Name: in vitro culture of epithelial cells from different anatomical regions of the human amniotic membrane
Uploaded: 2019-11-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane at JoVE.com

Nossa pesquisa contou com o apoio de doações do Instituto Nacional de Perinatología de México (21041 e 21081) e CONACYT (A1-S-8450 e 252756). Agradecemos a Jessica González Norris e Lidia Yuriria Paredes Vivas pelo apoio técnico.

Este protocolo foi aprovado pelo comitê de ética do Instituto Nacional de Perinatología, na Cidade do México (Registro número 212250-21041). Todos os procedimentos realizados nesses estudos estavam de acordo com os padrões éticos do Instituto Nacional de Perinatología, da Declaração de Helsínquia, e das diretrizes estabelecidas no Padrão Oficial mexicano do Ministério da Saúde.
1. Preparação
<ol><li>Prepare uma solução de 1x PBS com EDTA. Para fazer isso, adicione 500 μL d...

<ol>
	<li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li><li>Garcia-Lopez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amniotic+epithelium+(HAE)+as+a+possible+source+of+stem+cells+(SC).">Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC).</a> Gaceta Medica de Mexico. 151 (1), 66-74 (2015).</li><li>Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Human+Amnion+Epithelial+Cells+According+to+Current+Good+Manufacturing+Procedures.">Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).</li><li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amnion+epithelial+cell+isolation+and+characterization+for+clinical+use.">Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).</li><li>Garcia-Castro, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+Pluripotency+in+Human+Amniotic+Epithelial+Cells+and+Their+Differentiation+to+Progenitor+of+Cortical+Neurons.">Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons.</a> PLoS One. 10 (12), 0146082 (2015).</li><li>Garcia-Lopez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+markers+in+tissue+and+cultivated+cells+in+vitro+of+different+regions+of+human+amniotic+epithelium.">Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium.</a> Experimental Cell Research. 375 (1), 31-41 (2019).</li><li>Yang, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+characterization+of+human+amniotic+epithelial+cells+in+a+serum-free+system+and+their+safety+evaluation.">Biological characterization of human amniotic epithelial cells in a serum-free system and their safety evaluation.</a> Acta Pharmacological Sinica. 39 (8), 1305-1316 (2018).</li><li>Zou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA32+silences+WWP2+expression+to+maintain+the+pluripotency+of+human+amniotic+epithelial+stem+cells+and+beta+isletlike+cell+differentiation.">MicroRNA32 silences WWP2 expression to maintain the pluripotency of human amniotic epithelial stem cells and beta isletlike cell differentiation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 41 (4), 1983-1991 (2018).</li><li>Avila-Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+ephemeral+human+pluripotent+state.">Capturing the ephemeral human pluripotent state.</a> Developmental Dynamics. 245 (7), 762-773 (2016).</li><li>Niknejad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+amniotic+membrane+for+potential+use+in+tissue+engineering.">Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering.</a> European Cells &amp; Materials. 15, 88-99 (2008).</li><li>Miki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+characteristics+and+the+therapeutic+potential+of+amniotic+epithelial+cells.">Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 80 (4), 13003 (2018).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+proliferation,+migration+and+angiogenic+properties+of+human+amniotic+epithelial+and+mesenchymal+stem+cells+and+their+effects+on+endothelial+cells.">Comparison of the proliferation, migration and angiogenic properties of human amniotic epithelial and mesenchymal stem cells and their effects on endothelial cells.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 918-926 (2017).</li><li>Hammer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amnion+epithelial+cells,+in+contrast+to+trophoblast+cells,+express+all+classical+HLA+class+I+molecules+together+with+HLA-G.">Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I molecules together with HLA-G.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 37 (2), 161-171 (1997).</li><li>Benirschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+Pathology+of+the+Placental+Membranes.">Anatomy and Pathology of the Placental Membranes.</a> Pathology of the Human Placenta. , 268-318 (1995).</li><li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+metabolic+activity+in+placental+and+reflected+regions+of+the+human+amniotic+membrane.">Different metabolic activity in placental and reflected regions of the human amniotic membrane.</a> Placenta. 36 (11), 1329-1332 (2015).</li><li>Kim, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-143+regulation+of+prostaglandin-endoperoxidase+synthase+2+in+the+amnion:+implications+for+human+parturition+at+term.">miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term.</a> PLoS One. 6 (9), 24131 (2011).</li><li>Han, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+gene+expression+profiling:+novel+evidence+for+biological+heterogeneity+of+the+human+amnion.">Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heterogeneity of the human amnion.</a> Biology of Reproduction. 79 (5), 954-961 (2008).</li><li>Alcaraz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+TGF-beta+induces+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+human+amniotic+epithelial+cells.">Autocrine TGF-beta induces epithelial to mesenchymal transition in human amniotic epithelial cells.</a> Cell Transplantation. 22 (8), 1351-1367 (2013).</li><li>Canciello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+prevents+epithelial-mesenchymal+transition+of+ovine+amniotic+epithelial+cells+and+enhances+their+immunomodulatory+properties.">Progesterone prevents epithelial-mesenchymal transition of ovine amniotic epithelial cells and enhances their immunomodulatory properties.</a> Scientific Reports. 7 (1), 3761 (2017).</li><li>Canciello, A., Greco, L., Russo, V., Barboni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+Epithelial+Cell+Culture.">Amniotic Epithelial Cell Culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1817, 67-78 (2018).</li><li>Singh, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+network+crosstalk+in+human+pluripotent+cells:+a+Smad2/3-regulated+switch+that+controls+the+balance+between+self-renewal+and+differentiation.">Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 312-326 (2012).</li><li>Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Focal+Adhesion+Kinase+Signaling+by+Integrin+alpha6beta1+Supports+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Self-Renewal.">Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal.</a> Stem Cells. 34 (7), 1753-1764 (2016).</li><li>Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+regional+distribution+of+aquaporins+in+amnion+of+normal+and+gestational+diabetic+pregnancies.">Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies.</a> Physiological Reports. 3 (3), 12320 (2015).</li><li>Avila-Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amniotic+epithelial+cells+as+feeder+layer+to+derive+and+maintain+human+embryonic+stem+cells+from+poor-quality+embryos.">Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos.</a> Stem Cell Research. 15 (2), 322-324 (2015).</li></ol>

Implementamos um novo protocolo para isolar a HAEC das membranas a termo. Difere dos relatórios precedentes que cada membrana estêve dividida em suas três regiões anatômicas antes da isolação para analisar pilhas de cada um.
Uma das etapas mais críticas no protocolo é a lavagem da membrana para remover todos os coágulos sanguíneos, porque eles podem interferir com a atividade da tripseao separar as células epiteliais. A falha realizar corretamente esta etapa pode conduzir a obter u...

As células amnióticas do epitélio (HAEC) têm origem nos estágios iniciais do desenvolvimento embrionário, por volta de oito dias após a fertilização. Eles surgem de uma população de células epiteliais escamosas do epiblasto que derivam da camada mais interna da membrana amniótica1. Assim, haec são considerados remanescentes de células pluripotentes do epiblasto que têm o potencial de diferenciar as três camadas germinas do embrião2. Na última década, diversos grupos de pesquisa desenvolveram métodos para isolar essas células da membrana amniótica no termo da gestação para caracterizar suas propriedades presuntivas relacionadas à pluripotência em um modelo de cultura in vitro3,4.
Assim, verificou-se que haec características características características de células-tronco pluripotentes humanas (HPSC), tais como os antígenos de superfície SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; o núcleo dos fatores de transcrição da pluripotência OCT4, SOX2 e NANOG; e o marcador de proliferação KI67, sugerindo que eles são auto-renovação5,6,7. Além disso, essas células têm sido desafiadas usando protocolos de diferenciação para obter células positivas para marcadores específicos de linhagem das três camadas germinativas (ectoderme, mesoderme e endoderm)4,5,8,bem como em modelos animais de doenças humanas. Finalmente, HAEC expressar E-cadherin, que demonstram que eles mantêm uma natureza epitelial muito parecido com o HPSC5,9.
Além de sua origem embrionária, haec têm outras propriedades intrínsecas que os tornam adequados para diferentes aplicações clínicas, tais como a secreção de moléculas anti-inflamatórias e antibacterianas10,11, fatores de crescimento e citocina liberação12, nenhuma formação de teratomas quando eles são transplantados em ratos imunodeficientes em contraste com HPSC2, e tolerância imunológica, porque eles expressam HLA-G, que diminui o risco de rejeição após a rejeição transplante13.
No entanto, relatos anteriores assumiram que o amniônio humano é uma membrana homogênea, sem considerar que pode ser anatomicamente e fisiologicamente dividida em três regiões: placental (a amniônia que cobre a decidua basalis), umbilical (a parte que envolve o cordão umbilical) e refletida (o resto da membrana não ligada à placenta)14. Tem sido demonstrado que as regiões placentárias e refletidas da amniônia apresentam diferenças na morfologia, atividade mitocondrial, detecção de espécies reativas de oxigênio15,expressão miRNA16,e ativação das vias de sinalização17. Estes resultados sugerem que o amnion humano está integrado por uma população heterogênea com funcionalidade diferente que deve ser considerada para estudos mais adicionais realizados em modelos in situ ou in vitro. Enquanto outros laboratórios projetaram protocolos para o isolamento da HAEC de toda a membrana, nosso laboratório estabeleceu um protocolo para isolar, cultura e caracterizar células de diferentes regiões anatômicas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>55 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>12430054</td>
			<td>Supplemented with high glucose and HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Ambion</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>0.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonic stem-cell FBS, qualified</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>10439024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution (sodium chloride 0.9%)</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>with conical bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 &#181;l, 200 &#181;l and 10 &#181;l.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton gauzes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical gloves</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Pipet Filler/Dispenser</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile beakers of 500 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic cutting board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile stainless steel container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tray</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>MaCSmix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies and Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Antibody ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-cadherin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td>RRID:AB_3975</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KI67</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>23900</td>
			<td>RRID:AB_627859)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NANOG</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>500-P236</td>
			<td>RRID:AB_1268274</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OCT4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab19857</td>
			<td>RRID:AB_44517</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5603</td>
			<td>RRID:AB_2286686</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SSEA-4</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4755</td>
			<td>RRID:AB_1264259</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRA-1-60</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4746</td>
			<td>RRID:AB_2119059</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>RRID:AB_2534088</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11036</td>
			<td>RRID:AB_10563566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunel Assay Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>66110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro culture of epithelial cells from different anatomical regions of the human amniotic membrane

Vários protocolos foram relatados na literatura para o isolamento e a cultura das células epiteliais amnióticas humanas (HAEC). No entanto, estes assumem que o epitélio amniótico é uma camada homogênea. O amnion humano pode ser dividido em três regiões anatômicas: refletida, placentária e umbilical. Cada região tem diferentes papéis fisiológicos, como em condições patológicas. Aqui, descrevemos um protocolo para dissecar o tecido amnion humano em três seções e mantê-lo in vitro. Na cultura, as pilhas derivadas do amnion refletido indicaram uma morfologia cuboidal, quando as pilhas das regiões placental e umbilicais eram escamosas. No entanto, todas as células obtidas têm um fenótipo epiteliais, demonstrado pela imunodetecção de E-cadherin. Assim, como as regiões placentárias e refletidas in situ diferem em componentes celulares e funções moleculares, pode ser necessário que estudos in vitro considerem essas diferenças, pois podem ter implicações fisiológicas para o uso de HAEC em pesquisa biomédica e a aplicação promissora dessas células na medicina regenerativa.

Haec foram isolados de cada uma das três regiões anatômicas da membrana amniótica e individualmente cultivadas in vitro. Após 48 h de cultura, células com fenótipo epiteliais aderiram à superfície da placa, embora a mídia também continha detritos celulares e células flutuantes, que foram removidas uma vez que o meio foi alterado (Figura 3).
Durante o processamento da cultura primária (passagem zero, P0), algumas complicações podem surgir que podem i...

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In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

Este protocolo descreve o isolamento de células epiteliais de diferentes regiões anatômicas da membrana amniótica humana para determinar sua heterogeneidade e propriedades funcionais para possível aplicação em modelos clínicos e fisiopatológicos.

In Vitro Cultura das Células Epitelias de diferentes regiões anatômicas da membrana amniótica humana

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...

Este protocolo pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre heterogeneidade e propriedades funcionais de células epiteliais amnióticas humanas isoladas da membrana amniótica. Enquanto protocolos anteriores isolaram células da membrana co-amniótica sem discernir entre as regiões, nosso protocolo permite a cultura da população celular isolada de três regiões anatômicas distintas. Para separar a membrana amniótica por região, em um armário de biossegurança em condições estéreis, identificar o amnion umbilical envolvendo o cordão umbilical, o amnão placentário que cobre o decidua basalis, e a região refletida, que é considerada o resto do amnion que não está ligado à placenta.Para dissecar a região de amnion umbilical, utilize fórceps dissecando para segurar a porção da membrana de amnion que cobre a junção da placenta e do cordão umbilical, e use um bisturi para dissecar a região que circunda o cordão, enquanto se alonga para separar a região do acorde. Em seguida, deposite o tecido separado em um béquer rotulado com 100 mililitros de solução salina. Para dissecar a região de amnion placentária, use uma gaze de algodão estéril para remover os coágulos sanguíneos da superfície do acorde/amnion que cobre a placenta.E usar fórceps dissecando para agarrar a membrana na fronteira entre a placenta e a região refletida. Use um bisturi para cortar ao longo da circunferência da placenta e separar o amônio placentário do acorde, tomando cuidado para não cortar nenhum vaso da placenta. Coloque o tecido separado em outro béquer rotulado com 300 mililitros de solução salina.E separe o resto da membrana amniótica que não está ligada à placenta do acorde. Em seguida, coloque a região refletida em outro béquer rotulado com 300 mililitros de solução salina. Para lavar as membranas, use pinças para colocá-las em uma superfície estéril para poder descartar a solução salina de cada recipiente de tecido.Coloque as membranas de volta no recipiente e adicione 100 mililitros de solução salina fresca à região umbilical e 300 mililitros de solução salina fresca para as regiões placentárias e refletidas. Use fórceps dissecando para agitar as membranas para remover qualquer resíduo sanguíneo e colocar as membranas na superfície estéril para poder descartar as soluções salinas. Em seguida, lave as membranas pelo menos mais duas vezes, como apenas demonstrado, até que os tecidos sejam translúcidos.Para digestão enzimática das diferentes regiões de membrana amniótica, corte as regiões refletidas e placentárias em dois ou três fragmentos. E coloque os fragmentos e a região umbilical em tubos de centrífuga individuais de 50 mililitros. Adicione 20 mililitros de 0,5% trypsin-EDTA a cada tubo de fragmentos de tecido refletido e placentário da região e cinco mililitros de 0,5% trypsin-EDTA ao tubo contendo o tecido da região umbilical.Agite os tubos suavemente por 30 segundos. Em seguida, coloque as membranas em uma superfície estéril, descartando a solução trypsin-EDTA e substitua-as por 30 mililitros de 0,5% de trippsina-EDTA fresca para os fragmentos de tecido refletido e placentário da região e 15 mililitros de 0,5% trypsin-EDTA frescos para o tecido da região umbilical. Em seguida, coloque os tubos em uma rotadora dentro de uma incubadora para uma rotação de 40 minutos a 20 rotações por minuto a 37 graus Celsius.No final da incubação, transfira todo o volume da solução celular para novos tubos cônicos. E adicione duas vezes o volume de células AE humanas de 37 graus Celsius médias a cada tubo no gelo. Digerir quaisquer fragmentos de tecido remanescentes nos tubos originais com 0,5% de trippsina-EDTA fresco, como apenas demonstrado.No final da segunda digestão, use um par de fórceps dissecando para segurar uma extremidade da porção de amnion e um segundo par de fórceps dissecando para espremer ao longo do tecido restante para remover quaisquer fileiras de células epiteliais que não se descascaram completamente durante os períodos anteriores de incubação. Em seguida, remova as membranas para poder transferir a segunda solução de digestão para um segundo conjunto de tubos de centrífuga. E inativar as enzimas de digestão com duas vezes o volume de uma célula humana AE de 37 graus Celsius no gelo.Para o isolamento das células AE humanas, sedimentar as células por centrifugação. E resuspenque a pelota em cada tubo com 10 mililitros de um meio de célula AE humano fresco de 37 graus Celsius. Puxe cada par de digestões em um único tubo e filtre as suspensões através de filtros de 100 micrômetros para remover quaisquer detritos de matriz extracelular.Após a contagem, semeou as células AE humanas de cada uma das três regiões em placas individuais de 100 milímetros a três vezes 10 para as quatro células por cento centímetros de concentração ao quadrado em 37 graus Celsius humanos AE cell medium, complementado com 10 nanogramas por mililitro do fator de crescimento epidérmico humano. Em seguida, incubar as culturas a 37 graus Celsius sob condições normóxidas em uma incubadora umidificada até a análise a jusante do interesse. Após 48 horas de cultura, células humanas de EA com um fenótipo epitelial aderem à superfície da placa, enquanto o supernaspeso contém detritos celulares e células flutuantes que podem ser removidos assim que o meio é alterado.É aconselhável descartar as culturas e processar outra membrana ao identificar a presença de contaminação bacteriana, eritrócitos excessivos devido à lavagem insuficiente das membranas, células deficientes ou não aadeentes, ou células com morfologia fibroblasto. A morfologia das células AE humanas depende da origem das células, pois as células da zona refletida demonstram uma morfologia cuboidal e crescem em uma monocamada de paralelepípedos, e as células das regiões placentárias e umbilicais são mais planas e escamosas. A imunofluorescência contra a e-cadherina revela que as culturas primárias e subculturas mantêm seu fenótipo epitelial, sugerindo que não há contaminação de outro tipo de célula.Além disso, as células são viáveis, como evidenciado por sua expressão do marcador de proliferação Ki-67. Embora as subpopulações da amnion diferem em sua morfologia e função, a expressão e presença do núcleo dos fatores pluripotência não muda nas células AE humanas derivadas das regiões placentárias e refletidas. Uma vez que as células epiteliais amnióticas humanas são uma possível fonte de células-tronco pluripotentes, podemos desafiá-las através de uma linha de protocolos de definição específicos para elucidar se essas células de cada região têm potenciais diferentes.Antes de um protocolo iniciado, revise o histórico médico do paciente para ter certeza de que o tecido não apresenta características microbiológicas de infecção.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Biologia do Desenvolvimento

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Desenvolvimento de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensaio para avaliar contrátil Função de células mesenquimais que a transição epitelial-mesenquimal Sofreu

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Produção em larga escala de cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas utilizando um altamente reprodutível pequeno-Based Molecule Protocolo de Diferenciação

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Isolamento de rato Endometrial epiteliais e estromais para células<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualization

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Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

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Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

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The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

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Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...