Name: nucleofection and in vivo propagation of chicken eimeria parasites
Uploaded: 2020-02-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (2017YFD0501200) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31572507 و 31772728 و 31873007).

وتم إيواء الدجاج لجميع التجارب الحيوانية وصيانته وفقا ً للمبادئ التوجيهية للجنة الرعاية الحيوانية المؤسسية للجامعة الزراعية الصينية واستخدامها، واتبع المبادئ التوجيهية الدولية للبحوث الطبية الحيوية التي تشمل الحيوانات. وقد وافقت لجنة ادارة بكين لالحيوانات المختبرية على هذه التجارب .<...

<ol>
	<li>Suo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+and+economic+benefits+of+Supercox,+a+live+anticoccidial+vaccine+in+a+commercial+trial+in+broiler+chickens+in+China.">The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China.</a> Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).</li><li>Kim, K., Soldati, D., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+replacement+in+Toxoplasma+gondii+with+chloramphenicol+acetyltransferase+as+selectable+marker.">Gene replacement in Toxoplasma gondii with chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker.</a> Science. 262 (5135), 911-914 (1993).</li><li>Sibley, L. D., Messina, M., Niesman, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+DNA+transformation+in+the+obligate+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii+by+complementation+of+tryptophan+auxotrophy.">Stable DNA transformation in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii by complementation of tryptophan auxotrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5508-5512 (1994).</li><li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+molecular+transformation+of+Toxoplasma+gondii:+a+selectable+dihydrofolate+reductase-thymidylate+synthase+marker+based+on+drug-resistance+mutations+in+malaria.">Stable molecular transformation of Toxoplasma gondii: a selectable dihydrofolate reductase-thymidylate synthase marker based on drug-resistance mutations in malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11703-11707 (1993).</li><li>Soldati, D., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+and+expression+in+the+obligate+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii.">Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii.</a> Science. 260 (5106), 349-352 (1993).</li><li>Goonewardene, R., Daily, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+the+malaria+parasite+and+expression+of+firefly+luciferase.">Transfection of the malaria parasite and expression of firefly luciferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5234-5236 (1993).</li><li>Kelleher, M., Tomley, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+of+beta-galactosidase+in+differentiating+sporozoites+of+Eimeria+tenella.">Transient expression of beta-galactosidase in differentiating sporozoites of Eimeria tenella.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 97 (1-2), 21-31 (1998).</li><li>Clark, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+facilitating+stable+transfection+of+Eimeria+species.">A toolbox facilitating stable transfection of Eimeria species.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 162 (1), 77-86 (2008).</li><li>Yan, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transfection+of+Eimeria+tenella:+Constitutive+expression+of+the+YFP-YFP+molecule+throughout+the+life+cycle.">Stable transfection of Eimeria tenella: Constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout the life cycle.</a> International Journal for Parasitology. 39 (1), 109-117 (2009).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+Eimeria+mitis+with+Yellow+Fluorescent+Protein+as+Reporter+and+the+Endogenous+Development+of+the+Transgenic+Parasite.">Transfection of Eimeria mitis with Yellow Fluorescent Protein as Reporter and the Endogenous Development of the Transgenic Parasite.</a> PloS One. 9 (12), e114188 (2014).</li><li>Duan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transfection+of+Eimeria+necatrix+through+nucleofection+of+second+generation+merozoites.">Stable transfection of Eimeria necatrix through nucleofection of second generation merozoites.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. , 1-5 (2019).</li><li>Li, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Eimeria+mitis+expressing+chicken+interleukin+2+stimulated+higher+cellular+immune+response+in+chickens+compared+with+the+wild-type+parasites.">Transgenic Eimeria mitis expressing chicken interleukin 2 stimulated higher cellular immune response in chickens compared with the wild-type parasites.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 533 (2015).</li><li>Clark, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eimeria+species+parasites+as+novel+vaccine+delivery+vectors:+anti-Campylobacter+jejuni+protective+immunity+induced+by+Eimeria+tenella-delivered+CjaA.">Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors: anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeria tenella-delivered CjaA.</a> Vaccine. 30 (16), 2683-2688 (2012).</li><li>Eckert, J., Braun, R., Shirley, M. W., Coudert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eimeria+species+and+strains+of+chickens.">Eimeria species and strains of chickens.</a> Biotechnology: Guidelines on techniques in coccidiosis research. Part. I: Eimeria and Isospora, 1-24 (1995).</li><li>Kurth, M., Entzeroth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+gene+expression+in+cell+culture+stages+and+oocysts+of+Eimeria+nieschulzi+(Coccidia,+Apicomplexa).">Reporter gene expression in cell culture stages and oocysts of Eimeria nieschulzi (Coccidia, Apicomplexa).</a> Parasitology Research. 104 (2), 303-310 (2009).</li><li>Tao, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Eimeria+magna+Perard,+1925+Displays+Similar+Parasitological+Properties+to+the+Wild-type+Strain+and+Induces+an+Exogenous+Protein-Specific+Immune+Response+in+Rabbits+(Oryctolagus+cuniculus+L.).">Transgenic Eimeria magna Perard, 1925 Displays Similar Parasitological Properties to the Wild-type Strain and Induces an Exogenous Protein-Specific Immune Response in Rabbits (Oryctolagus cuniculus L.).</a> Frontiers in Immunology. 8, 2 (2017).</li><li>Shi, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Transfection+of+Eimeria+intestinalis+and+Investigation+of+Its+Life+Cycle,+Reproduction+and+Immunogenicity.">Stable Transfection of Eimeria intestinalis and Investigation of Its Life Cycle, Reproduction and Immunogenicity.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 807 (2016).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+telomerase-interacting+OTU+protein+of+Eimeria+tenella+and+its+telomerase-regulating+activity.">A novel telomerase-interacting OTU protein of Eimeria tenella and its telomerase-regulating activity.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (8), 744-745 (2017).</li><li>Li, J. N., Zou, J., Yin, G. W., Liu, X. Y., Suo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+DNA+could+be+delivered+into+Eimeria+maxima+unsporulated+oocyst+with+gene+gun+system.">Plasmid DNA could be delivered into Eimeria maxima unsporulated oocyst with gene gun system.</a> Acta Polytechnica Hungarica. 60 (4), 431-440 (2012).</li></ol>

في التسعينيات ، تم تطوير نظام نقل للطفيليات المعقدة ، وتم استخدامه لإجراء دراسات على الطفيليات الإميرية. في الآونة الأخيرة ، تم إجراء transfection مستقرة في E. tenella8،9 و E. nieschulzi15. حققنا الترانزفيشن مستقرة من E. necatrix عن طريق transfecting الجيل ال...

تسبب Eimeria spp. الديوك، مما يؤدي إلى خسائر اقتصادية كبيرة في صناعة الماشية والدواجن. على الرغم من أن الأدوية المضادة للأكسيد ، وإلى حد ما ، اللقاحات المضادة للأكسيد ، قد استخدمت على نطاق واسع للسيطرة على الديوكديوسيس ، لا تزال هناك أوجه قصور فيما يتعلق بمقاومتها للأدوية ، ومخلفات الأدوية ، والانتشار المحتمل لسلالات اللقاحات التي تستعيد الفوعة1. مع تطور البيولوجيا الجزيئية ، أصبح الترانزفيشن أداة حيوية لدراسة وظائف الجينات ، وتطوير لقاحات جديدة ، وفحص أهداف الأدوية الجديدة لEimeria.
في العقود الأخيرة ، تم تطبيق الترانفيشن بنجاح لطفيليات apicomplexan مثل Plasmodium و Toxoplasma gondii2،3،4،5،6. دراسة باستخدام α-غال كمراسل للترانزفيشن في E. tenella تجريب مثل هذا العمل في Eimeria7. وكان transfection من E. tenella8،9، E. mitis10، وE. acervulina (تشانغ وآخرون ، والبيانات غير المنشورة) ناجحة في الدجاج. في الآونة الأخيرة ، حققنا transfection باستخدام merozoites من E. necatrix من خلال nucleofection11.
وأظهرت الدراسات أن Eimeria التعبير عن مستضد التغاير لديه القدرة على أن يتم تطويرها كلقاح المؤتلف، مثل تلك التي تعبر عن Campylobacter jejuni مستضد A (CjaA) أو إنترلوكين الدجاج 2 (chIL-2)12،13. لذلك ، يصف هذا البروتوكول دراسة النواة من Eimeria spp. في الدجاج. يصف الإجراء تنقية sporozoites أو merozoites ، النيوكليوفيكتيون مع الحمض النووي البلازميد ، التطعيم الكلوكال / الحقن الوريدي وفي الانتشار في الجسم الحي لمساعدة الباحثين على بدء دراسات على طفيليات إيميريا المعدلة وراثيا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ATP-disodium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A26209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose DE-52</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C8350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Flow Pump</td>
			<td>SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD.</td>
			<td>HL-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>MACGENE</td>
			<td>CM15019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z250473-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>No. V900116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Biotopped</td>
			<td>G6200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>MACGENE</td>
			<td>CC016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>No. V900041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Speed Centrifuge</td>
			<td>BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD.</td>
			<td>DT5-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Mixer</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>MS-H280-Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>449164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo cell sorter</td>
			<td>BeckMan Coulter, US</td>
			<td>201309995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofection device</td>
			<td>LONZA/amaxa</td>
			<td>90900012 (Nucleofector II)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (DG gradient stock solution)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium taurodeoxycholate hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Beijing North TZ-Biotech Develop.co.</td>
			<td>HQ-60-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath Thermostat</td>
			<td>Grant Instruments (Cambridge), Ltd.</td>
			<td>GD120,GM0815010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nucleofection and in vivo propagation of chicken eimeria parasites

Transfection هو عملية تقنية يتم من خلالها تسليم المواد الوراثية ، مثل الحمض النووي الحمض النووي والحمض النووي الريبي المزدوج ، إلى خلايا لتعديل الجين ذي الاهتمام. حاليا، والتكنولوجيا المعدلة وراثيا أصبحت أداة لا غنى عنها لدراسة Eimeria،العوامل المسببة للcoccidiosis في الدواجن والماشية. يقدم هذا البروتوكول وصفًا مفصلًا للترانسفيكتيون المستقر في الطفيليات الإميرية: تنقية ونواة من السبوروزوبيت أو الميروزويت من الجيل الثاني ، وفي انتشار الطفيليات العابرة للفيروس. باستخدام هذا البروتوكول، حققنا transfection في عدة أنواع من Eimeria. إذا ما أُخذت هذه النواة معاً، فهي أداة مفيدة لتسهيل التلاعب الجيني في الطفيليات الأيميرية.

وقد استخدم هذا البروتوكول لنقل الطفيليات eimerian. في هذه الدراسة، تم عرض الجيلالثاني من الميرونتس وmerozoites من E. necatrix في الشكل 2A والشكل 2B، في حين أن الشكل 2C والشكل 2D</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites at JoVE.com

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

هنا ، قدمنا طريقة لتحقيق الترانفيس المستقر لطفيليات الأيفريا الدجاج من قبل النيوليوبوكتينغ سبوروزويبس أو الجيل الثاني merozoites. ويمكن استخدام الطفيليات الأيميرية المعدلة وراثياً التي تعبر عن الجينات المغايرة للجينات المغايرة كوسائل لإيصال اللقاح.

النوكليوفوكساتيون وفي فيفو نشر طفيليات الايميريا الدجاج

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of ...

ومن شأن وضع بروتوكولات نقل أنواع الإيميريا أن يساعد على المضي قدما في دراسة الوظائف الجينية، وتطوير لقاحات جديدة، وفحص أهداف جديدة للأدوية في إيميريا. باستخدام هذه التقنية ، حققنا نقل العديد من أنواع الإيميرية ، والنوية هي أداة مفيدة لتسهيل تطبيق التلاعب الجيني في الطفيليات الإيميرية. يوفر النيوكلوفيction من إيميريا مرجعا لtransfefection الطفيليات الأخرى التي لا يمكن أن تكون مزرعت في المختبر ، وسوف تسريع دراسة التلاعب الجيني.إذا حاولت هذه التقنية للمرة الأولى، يجب عليك إعداد جميع الكواشف وأدواتها جيدا قبل بدء transfection لتجنب التدافع أثناء التجربة. تحقيق هذه الطريقة يساعد الناس الذين يركزون على transfection من ايميريا لمعرفة التفاصيل المعقدة لهذه التجربة. لتبدأ مع إطلاق sporocysts، الطرد المركزي مرة واحدة 10 إلى بويضات sporulated السبعة في محلول ديكرومات البوتاسيوم في 2، 300 مرات ز لمدة خمس دقائق.غسلها مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات. Resuspend بيليه مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني، ونقل الخليط إلى أنبوب 15 ملليلتر. إضافة حجم متساو من الخرز الزجاجي قطره ملليمتر واحد، وتتأرجح تعليق oocyst باستخدام خلاط دوامة للافراج عن sporocysts.كل دقيقة، ورصد الإفراج عن sporocysts عن طريق المجهر. عندما يتم كسر أكثر من 90٪ من البويضات، والتوقف عن دوامة. نقل تعليق sporocyst إلى أنابيب جديدة 1.5 ملليلتر، والطرد المركزي في 1، 600 مرات ز لمدة خمس دقائق.إعادة تعليق الترسبة مع ملليلتر واحد من 50٪ حل التدرج الكثافة, والطرد المركزي في 10,000 مرات ز لمدة دقيقة واحدة. لإطلاق sporozoites، resuspend الترسب مع العازلة excystation، واحتضان في حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 40 إلى 60 دقيقة للافراج عن sporozoites. هز الأنابيب مرة واحدة كل خمس دقائق خلال excystation.عندما يتم تحرير أكثر من 90٪ من sporozoites، ووقف في احتضان. جهاز طرد مركزي في 600 مرة ز لمدة 10 دقائق. Resuspend هطول الأمطار مع ملليلتر واحد من 55٪ حل التدرج الكثافة، والطرد المركزي الأنبوب في 10، 000 مرات ز لمدة دقيقة واحدة.Resuspend هطول الأمطار مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني، وعد sporozoites باستخدام مقياس الهيموسيت. لجمع الميروزويت من الجيل الثاني من necatrix Eimeria، وقطع الأمعاء الدجاج طوليا من ساق صفار إلى الفوهة الايلوسيكال، وغسلها مع برنامج تلفزيوني أو HBSS بلطف ثلاث مرات في طبق بيتري. قطع الأمعاء إلى قطع، ووضعها في قارورة مخروطية مع عازلة الهضم.ضع القارورة على خلاط مغناطيسي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع شريط مثير لمدة 30 إلى 60 دقيقة لإطلاق المزيج. بعد 30 دقيقة من الحضانة، مراقبة الإفراج عن الميروزات عن طريق الفحص المجهري كل خمس دقائق. لتنقية الميروزايت، صب تعليق يحتوي على الميروزيت المهضمة على أربع طبقات من الشاش لتصفية في أنابيب 50 ملليلتر، والطرد المركزي الأنابيب في 600 مرة ز لمدة 10 دقائق.بعد الطرد المركزي، تخلص من الماحشة التي تحتوي على حطام الأمعاء. نقل هطول الأمطار مع merozoites تنقية إلى أنابيب 1.5 ملليلتر. Resuspend هطول الأمطار مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني، وعد merozoites باستخدام مقياس الهيموسيت.أولاً، جهاز الطرد المركزي تعليق sporozoite أو merozoite في 600 مرة ز لمدة 10 دقائق. ثم تجاهل المُندفع. في الترتيب التالي، إضافة 85 ميكرولترات من العازلة النووية transfection، 10 ميكروغرام من plasmid، و 25 وحدة من إنزيم تقييد في أنبوب 1.5 ملليلتر التي تحتوي على sporozoites أو merozoites.نقل الإيقاف إلى كوب نقل نووي. ضع الكأس في أخدود نقل نووي. قم بتشغيل جهاز النيوكلوفيكشن باستخدام زر الطاقة، وحدد إجراء U-033.عند انتهاء البرنامج، اضغط على زر X للجهاز nucleofection، وتعرض الشاشة موافق، مما يشير إلى أن النيوكلوفيكتيون ناجحة. إضافة 0.5 إلى ملليلتر واحد من متوسطة النسر المعدلة في دولبيككو إلى كأس النيوكلوفيكشن لوقف التفاعل. بعد خلط بلطف، نقل تعليق إلى أنبوب 1.5 ملليلتر.تلقيح الطفيليات النووية المصابة في الدجاج عمرها سبعة أيام. تلقيح merozoites من necatrix أو sporozoites من Eimeria tenella عبر طريق الكلواكال ، ولكن تلقيح Eimeria acervulina sporozoites عن طريق الحقن الوريدي. بعد جمع البويضات من البراز، استخدم فرز الخلايا المنشطة بالفلورسين و150 ملليغرام لكل كيلوغرام من البييميثامين لزيادة نسبة السكان المعدلة وراثياً.وقد استخدم هذا البروتوكول لTransfect الطفيليات إيميريا. في هذه الدراسة، تظهر الميرونات من الجيل الثاني وميروزويت من necatrix Eimeria، وكذلك sporocysts وsporozoites من تينيلا إيميريا بعد استخدام حلول التدرج الكثافة. تشير صور البويضات من ايميريا نيكاتريكس بعد إصابتها بالنويات الميروزية المصابة وبويضات إيميريا تينيلا بعد إصابتها بـ sporozoites المصابة بالنيوكلية إلى النيوكلوفيت الناجح.الشيء الأكثر أهمية في حين تحاول هذا الإجراء هو التأكد من تنقية sporozoites والمروزوايتس ناجحة واستخدام 50٪ حل التدرج كثافة لإزالة OS2 مع التأكد من sporocysts وsporozoites هي أكثر تنقية. بعد هذا الإجراء ، يمكنك تحسين هذا البروتوكول ، مثل بويضة البويضة أو sporocyst لتبسيط إجراءات نقل الطفيليات Eimeria في المستقبل. مع تطور عملية نقل الأمهات في إيميريا، فإن تقنية CRISPR-Cas9 في إيميريا ستكون من المتوقع أن تطرح بشكل كبير التلاعب الوراثي الحذر في إيميريا وأن يتم تطبيقها كمركبة مناسبة لتوصيل اللقاح.

Research

JoVE Journal

Biology

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

انتشار الخلايا الجنينية البشرية (ES) الجذعية

Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies

بيض الدجاج النوافذ للدراسات الإنمائية

The study of development has been greatly aided by the use of the chick embryo as an experimental model.  The ease of accessibility of the embryo has ...

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

وضع عامل النمو المغلفه الخرز على أجنة الدجاج المرحلة المبكرة

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Electroporations OVO في مرحلة الجنين سمو الدجاج 10

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

في الجسم الحي والدراسات في المختبر من محول - clathrin التفاعل

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

تحفيز الميكانيكية التي يسببها الكالسيوم انتشار الموجات في الخلية monolayers: مثال من الأبقار الخلايا البطانية القرنية

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

تحفيز حشوية DNA الاستشعار عن مسارات<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

في فيفو حقن مكروي و Electroporation ماوس الخصية

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

قياس صلابة من<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; ماوس Aortas باستخدام مجهر القوة الذرية

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

إعداد ومراقبة العينات البيولوجية سميكة من قبل الضوئي نقل الإلكترون التصوير المقطعي

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...