Name: in vitro culture of epithelial cells from different anatomical regions of the human amniotic membrane
Uploaded: 2019-11-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane at JoVE.com

Наше исследование было поддержано грантами Национального института Перинатологии Мексики (21041 и 21081) и CONACYT (A1-S-8450 и 252756). Мы благодарим Джессику Гонсалес Норрис и Лидию Юририю Паредес Вивас за техническую поддержку.

Этот протокол был одобрен комитетом по этике Национального института Перинатологии в Мехико (номер реестра 212250-21041). Все процедуры, проведенные в этих исследованиях, соответствовали этическим стандартам Национального института перинатологии, Хельсинкской декларации и руководящим пр?...

<ol>
	<li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li><li>Garcia-Lopez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amniotic+epithelium+(HAE)+as+a+possible+source+of+stem+cells+(SC).">Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC).</a> Gaceta Medica de Mexico. 151 (1), 66-74 (2015).</li><li>Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Human+Amnion+Epithelial+Cells+According+to+Current+Good+Manufacturing+Procedures.">Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).</li><li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amnion+epithelial+cell+isolation+and+characterization+for+clinical+use.">Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).</li><li>Garcia-Castro, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+Pluripotency+in+Human+Amniotic+Epithelial+Cells+and+Their+Differentiation+to+Progenitor+of+Cortical+Neurons.">Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons.</a> PLoS One. 10 (12), 0146082 (2015).</li><li>Garcia-Lopez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+markers+in+tissue+and+cultivated+cells+in+vitro+of+different+regions+of+human+amniotic+epithelium.">Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium.</a> Experimental Cell Research. 375 (1), 31-41 (2019).</li><li>Yang, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+characterization+of+human+amniotic+epithelial+cells+in+a+serum-free+system+and+their+safety+evaluation.">Biological characterization of human amniotic epithelial cells in a serum-free system and their safety evaluation.</a> Acta Pharmacological Sinica. 39 (8), 1305-1316 (2018).</li><li>Zou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA32+silences+WWP2+expression+to+maintain+the+pluripotency+of+human+amniotic+epithelial+stem+cells+and+beta+isletlike+cell+differentiation.">MicroRNA32 silences WWP2 expression to maintain the pluripotency of human amniotic epithelial stem cells and beta isletlike cell differentiation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 41 (4), 1983-1991 (2018).</li><li>Avila-Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+ephemeral+human+pluripotent+state.">Capturing the ephemeral human pluripotent state.</a> Developmental Dynamics. 245 (7), 762-773 (2016).</li><li>Niknejad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+amniotic+membrane+for+potential+use+in+tissue+engineering.">Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering.</a> European Cells &amp; Materials. 15, 88-99 (2008).</li><li>Miki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+characteristics+and+the+therapeutic+potential+of+amniotic+epithelial+cells.">Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 80 (4), 13003 (2018).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+proliferation,+migration+and+angiogenic+properties+of+human+amniotic+epithelial+and+mesenchymal+stem+cells+and+their+effects+on+endothelial+cells.">Comparison of the proliferation, migration and angiogenic properties of human amniotic epithelial and mesenchymal stem cells and their effects on endothelial cells.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 918-926 (2017).</li><li>Hammer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amnion+epithelial+cells,+in+contrast+to+trophoblast+cells,+express+all+classical+HLA+class+I+molecules+together+with+HLA-G.">Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I molecules together with HLA-G.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 37 (2), 161-171 (1997).</li><li>Benirschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+Pathology+of+the+Placental+Membranes.">Anatomy and Pathology of the Placental Membranes.</a> Pathology of the Human Placenta. , 268-318 (1995).</li><li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+metabolic+activity+in+placental+and+reflected+regions+of+the+human+amniotic+membrane.">Different metabolic activity in placental and reflected regions of the human amniotic membrane.</a> Placenta. 36 (11), 1329-1332 (2015).</li><li>Kim, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-143+regulation+of+prostaglandin-endoperoxidase+synthase+2+in+the+amnion:+implications+for+human+parturition+at+term.">miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term.</a> PLoS One. 6 (9), 24131 (2011).</li><li>Han, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+gene+expression+profiling:+novel+evidence+for+biological+heterogeneity+of+the+human+amnion.">Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heterogeneity of the human amnion.</a> Biology of Reproduction. 79 (5), 954-961 (2008).</li><li>Alcaraz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+TGF-beta+induces+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+human+amniotic+epithelial+cells.">Autocrine TGF-beta induces epithelial to mesenchymal transition in human amniotic epithelial cells.</a> Cell Transplantation. 22 (8), 1351-1367 (2013).</li><li>Canciello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+prevents+epithelial-mesenchymal+transition+of+ovine+amniotic+epithelial+cells+and+enhances+their+immunomodulatory+properties.">Progesterone prevents epithelial-mesenchymal transition of ovine amniotic epithelial cells and enhances their immunomodulatory properties.</a> Scientific Reports. 7 (1), 3761 (2017).</li><li>Canciello, A., Greco, L., Russo, V., Barboni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+Epithelial+Cell+Culture.">Amniotic Epithelial Cell Culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1817, 67-78 (2018).</li><li>Singh, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+network+crosstalk+in+human+pluripotent+cells:+a+Smad2/3-regulated+switch+that+controls+the+balance+between+self-renewal+and+differentiation.">Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 312-326 (2012).</li><li>Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Focal+Adhesion+Kinase+Signaling+by+Integrin+alpha6beta1+Supports+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Self-Renewal.">Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal.</a> Stem Cells. 34 (7), 1753-1764 (2016).</li><li>Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+regional+distribution+of+aquaporins+in+amnion+of+normal+and+gestational+diabetic+pregnancies.">Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies.</a> Physiological Reports. 3 (3), 12320 (2015).</li><li>Avila-Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amniotic+epithelial+cells+as+feeder+layer+to+derive+and+maintain+human+embryonic+stem+cells+from+poor-quality+embryos.">Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos.</a> Stem Cell Research. 15 (2), 322-324 (2015).</li></ol>

Мы внедрили новый протокол для изоляции HAEC от терминовых мембран. Он отличается от предыдущих докладов в том, что каждая мембрана была разделена на три анатомических регионов до изоляции для анализа клеток от каждого из них.
Одним из наиболее важных шагов в протоколе явл?...

Клетки амниотического эпителия человека (HAEC) возникают на ранних стадиях эмбрионального развития, примерно в восемь дней послеоплодизации. Они возникают из популяции плоскоклеточных эпителиальных клеток эпибласта, которые вытекают из внутреннего слоя амниотической мембраны1. Таким образом, HAEC считаются остатками плюрипотентных клеток из эпибласта, которые имеют потенциал, чтобы дифференцироваться в три слоя зародыша эмбриона2. В последнее десятилетие, различные исследовательские группы разработали методы, чтобы изолировать эти клетки от амниотической мембраны в срок беременности, чтобы охарактеризовать их предполагаемых плюрипотентных свойств, связанных с культурой в пробирке3,4.
Соответственно, было установлено, что HAEC особенность черты, характерные для человека плюрипотентных стволовых клеток (HPSC), таких как поверхностные антигены SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; ядро факторов транскрипции pluripotency OCT4, SOX2 и NANOG; и маркер распространения KI67, предполагая, что они самообновляются5,6,7. Кроме того, эти клетки были оспорены с помощью протоколов дифференциации для получения клеток, положительных для линейных конкретных маркеров трех слоев микробов (эктодерм, мезодерм, и эндодерм)4,5,8, а также в животных моделей человеческих заболеваний. Наконец, HAEC выразить E-кадерин, которые демонстрируют, что они сохраняют эпителиальный характер так же, как HPSC5,9.
Помимо их эмбрионального происхождения, HAEC имеют другие свойства, которые делают их пригодными для различных клинических применений, таких как секреция противовоспалительных и антибактериальных молекул10,11, факторы роста и цитокинов релиз12, не образование тератомы, когда они пересажены в иммунодефицитных мышей в отличие от HPSC2, и иммуно-толерной толерантности, потому что они выражают HLA-G отказ, который трансплантация13.
Однако, предыдущие доклады предполагали, что амнион человека является однородной мембраной, не учитывая, что она может быть анатомически и физиологически разделена на три области: плацентарный (амнион, который охватывает decidua базалис),пупочная (часть, которая обволакивает пуповину), и отражается (остальная часть мембраны не прилагается к плаценте)14. Было показано, что плацентарные и отраженные области амниона отображают различия в морфологии, митохондриальной активности, обнаружении реактивных видов кислорода15, выражении миРНК16, и активации сигнальных путей17. Эти результаты свидетельствуют о том, что амнион человека интегрируется в разнородную популяцию с различной функциональностью, которая должна быть рассмотрена для дальнейших исследований, проведенных в situ или in vitro моделей. В то время как другие лаборатории разработали протоколы для изоляции HAEC от всей мембраны, наша лаборатория разработала протокол для изоляции, культуры и характеристики клеток из различных анатомических регионов.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>55 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>12430054</td>
			<td>Supplemented with high glucose and HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Ambion</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>0.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonic stem-cell FBS, qualified</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>10439024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution (sodium chloride 0.9%)</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>with conical bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 &#181;l, 200 &#181;l and 10 &#181;l.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton gauzes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical gloves</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Pipet Filler/Dispenser</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile beakers of 500 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic cutting board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile stainless steel container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tray</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>MaCSmix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies and Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Antibody ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-cadherin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td>RRID:AB_3975</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KI67</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>23900</td>
			<td>RRID:AB_627859)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NANOG</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>500-P236</td>
			<td>RRID:AB_1268274</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OCT4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab19857</td>
			<td>RRID:AB_44517</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5603</td>
			<td>RRID:AB_2286686</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SSEA-4</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4755</td>
			<td>RRID:AB_1264259</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRA-1-60</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4746</td>
			<td>RRID:AB_2119059</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>RRID:AB_2534088</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11036</td>
			<td>RRID:AB_10563566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunel Assay Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>66110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro culture of epithelial cells from different anatomical regions of the human amniotic membrane

Несколько протоколов были зарегистрированы в литературе для изоляции и культуры человека амниотических эпителиальных клеток (HAEC). Однако они предполагают, что амниотический эпителий является однородным слоем. Амнион человека можно разделить на три анатомические области: отраженную, плацентарную и пупочную. Каждый регион имеет различные физиологические роли, например, в патологических условиях. Здесь мы описываем протокол для вскрытия ткани амниона человека в трех разделах и поддерживать его в пробирке. В культуре клетки, полученные из отраженного амниона, отображали кубоидальную морфологию, в то время как клетки как из плацентарных, так и из пупочных областей были плоскоклеточными. Тем не менее, все полученные клетки имеют эпителиальный фенотип, продемонстрированный иммунообнаружением E-кадерин. Таким образом, поскольку плацентарные и отраженные области на месте отличаются в клеточных компонентах и молекулярных функциях, может потребоваться для исследования in vitro рассмотреть эти различия, поскольку они могут иметь физиологические последствия для использования HAEC в биомедицинских исследований и перспективного применения этих клеток в регенеративной медицине.

HAEC были выделены из каждого из трех анатомических регионов амниотической мембраны и индивидуально культивируется в пробирке. После 48 ч культуры, клетки с эпителиальным фенотипом прилипли к поверхности пластины, хотя средства массовой информации также содержали мусор клетки и плавающ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane at JoVE.com

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

Этот протокол описывает изоляцию эпителиальных клеток из различных анатомических областей амниотической мембраны человека для определения их неоднородности и функциональных свойств для возможного применения в клинических и физиопатологических моделях.

В vitro Культура эпителиальных клеток из различных анатомических регионов амниотической Мембраны человека

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...

Этот протокол может помочь ответить на ключевые вопросы о неоднородности и функциональных свойствах амниотических эпителиальных клеток человека, изолированных от амниотической мембраны. В то время как предыдущие протоколы изолировали клетки от коамниотической мембраны, не различив между регионами, наш протокол позволяет культуре популяции клеток, изолированных от трех различных анатомических областей. Чтобы отделить амниотическую мембрану по регионам, в кабинете биобезопасности в стерильных условиях, определите пуповину, обволакивающую пуповину, плацентарную амницию, покрывающую базалис decidua, и отраженную область, которая считается остальной частью амниона, который не прикреплен к плаценте.Чтобы вскрыть область пуповины, используйте рассечение типсов, чтобы удерживать часть мембраны амниона, которая покрывает соединение плаценты и пуповины, и использовать скальпель, чтобы вскрыть область, которая окружает шнур, в то время как растяжение, чтобы отделить область от хориона. Затем сдай отделенную ткань в помеченный стакан 100 миллилитров солевого раствора. Чтобы вскрыть плацентарный регион амниона, используйте стерильную хлопчатобумажную марлю, чтобы удалить сгустки крови с поверхности хориона/амниона, который покрывает плаценту.И использовать рассечение типсов, чтобы схватить мембрану на границе между плацентой и отраженной области. Используйте скальпель, чтобы сократить вдоль окружности плаценты и отделить плацентарный амнион от хориона, будучи осторожным, чтобы не вырезать любые сосуды из плаценты. Поместите отделенную ткань в другой помеченный стакан с 300 миллилитров солевого раствора.И отделить остальную часть амниотической мембраны, которая не прикреплена к плаценте от хориона. Затем поместите отраженную область в другой помеченный стакан с 300 миллилитров солевого раствора. Для мытья мембран используйте пинцет, чтобы поместить их на стерильную поверхность, чтобы иметь возможность отказаться от солевого раствора из каждого контейнера ткани.Поместите мембраны обратно в контейнер и добавьте 100 миллилитров свежего солевого раствора в область пупочной и 300 миллилитров свежего солевого раствора в плацентарные и отраженные области. Используйте рассечение типсов, чтобы перемешать мембраны, чтобы удалить остатки крови и поместить мембраны на стерильной поверхности, чтобы иметь возможность отказаться от солевые растворы. Затем, мыть мембраны по крайней мере еще два раза, как только что показали, пока ткани полупрозрачные.Для энзиматического пищеварения различных областей амниотической мембраны, разрежьте отраженные и плацентарный области на два или три фрагмента. И поместите фрагменты и пуповину в отдельные 50-миллилитровые центрифуги труб. Добавьте 20 миллилитров 0,5%трипсина-ЭДТА к каждой трубке отраженных и плацентарных фрагментов тканей области и пять миллилитров 0,5%трипсина-ЭДТА к трубке, содержащей ткани пуповинной области.Встряхните трубки осторожно в течение 30 секунд. Затем поместите мембраны на стерильную поверхность, отбрасывая раствор трипсина-ЭДТА и замените его 30 миллилитров свежего 0,5%трипсина-ЭДТА для отраженных и плацентарных фрагментов тканей области и 15 миллилитров свежих 0,5%трипсина-ЭДТА для ткани пупочной области. Затем поместите трубки в ротатор внутри инкубатора для 40-минутного вращения при 20 вращениях в минуту при 37 градусах цельсия.В конце инкубации перенесите весь объем клеточного раствора в новые конические трубки. И добавить в два раза объем 37-градусного Цельсия человеческих клеток АЕ среднего к каждой трубке на льду. Переварить любые остатки фрагментов ткани в оригинальных трубках со свежим 0,5%трипсин-ЭДТА, как только что показали.В конце второго пищеварения, используйте пару рассечения типсов, чтобы провести один конец части амниона и вторую пару рассечения типсов, чтобы сжать вдоль оставшейся ткани, чтобы удалить любые ряды эпителиальных клеток, которые не полностью отслаиваются в течение предыдущих инкубационных периодов. Затем удалите мембраны, чтобы иметь возможность перенести второй раствор пищеварения во второй набор центрифуг трубки. И инактивировать ферменты пищеварения с в два раза объем свежей 37-градусной-Цельсия человека А.Е. клеточной среды на льду.Для изоляции клеток АЕ, осадок клеток центрифугации. И повторно помесить гранулы в каждой трубке с 10 миллилитров свежих 37-градусных-celsius человека АЕ клеточной среды. Вытяните каждую пару пищеварений в одну трубку и фильтруем подвески через 100-микрометровые ситечко, чтобы удалить любой внеклеточный матричный мусор.После подсчета, семена человеческих клеток АЕ из каждого из трех регионов в отдельных 100-миллиметровых пластин в три раза от 10 до четвертого клетки на сантиметры в квадрате концентрации в 37-градусный цельсий человека АЕ клеточной среды, дополненный 10 нанограмм на миллилитр человеческого эпидермального фактора роста. Затем инкубировать культуры на 37 градусов по Цельсию в нормоксических условиях в увлажненные инкубатор до вниз по течению анализ интереса. После 48 часов культуры, человеческие клетки АЕ с эпителиальным фенотипом прилипают к поверхности пластины, в то время как супернатант содержит клеточный мусор и плавающие клетки, которые могут быть удалены после изменения среды.Целесообразно отказаться от культур и обработать другую мембрану при выявлении наличия бактериального загрязнения, чрезмерного эритроцитов из-за недостаточного мытья мембран, недостаточно или неадхерентных клеток, или клеток с фибробластовой морфологией. Морфология клеток человека АЕ зависит от происхождения клеток, так как клетки из отраженной зоны демонстрируют кубоидную морфологию и растут в мощеном монослойном, а клетки из плацентарный и пуповинной области льстит и плоскоклеточный. Иммунофлюоресценция против Е-кадгерина показывает, что первичные культуры и субкультуры сохраняют свой эпителиальный фенотип, предполагая, что нет загрязнения другого типа клеток.Кроме того, клетки жизнеспособны, о чем свидетельствует их выражение маркера распространения Ки-67. Хотя субпопуляции от амниона отличаются по своей морфологии и функции, экспрессия и присутствие ядра факторов плюрипотенции не меняется в клетках АЕ человека, полученных из плацентарных и отраженных областей. Поскольку амниотические эпителиальные клетки человека являются возможным источником плюрипотентных стволовых клеток, мы можем бросить им вызов с помощью линии конкретных протоколов определения, чтобы выяснить, имеют ли эти клетки из каждого региона различные потенциалы.До начала протокола, обзор истории болезни пациента, чтобы убедиться, что ткань не проявляет микробиологических характеристик инфекции.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Первичный энтодермальная эпителиальной клетки культуры из желтка мембраны японского перепела Эмбрионы

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Развитие<em&gt; In Vitro</em&gt; Анализ для оценки сократительной функции мезенхимальных клеток, перенесшей Эпителиальные-мезенхимальных переходной

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Крупномасштабное производство кардиомиоцитов из человеческих плюрипотентных стволовых клеток с использованием высокой воспроизводимостью Малый протокол Дифференциация Molecule на основе

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Производство плюрипотентных стволовых клеток из амниотической жидкости для мыши клеток с использованием транспозона системы

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Выделение мыши Эндометриальный эпителиальных и стромальных клеток для<em&gt; In Vitro</em&gt; Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Направлено дифференциация примитивные и окончательного гемопоэтических прародителей от человеческих плюрипотентных стволовых клеток

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Перепрограммирование первичной амниотической жидкости и мембраны клеток для плюрипотентности в условиях Xeno бесплатно

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Быстрое, режиссер дифференциация клеток эпителия сетчатки пигмента от человеческого эмбриона или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

Применение системы аорто Гонада мезонефрос экспланта культуры в развитии кроветворения

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Культивирование клеток эпителия сетчатки пигментного модель Ex Vivo мембраны Бруха возрасте человека на

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...