk og flytende celler, som ble fjernet når mediet ble endret (Figur 3).
Under behandlingen av primær kultur (passasje null, p0), kan noen komplikasjoner oppstå som kan forstyrre den eksperimentelle dataanalyse (<strong clas...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane at JoVE.com

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

Denne protokollen beskriver isolering av epitelceller fra ulike anatomiske områder av den menneskelige fostervann membranen for å bestemme deres heterogenitet og funksjonelle egenskaper for mulig anvendelse i kliniske og physiopathological modeller.

In vitro kultur av epitelceller fra ulike anatomiske regioner av Human fostervann membran

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...

Denne protokollen kan bidra til å svare på viktige spørsmål om heterogenitet og funksjonelle egenskaper av menneskelige fostervannsceller isolert fra fostermembran. Mens tidligere protokoller isolerte celler fra co-fostervannmembran uten å skjelne mellom regioner, tillater vår protokoll kulturen av cellepopulasjon isolert fra tre forskjellige anatomiske regioner. For å skille fostervannsmembranen etter region, i et biosikkerhetsskap under sterile forhold, identifisere navlestrengen som omslutter navlestrengen, placenta amnion som dekker decidua basalis, og den reflekterte regionen, som regnes som resten av amnion som ikke er festet til morkaken.For å dissekere navlestrengen, bruk dissekerings tang for å holde den delen av amnionmembranen som dekker krysset mellom morkaken og navlestrengen, og bruk en skalpell til å dissekere regionen som omgir ledningen, mens den strekker seg for å skille regionen fra chorion. Deretter deponerer det separerte vevet i et merket beger med 100 milliliter saltoppløsning. For å dissekere placenta amnion-regionen, bruk en steril bomullsgasbind for å fjerne blodproppene fra overflaten av chorion / amnion som dekker morkaken.Og bruk dissekering tang for å gripe membranen på grensen mellom morkaken og den reflekterte regionen. Bruk en skalpell til å kutte langs omkretsen av morkaken og skille placenta amnion fra chorion, vær forsiktig så du ikke kutter noen fartøy fra morkaken. Legg det separerte vevet i et annet merket beger med 300 milliliter saltoppløsning.Og skille resten av fostermembranen som ikke er festet til morkaken fra chorion. Deretter plasserer du den reflekterte regionen i et annet merket beger med 300 milliliter saltløsning. For å vaske membranene, bruk pinsett for å plassere dem på en steril overflate for å kunne kaste saltløsningen fra hver beholder med vev.Plasser membranene tilbake i beholderen og tilsett 100 milliliter fersk saltvannsløsning til navlestrengområdet og 300 milliliter fersk saltvannsløsning til placenta og reflekterte regioner. Bruk dissekering tang for å røre membranene for å fjerne eventuelle blodrester og plassere membranene på den sterile overflaten for å kunne kaste saltløsningene. Vask deretter membranene minst to ganger til, som bare demonstrert, til vevet er gjennomsiktig.For enzymatisk fordøyelse av de forskjellige fostermembranområdene, kutt de reflekterte og placentaområdene i to eller tre fragmenter. Og plasser fragmentene og navlestrengen i individuelle 50-milliliter sentrifugerør. Tilsett 20 milliliter med 0,5% trypsin-EDTA til hvert rør av reflekterte og placenta region vevfragmenter og fem milliliter på 0,5% trypsin-EDTA til røret som inneholder navlestrengområdet vev.Rist rørene forsiktig i 30 sekunder. Plasser deretter membranene på en steril overflate, kast trypsin-EDTA-løsningen og erstatt den med 30 milliliter friske 0,5% trypsin-EDTA for de reflekterte og placentaregionvevfragmentene og 15 milliliter friske 0,5% Trypsin-EDTA for navlestrengen vev. Plasser deretter rørene i en rotator inne i en inkubator for en 40-minutters rotasjon ved 20 rotasjoner per minutt ved 37 grader Celsius.På slutten av inkubasjonen overfører du hele volumet av celleløsning til nye koniske rør. Og legg til to ganger volumet av 37-graders Celsius menneskelige AE-celler medium til hvert rør på is. Fordøy eventuelle rester vev fragmenter i de opprinnelige rørene med friske 0,5% trypsin-EDTA, som nettopp demonstrert.På slutten av den andre fordøyelsen, bruk et par dissekering pinsett for å holde den ene enden av amnion delen og et andre par dissekering tang å presse langs gjenværende vev for å fjerne eventuelle rader med epitelceller som ikke helt skrelle av i løpet av de forrige inkubasjonsperioder. Fjern deretter membranene for å kunne overføre den andre fordøyelsesløsningen til et annet sett med sentrifugerør. Og inaktiver fordøyelsesen enzymer med to ganger volumet av friske 37-graders Celsius menneskeligE AE celle medium på is.For menneskelig AE-celleisolasjon, sediment cellene ved sentrifugering. Og resuspend pellet i hvert rør med 10 milliliter friske 37-graders Celsius menneskeligE AE celle medium. Trekk hvert par fordøyelser inn i et enkelt rør og filtrer suspensjonene gjennom 100-mikrometersiler for å fjerne eventuelle ekstracellulære matriseavfall.Etter telling, frø de menneskelige AE-cellene fra hver av de tre regionene til individuelle 100-millimeter plater på en tre ganger 10 til fjerde celler per centimeter kvadrert konsentrasjon i 37-graders Celsius menneskelig AE celle medium, supplert med 10 nanograms per milliliter av menneskelig epidermal vekstfaktor. Deretter inkubere kulturene ved 37 grader Celsius under normoxic forhold i en fuktet inkubator til nedstrøms analyse av interesse. Etter 48 timers kultur holder menneskelige AE-celler med epitelfenotype seg overflaten av platen, mens det supernatante inneholder celleavfall og flytende celler som kan fjernes når mediet endres.Det anbefales å kaste bort kulturene og behandle en annen membran ved å identifisere tilstedeværelsen av bakteriell forurensning, overdreven erytrocytter på grunn av utilstrekkelig vasking av membranene, mangelfulle eller ikke-adelle celler, eller celler med fibroblastmorfologi. Human AE celle morfologi avhenger av opprinnelsen til cellene, som celler fra den reflekterte sonen demonstrere en cuboidal morfologi og vokse i en brosteinsbelagt monolayer, og celler fra placenta og navlestreng regioner er flatere og plateepitel. Immunofluorescence mot E-kadherin avslører at de primære kulturer og subkulturer opprettholder sin epitelfenotype, noe som tyder på at det ikke er forurensning av en annen celletype.I tillegg er cellene levedyktige, noe som fremgår av deres uttrykk for Ki-67 spredningsmarkør. Selv om underpopulasjonene fra amnionen varierer i deres morfologi og funksjon, endres ikke uttrykket og tilstedeværelsen av kjernen av pluripotensfaktorene i menneskelige AE-celler avledet fra placenta og reflekterte regioner. Siden humane fostervannsceller er en mulig kilde til pluripotente stamceller, kan vi utfordre dem gjennom en linje med spesifikke definisjonsprotokoller for å belyse om disse cellene fra hver region har forskjellige potensialer.Før en startet protokoll, gjennomgå pasientens medisinske historie for å være sikker på at vevet ikke viser noen mikrobiologiske egenskaper av infeksjon.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Primær endodermal epithelial Cell Culture fra plommesekken membran av japanske Quail embryoer

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Utvikling av en<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay å evaluere kontraktile funksjon av mesenchymalceller som gjennomgikk Epitelial-Mesenchymale Overgangs

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storskala produksjon av cardiomyocytes fra Menneskelig Pluripotent stamceller ved hjelp av en meget reproduserbar lite molekyl-Based Differensiering Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Produksjonen av Pluripotent stamceller fra mus fostervann Cells Ved hjelp av en Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolering av Mouse Livmor Epithelial og stromale celler for<em&gt; In Vitro</em&gt; Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Rettet differensiering av Primitive og Definitive blodkreft Progenitors fra menneskelige Pluripotent stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Omprogrammere primære fostervann og membran celler Pluripotency Xeno-gratis forhold

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rask, rettet differensiering av netthinnens Pigment epitelceller fra menneskelige embryonale eller indusert Pluripotent stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

Anvendelse av Aorta-gonad-mesonephros Explant kultur-systemet i utviklingsmessige Hematopoiesis

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Dyrking av netthinnens Pigment epitelceller på en Ex Vivo modell av alderen menneskelige Bruchs membran

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...