Name: in vitro culture of epithelial cells from different anatomical regions of the human amniotic membrane
Uploaded: 2019-11-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane at JoVE.com

Vår forskning stöddes av bidrag från Instituto Nacional de Perinatología de México (21041 och 21081) och CONACYT (a1-S-8450 och 252756). Vi tackar Jessica González Norris och Lidia Yuriria Paredes Vivas för teknisk support.

Detta protokoll godkändes av etikkommittén för Instituto Nacional de Perinatología i Mexico City (registreringsnummer 212250-21041). Alla förfaranden som utfördes i dessa studier var förenliga med de etiska normerna för Instituto Nacional de Perinatología, Helsingforsdeklarationen, och de riktlinjer som anges i hälsoministeriets officiella mexikanska standard.
1. förberedelser
<ol><li>Bered en lösning av 1x PBS med EDTA. För att göra detta, tillsätt 500 μL av 0,5 M EDTA-best?...

<ol>
	<li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li><li>Garcia-Lopez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amniotic+epithelium+(HAE)+as+a+possible+source+of+stem+cells+(SC).">Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC).</a> Gaceta Medica de Mexico. 151 (1), 66-74 (2015).</li><li>Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Human+Amnion+Epithelial+Cells+According+to+Current+Good+Manufacturing+Procedures.">Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).</li><li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amnion+epithelial+cell+isolation+and+characterization+for+clinical+use.">Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).</li><li>Garcia-Castro, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+Pluripotency+in+Human+Amniotic+Epithelial+Cells+and+Their+Differentiation+to+Progenitor+of+Cortical+Neurons.">Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons.</a> PLoS One. 10 (12), 0146082 (2015).</li><li>Garcia-Lopez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+markers+in+tissue+and+cultivated+cells+in+vitro+of+different+regions+of+human+amniotic+epithelium.">Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium.</a> Experimental Cell Research. 375 (1), 31-41 (2019).</li><li>Yang, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+characterization+of+human+amniotic+epithelial+cells+in+a+serum-free+system+and+their+safety+evaluation.">Biological characterization of human amniotic epithelial cells in a serum-free system and their safety evaluation.</a> Acta Pharmacological Sinica. 39 (8), 1305-1316 (2018).</li><li>Zou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA32+silences+WWP2+expression+to+maintain+the+pluripotency+of+human+amniotic+epithelial+stem+cells+and+beta+isletlike+cell+differentiation.">MicroRNA32 silences WWP2 expression to maintain the pluripotency of human amniotic epithelial stem cells and beta isletlike cell differentiation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 41 (4), 1983-1991 (2018).</li><li>Avila-Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+ephemeral+human+pluripotent+state.">Capturing the ephemeral human pluripotent state.</a> Developmental Dynamics. 245 (7), 762-773 (2016).</li><li>Niknejad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+amniotic+membrane+for+potential+use+in+tissue+engineering.">Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering.</a> European Cells &amp; Materials. 15, 88-99 (2008).</li><li>Miki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+characteristics+and+the+therapeutic+potential+of+amniotic+epithelial+cells.">Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 80 (4), 13003 (2018).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+proliferation,+migration+and+angiogenic+properties+of+human+amniotic+epithelial+and+mesenchymal+stem+cells+and+their+effects+on+endothelial+cells.">Comparison of the proliferation, migration and angiogenic properties of human amniotic epithelial and mesenchymal stem cells and their effects on endothelial cells.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 918-926 (2017).</li><li>Hammer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amnion+epithelial+cells,+in+contrast+to+trophoblast+cells,+express+all+classical+HLA+class+I+molecules+together+with+HLA-G.">Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I molecules together with HLA-G.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 37 (2), 161-171 (1997).</li><li>Benirschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+Pathology+of+the+Placental+Membranes.">Anatomy and Pathology of the Placental Membranes.</a> Pathology of the Human Placenta. , 268-318 (1995).</li><li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+metabolic+activity+in+placental+and+reflected+regions+of+the+human+amniotic+membrane.">Different metabolic activity in placental and reflected regions of the human amniotic membrane.</a> Placenta. 36 (11), 1329-1332 (2015).</li><li>Kim, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-143+regulation+of+prostaglandin-endoperoxidase+synthase+2+in+the+amnion:+implications+for+human+parturition+at+term.">miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term.</a> PLoS One. 6 (9), 24131 (2011).</li><li>Han, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+gene+expression+profiling:+novel+evidence+for+biological+heterogeneity+of+the+human+amnion.">Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heterogeneity of the human amnion.</a> Biology of Reproduction. 79 (5), 954-961 (2008).</li><li>Alcaraz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+TGF-beta+induces+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+human+amniotic+epithelial+cells.">Autocrine TGF-beta induces epithelial to mesenchymal transition in human amniotic epithelial cells.</a> Cell Transplantation. 22 (8), 1351-1367 (2013).</li><li>Canciello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+prevents+epithelial-mesenchymal+transition+of+ovine+amniotic+epithelial+cells+and+enhances+their+immunomodulatory+properties.">Progesterone prevents epithelial-mesenchymal transition of ovine amniotic epithelial cells and enhances their immunomodulatory properties.</a> Scientific Reports. 7 (1), 3761 (2017).</li><li>Canciello, A., Greco, L., Russo, V., Barboni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+Epithelial+Cell+Culture.">Amniotic Epithelial Cell Culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1817, 67-78 (2018).</li><li>Singh, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+network+crosstalk+in+human+pluripotent+cells:+a+Smad2/3-regulated+switch+that+controls+the+balance+between+self-renewal+and+differentiation.">Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 312-326 (2012).</li><li>Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Focal+Adhesion+Kinase+Signaling+by+Integrin+alpha6beta1+Supports+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Self-Renewal.">Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal.</a> Stem Cells. 34 (7), 1753-1764 (2016).</li><li>Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+regional+distribution+of+aquaporins+in+amnion+of+normal+and+gestational+diabetic+pregnancies.">Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies.</a> Physiological Reports. 3 (3), 12320 (2015).</li><li>Avila-Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amniotic+epithelial+cells+as+feeder+layer+to+derive+and+maintain+human+embryonic+stem+cells+from+poor-quality+embryos.">Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos.</a> Stem Cell Research. 15 (2), 322-324 (2015).</li></ol>

Vi genomförde ett nytt protokoll för att isolera HAEC från term membranen. Det skiljer sig från tidigare rapporter i att varje membran delades in i sina tre anatomiska regioner före isolering för att analysera celler från var och en.
En av de mest kritiska stegen i protokollet är tvättning av membranet för att ta bort alla blodproppar, eftersom de kan störa aktiviteten av trypsin när separera epitelceller. Underlåtenhet att genomföra detta steg på rätt sätt kan leda till att f...

Mänskliga amniotiska epitelceller (HAEC) har sitt ursprung under de tidiga stadierna av embryonal utveckling, på cirka åtta dagar postfertilisering. De uppstår från en population av skivepitelcancer epitelial celler av epiblast som härrör från det innersta skiktet av fosterhinnan1. Således anses HAEC rester av pluripotenta celler från epiblast som har potential att differentiera till de tre bakterie lagren av embryot2. Under det senaste decenniet har olika forskargrupper utvecklat metoder för att isolera dessa celler från fosterhinnan på graviditetstiden för att karakterisera deras presumtiva pluripotens-relaterade egenskaper i en kultur modell in vitro3,4.
Följaktligen har det visat sig att HAEC har karakteristiska egenskaper hos humana pluripotenta stamceller (HPSC), såsom ytantigener SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; kärnan i pluripotensen transkription faktorer OCT4, SOX2, och NANOG; och spridningen markör KI67, vilket tyder på att de är självförnyande5,6,7. Dessutom har dessa celler ifrågasatts med hjälp av differentierings protokoll för att få celler positiva för härstamnings specifika markörer av de tre bakterie lagren (ektoderm, mesoderm och endoderm)4,5,8, samt i djurmodeller av mänskliga sjukdomar. Slutligen, haec Express E-cadherin, som visar att de behåller en epitelial natur ungefär som hpsc5,9.
Bortsett från deras embryonala ursprung, haec har andra inneboende egenskaper som gör dem lämpliga för olika kliniska tillämpningar, såsom utsöndringen av antiinflammatoriska och antibakteriella molekyler10,11, tillväxtfaktorer och cytokin release12, ingen bildning av Teratomu när de transplanteras in i immunobristfällig möss i motsats till hpsc2, och immunologisk tolerans eftersom de uttrycker HLA-G, vilket minskar risken för avstötning efter transplantation13.
Tidigare rapporter har dock antagit att den mänskliga Amnion är ett homogent membran, utan att anse att det kan vara anatomiskt och fysiologiskt uppdelad i tre regioner: placentabarriären (den Amnion som täcker decidua basalis), navelsträngen (den del som omsluter navelsträngen), och reflekteras (resten av membranet inte bifogas moderkakan)14. Det har visats att placenta och reflekterade regioner i Amnion uppvisar skillnader i morfologi, mitokondriell aktivitet, detektion av reaktiva syreradikaler15, Mirna-uttryck16, och aktivering av signaleringsvägar17. Dessa resultat tyder på att den mänskliga Amnion är integrerad av en heterogen population med olika funktioner som bör övervägas för ytterligare studier som utförs i antingen in situ eller in vitro-modeller. Medan andra laboratorier har utformat protokoll för isolering av HAEC från hela membranet, har vårt laboratorium etablerat ett protokoll för att isolera, kultur och karakterisera celler från olika anatomiska regioner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>55 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>12430054</td>
			<td>Supplemented with high glucose and HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Ambion</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>0.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonic stem-cell FBS, qualified</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>10439024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution (sodium chloride 0.9%)</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>with conical bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 &#181;l, 200 &#181;l and 10 &#181;l.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton gauzes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical gloves</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Pipet Filler/Dispenser</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile beakers of 500 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic cutting board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile stainless steel container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tray</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>MaCSmix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies and Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Antibody ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-cadherin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td>RRID:AB_3975</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KI67</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>23900</td>
			<td>RRID:AB_627859)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NANOG</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>500-P236</td>
			<td>RRID:AB_1268274</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OCT4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab19857</td>
			<td>RRID:AB_44517</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5603</td>
			<td>RRID:AB_2286686</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SSEA-4</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4755</td>
			<td>RRID:AB_1264259</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRA-1-60</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4746</td>
			<td>RRID:AB_2119059</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>RRID:AB_2534088</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11036</td>
			<td>RRID:AB_10563566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunel Assay Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>66110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro culture of epithelial cells from different anatomical regions of the human amniotic membrane

Flera protokoll har rapporterats i litteraturen för isolering och kultur av mänskliga amniotiska epitelceller (HAEC). Emellertid, dessa förutsätter att fostervattnet epitel är ett homogent skikt. Den mänskliga Amnion kan delas in i tre anatomiska regioner: återspeglas, Placental, och navel. Varje region har olika fysiologiska roller, såsom vid sjukdomstillstånd. Här beskriver vi ett protokoll för att dissekera Human Amnion vävnad i tre sektioner och bibehålla den in vitro-. I kulturen, celler som härrör från den reflekterade Amnion visade en det morfologi, medan celler från både placenta och navel regioner var skivepitelcancer. Icke desto mindre, alla celler som erhålls har en epitelial fenotyp, påvisas genom immunodetection av E-cadherin. Därför, eftersom placenta och reflekterade regioner på plats skiljer sig i cellulära komponenter och molekylära funktioner, det kan vara nödvändigt för in vitro-studier att överväga dessa skillnader, eftersom de kan ha fysiologiska konsekvenser för användning av HAEC i biomedicinsk forskning och lovande tillämpning av dessa celler i regenerativ medicin.

HAEC isolerades från var och en av de tre anatomiska regionerna i fosterhinnan och individuellt odlade in vitro. Efter 48 h av kultur, celler med en epitelial fenotyp anslutit sig till ytan av plattan, även om medierna innehöll också cellfragment och flytande celler, som togs bort när mediet ändrades (figur 3).
Under bearbetningen av primärkulturen (passage Zero, P0) kan vissa komplikationer uppstå som kan störa den experimentella dataanalysen (<strong cl...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane at JoVE.com

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

Detta protokoll beskriver isoleringen av epitelceller från olika anatomiska regioner i människans foster membran för att bestämma deras heterogenitet och funktionella egenskaper för eventuell applicering i kliniska och fysiopatologiska modeller.

In vitro-kultur av epitelceller från olika anatomiska regioner i det mänskliga fosterhinnan

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...

Detta protokoll kan hjälpa till att besvara viktiga frågor om heterogenitet och funktionella egenskaper hos mänskliga fosterhinna epitelceller isolerade från fosterhinnan membran. Medan tidigare protokoll isolerade celler från co-fosterhinnan membran utan att urskilja mellan regioner, tillåter vårt protokoll kulturen av cellpopulationen isolerade från tre distinkta anatomiska regioner. För att separera fosterhinnan efter region, i en biosäkerhet skåp under sterila förhållanden, identifiera naveln amnion omsluter navelsträngen, placenta amnion som täcker decidua basalis, och den reflekterade regionen, som anses vara resten av amnion som inte är fäst vid moderkakan.För att dissekera regionen umbilical amnion, använd dissekera tång för att hålla den del av amnionmembranet som täcker korsningen av moderkakan och navelsträngen, och använd en skalpell för att dissekera regionen som omger sladden, medan sträcker sig för att skilja regionen från chorion. Sedan, deponera den separerade vävnaden i en märkt bägare med 100 milliliter saltlösning. För att dissekera regionen placenta amnion, använd en steril bomullsgasväv för att avlägsna blodpropparna från ytan av den chorion/amnion som täcker moderkakan.Och använd dissekera tlysningar för att greppa membranet på gränsen mellan moderkakan och den reflekterade regionen. Använd en skalpell för att skära längs moderkakans omkrets och separera placentaamnion från chorion, var noga med att inte skära några fartyg från moderkakan. Placera den separerade vävnaden i en annan märkt bägare med 300 milliliter saltlösning.Och separera resten av fosterhinnan som inte är fäst vid moderkakan från chorion. Placera sedan den reflekterade regionen i en annan märkt bägare med 300 milliliter saltlösning. För att tvätta membranen, använd pincetter för att placera dem på en steril yta för att kunna kassera saltlösningen från varje behållare av vävnad.Placera tillbaka membranen i behållaren och tillsätt 100 milliliter färsk saltlösning till navelregionen och 300 milliliter färsk saltlösning till placenta och reflekterade regioner. Använd dissekerings-forceps för att röra om i membranen för att avlägsna eventuella blodrester och placera membranen på den sterila ytan för att kunna kassera saltlösningslösningarna. Sedan, tvätta membranen minst två gånger, som bara visat, tills vävnaderna är genomskinliga.För enzymatisk matsmältning av de olika fosterhinnan membran regioner, skär de reflekterade och placenta regioner i två eller tre fragment. Och placera fragmenten och navelregionen i individuella centrifugrör på 50 milliliter. Lägg till 20 milliliter av 0,5%trypsin-EDTA till varje rör av reflekterade och moderkakan regionen vävnad fragment och fem milliliter av 0,5%trypsin-EDTA till röret som innehåller navelregionen vävnad.Skaka rören försiktigt i 30 sekunder. Placera sedan membranen på en steril yta, kassera trypsin-EDTA-lösningen och ersätt den med 30 milliliter färska 0,5%trypsin-EDTA för den reflekterade och placentaregionen vävnadsfragment och 15 milliliter av färska 0,5%Trypsin-EDTA för navelvävnadsregionen. Placera sedan rören i en rotator inuti en inkubator för en 40-minuters rotation vid 20 rotationer per minut vid 37 grader Celsius.Vid slutet av inkubationen överför du hela volymen av celllösningen till nya koniska rör. Och tillsätt två gånger volymen av 37-graders-Celsius mänskliga AE-celler medium till varje rör på is. Digest eventuella överblivna vävnad fragment i de ursprungliga rören med färska 0,5%trypsin-EDTA, som just visat.I slutet av den andra matsmältningen, använd ett par dissekerande forceps för att hålla ena änden av amniondelen och ett andra par dissekerande forceps för att pressa längs den återstående vävnaden för att avlägsna eventuella rader av epitelceller som inte helt lossnade under de föregående inkubationsperioderna. Ta sedan bort membranen för att kunna överföra den andra matsmältningslösningen till en andra uppsättning centrifugrör. Och inaktivera rötningsenzymerna med två gånger volymen av färskt 37-graders-Celsiust humant AE-cellmedium på is.För human AE-cellisolering, sedimentera cellerna genom centrifugering. Och resuspend pelleten i varje rör med 10 milliliter färska 37-graders-Celsius mänskliga AE cell medium. Dra varje par av matsmältningar i ett enda rör och filtrera suspensioner genom 100-mikrometer silar för att ta bort extracellulära matris skräp.Efter att ha räknat, utsäde de mänskliga AE-celler från var och en av de tre regionerna i enskilda 100-millimeters plattor vid en tre gånger 10 till den fjärde celler per centimeter kvadratkoncentration i 37-graders-Celsius mänskliga AE cell medium, kompletteras med 10 nanogram per milliliter av mänskliga epidermal tillväxtfaktor. Sedan, inkubera kulturerna vid 37 grader Celsius under normoxiska förhållanden i en befuktad inkubator tills nedströms analys av intresse. Efter 48 timmars odling, mänskliga AE-celler med en epitelial fenotyp vidhäfta ytan av plattan, medan supernatanten innehåller cellskräp och flytande celler som kan tas bort när mediet ändras.Det är lämpligt att kassera kulturerna och bearbeta ett annat membran vid identifiering av förekomsten av bakteriell kontaminering, överdriven erytrocyter på grund av otillräcklig tvättning av membranen, bristfälligt eller nonadherent celler, eller celler med en fibroblast morfologi. Human AE cell morfologi beror på ursprunget av cellerna, som celler från den reflekterade zonen visar en cuboidal morfologi och växa i en kullerstensbelagda monolayer, och celler från placenta och navelregioner är plattare och skiveplädrar. Immunofluorescens mot E-cadherin avslöjar att de primära kulturerna och subkulturerna behåller sin epitelial fenotyp, vilket tyder på att det inte finns någon förorening av en annan celltyp.Dessutom är cellerna livskraftiga, vilket framgår av deras uttryck för Ki-67 spridning markör. Även om subpopulationerna från amnionen skilja sig åt i deras morfologi och fungerar, ändrar uttryckt och närvaro av kärna ur av pluripotencyen dela upp i faktorer inte i människa AE-celler som härleds från de placenta och reflekterade regionerna. Eftersom mänskliga fostervattensceller är en möjlig källa till pluripotenta stamceller, kan vi utmana dem genom en rad specifika definitionsprotokoll för att klarlägga om dessa celler från varje region har olika potentialer.Tidigare till ett påbörjat protokoll, granska patientens sjukdomshistoria för att vara säker på att vävnaden uppvisar inga mikrobiologiska egenskaper hos infektion.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Primär endodermalt epitelceller Culture från gulesäcken membran av japansk vaktel embryon

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Utveckling av en<em&gt; In Vitro</em&gt; Analys för att utvärdera kontraktila funktion av mesenkymala celler som genomgick Epithelial-Mesenkymala Övergångs

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storskalig produktion av Cardiomyocytes från Human pluripotenta stamceller med hjälp av en mycket reproducerbar liten molekyl baserad differentiering protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Produktionen av pluripotenta stamceller från mus fostervatten celler med användning av en transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolering av Mouse Endometrial epitelceller och stromaceller celler för<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualisering

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Regisserad differentiering av primitiv och slutgiltig hematopoetiska progenitorceller från mänskliga pluripotenta stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Omprogrammering primära fostervatten och membran celler att Pluripotency Xeno-fria förhållanden

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Snabb, regisserad differentiering av Retinal Pigment epitelial celler från mänskliga embryonala eller inducerade pluripotenta stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

Tillämpningen av Aorta-gonad-mesonephros Explant kultur System i utvecklingsmässiga blodbildning

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Odling av Retinal Pigment epitelial celler på en Ex Vivo modell av äldre människors Bruchs membran

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...