Name: nucleofection and in vivo propagation of chicken eimeria parasites
Uploaded: 2020-02-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door het National Key Research and Development Program van China (2017YFD0501200) en de National Natural Science Foundation of China (31572507, 31772728 en 31873007).

Kippen voor alle dierproeven werden ondergebracht en onderhouden volgens de China Agricultural University Institutional Animal Care and Use Committee richtlijnen en volgde de International Guiding Principles for Biomedical Research Waarbij Animals. De experimenten werden goedgekeurd door het Beijing Administration Committee of Laboratory Animals.
1. Extractie en zuivering van sporozoiten van Eimeria spp. (bijv. E. tenella)
<ol><li>Afgifte van sporocysten<ol>
<li>Centrifuge ...

<ol>
	<li>Suo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+and+economic+benefits+of+Supercox,+a+live+anticoccidial+vaccine+in+a+commercial+trial+in+broiler+chickens+in+China.">The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China.</a> Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).</li><li>Kim, K., Soldati, D., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+replacement+in+Toxoplasma+gondii+with+chloramphenicol+acetyltransferase+as+selectable+marker.">Gene replacement in Toxoplasma gondii with chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker.</a> Science. 262 (5135), 911-914 (1993).</li><li>Sibley, L. D., Messina, M., Niesman, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+DNA+transformation+in+the+obligate+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii+by+complementation+of+tryptophan+auxotrophy.">Stable DNA transformation in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii by complementation of tryptophan auxotrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5508-5512 (1994).</li><li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+molecular+transformation+of+Toxoplasma+gondii:+a+selectable+dihydrofolate+reductase-thymidylate+synthase+marker+based+on+drug-resistance+mutations+in+malaria.">Stable molecular transformation of Toxoplasma gondii: a selectable dihydrofolate reductase-thymidylate synthase marker based on drug-resistance mutations in malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11703-11707 (1993).</li><li>Soldati, D., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+and+expression+in+the+obligate+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii.">Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii.</a> Science. 260 (5106), 349-352 (1993).</li><li>Goonewardene, R., Daily, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+the+malaria+parasite+and+expression+of+firefly+luciferase.">Transfection of the malaria parasite and expression of firefly luciferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5234-5236 (1993).</li><li>Kelleher, M., Tomley, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+of+beta-galactosidase+in+differentiating+sporozoites+of+Eimeria+tenella.">Transient expression of beta-galactosidase in differentiating sporozoites of Eimeria tenella.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 97 (1-2), 21-31 (1998).</li><li>Clark, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+facilitating+stable+transfection+of+Eimeria+species.">A toolbox facilitating stable transfection of Eimeria species.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 162 (1), 77-86 (2008).</li><li>Yan, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transfection+of+Eimeria+tenella:+Constitutive+expression+of+the+YFP-YFP+molecule+throughout+the+life+cycle.">Stable transfection of Eimeria tenella: Constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout the life cycle.</a> International Journal for Parasitology. 39 (1), 109-117 (2009).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+Eimeria+mitis+with+Yellow+Fluorescent+Protein+as+Reporter+and+the+Endogenous+Development+of+the+Transgenic+Parasite.">Transfection of Eimeria mitis with Yellow Fluorescent Protein as Reporter and the Endogenous Development of the Transgenic Parasite.</a> PloS One. 9 (12), e114188 (2014).</li><li>Duan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transfection+of+Eimeria+necatrix+through+nucleofection+of+second+generation+merozoites.">Stable transfection of Eimeria necatrix through nucleofection of second generation merozoites.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. , 1-5 (2019).</li><li>Li, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Eimeria+mitis+expressing+chicken+interleukin+2+stimulated+higher+cellular+immune+response+in+chickens+compared+with+the+wild-type+parasites.">Transgenic Eimeria mitis expressing chicken interleukin 2 stimulated higher cellular immune response in chickens compared with the wild-type parasites.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 533 (2015).</li><li>Clark, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eimeria+species+parasites+as+novel+vaccine+delivery+vectors:+anti-Campylobacter+jejuni+protective+immunity+induced+by+Eimeria+tenella-delivered+CjaA.">Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors: anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeria tenella-delivered CjaA.</a> Vaccine. 30 (16), 2683-2688 (2012).</li><li>Eckert, J., Braun, R., Shirley, M. W., Coudert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eimeria+species+and+strains+of+chickens.">Eimeria species and strains of chickens.</a> Biotechnology: Guidelines on techniques in coccidiosis research. Part. I: Eimeria and Isospora, 1-24 (1995).</li><li>Kurth, M., Entzeroth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+gene+expression+in+cell+culture+stages+and+oocysts+of+Eimeria+nieschulzi+(Coccidia,+Apicomplexa).">Reporter gene expression in cell culture stages and oocysts of Eimeria nieschulzi (Coccidia, Apicomplexa).</a> Parasitology Research. 104 (2), 303-310 (2009).</li><li>Tao, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Eimeria+magna+Perard,+1925+Displays+Similar+Parasitological+Properties+to+the+Wild-type+Strain+and+Induces+an+Exogenous+Protein-Specific+Immune+Response+in+Rabbits+(Oryctolagus+cuniculus+L.).">Transgenic Eimeria magna Perard, 1925 Displays Similar Parasitological Properties to the Wild-type Strain and Induces an Exogenous Protein-Specific Immune Response in Rabbits (Oryctolagus cuniculus L.).</a> Frontiers in Immunology. 8, 2 (2017).</li><li>Shi, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Transfection+of+Eimeria+intestinalis+and+Investigation+of+Its+Life+Cycle,+Reproduction+and+Immunogenicity.">Stable Transfection of Eimeria intestinalis and Investigation of Its Life Cycle, Reproduction and Immunogenicity.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 807 (2016).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+telomerase-interacting+OTU+protein+of+Eimeria+tenella+and+its+telomerase-regulating+activity.">A novel telomerase-interacting OTU protein of Eimeria tenella and its telomerase-regulating activity.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (8), 744-745 (2017).</li><li>Li, J. N., Zou, J., Yin, G. W., Liu, X. Y., Suo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+DNA+could+be+delivered+into+Eimeria+maxima+unsporulated+oocyst+with+gene+gun+system.">Plasmid DNA could be delivered into Eimeria maxima unsporulated oocyst with gene gun system.</a> Acta Polytechnica Hungarica. 60 (4), 431-440 (2012).</li></ol>

In de jaren 1990 werd een transfection systeem ontwikkeld voor apicomplexan parasieten, en het werd gebruikt voor studies over eimerian parasieten. Onlangs werd staltransfection uitgevoerd in E. tenella8,9 en E. nieschulzi15. We bereikten de stabiele transfection van E. necatrix door transfecting tweede generatie merozoites11. Inenting van transfected sporozoites van E. acervulina...

Eimeria spp. veroorzaakt coccidiose, wat leidt tot aanzienlijke economische verliezen in de vee- en pluimveesector. Hoewel anticoccidiale geneesmiddelen, en tot op zekere hoogte, verzwakte antikokkendievaccins, op grote schaal zijn gebruikt voor de bestrijding van coccidiose, zijn er nog steeds tekortkomingen met betrekking tot hun resistentie tegen geneesmiddelen, medicijnresiduen en de potentiële verspreiding van vaccinstammen die virulentie herwinnen1. Met de ontwikkeling van moleculaire biologie is transfection een essentieel instrument geworden voor het bestuderen van genfuncties, het ontwikkelen van nieuwe vaccins en het screenen van nieuwe medicijndoelen voor Eimeria.
In de afgelopen decennia is transfection met succes toegepast voor apicomplexan parasieten zoals Plasmodium en Toxoplasma gondii2,3,4,5,6. Een studie met β-gal als verslaggever voor de transfection in E. tenella loodste dergelijk werk in Eimeria7. De transfection van E. tenella8,9, E. mitis10, en E. acervulina (Zhang et al., ongepubliceerde gegevens) was succesvol bij kippen. Onlangs bereikten we transfection met behulp van merozoites van E. necatrix door nucleofection11.
Studies toonden aan dat Eimeria die een heterologantigeen uitdrukt, het potentieel heeft om te worden ontwikkeld als een recombinant vaccin, zoals die waarin Campylobacter jejuni-antigeen A (CjaA) of kippeninterleukine 2 (chIL-2)12,13uitdrukt . Daarom beschrijft dit protocol een nucleofection studie van Eimeria spp. bij kippen. De procedure beschrijft zuivering van sporozoiten of merozoïeten, nucleofection met plasmid DNA, cloacale inenting/intraveneuze injectie en in vivo voortplanting om onderzoekers te helpen bij het starten van studies over transgene Eimeria-parasieten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ATP-disodium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A26209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose DE-52</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C8350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Flow Pump</td>
			<td>SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD.</td>
			<td>HL-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>MACGENE</td>
			<td>CM15019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z250473-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>No. V900116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Biotopped</td>
			<td>G6200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>MACGENE</td>
			<td>CC016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>No. V900041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Speed Centrifuge</td>
			<td>BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD.</td>
			<td>DT5-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Mixer</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>MS-H280-Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>449164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo cell sorter</td>
			<td>BeckMan Coulter, US</td>
			<td>201309995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofection device</td>
			<td>LONZA/amaxa</td>
			<td>90900012 (Nucleofector II)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (DG gradient stock solution)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium taurodeoxycholate hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Beijing North TZ-Biotech Develop.co.</td>
			<td>HQ-60-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath Thermostat</td>
			<td>Grant Instruments (Cambridge), Ltd.</td>
			<td>GD120,GM0815010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nucleofection and in vivo propagation of chicken eimeria parasites

Transfection is een technisch proces waarbij genetisch materiaal, zoals DNA en dubbelstrengs RNA, in cellen worden geleverd om het gen van belang te wijzigen. Momenteel wordt transgene technologie een onmisbaar instrument voor de studie van Eimeria, de veroorzakers van coccidiose bij pluimvee en vee. Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van stabiele transfection bij eimerian parasieten: zuivering en nucleofection van sporozoiten of tweede generatie merozoiten, en in vivo voortplanting van transfected parasieten. Met behulp van dit protocol bereikten we transfection in verschillende soorten Eimeria. Samen is nucleofection een nuttig hulpmiddel om genetische manipulatie bij eimerian parasieten te vergemakkelijken.

Dit protocol is gebruikt om eimerian parasieten te transfect. In deze studie werden de2e generatie meronts en merozoites van E. necatrix getoond in figuur 2A en figuur 2B, terwijl figuur 2C en figuur 2D de sporocysten en sporozoiten van E. tenella vertoonden na gebruik van de...

Watch this Scientific Journal Video about Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites at JoVE.com

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Hier hebben we een methode om stabiele transfection van kip Eimeria parasieten te bereiken door nucleofecting sporozoites of tweede generatie merozoiten. Genetisch gemodificeerde eimerian parasieten die heterologe antigene genen uitdrukken, kunnen worden gebruikt als vaccinleveringsvoertuigen.

Nucleofection en in Vivo propagatie van kippeneimeria parasieten

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of ...

De vaststelling van transfectieprotocollen voor Eimeria-soorten zou helpen om de studie van genfuncties te bevorderen, nieuwe vaccins te ontwikkelen en nieuwe medicijndoelen voor Eimeria te screenen. Met behulp van deze techniek bereikten we de transfectie van verschillende soorten Eimeria, en nucleofection is een nuttig hulpmiddel om de toepassing van genetische manipulatie bij eimerian parasieten te vergemakkelijken. De kernvan eimeria biedt een referentie voor de transfectie van andere parasieten die niet in vitro gekweekt kunnen worden en de studie van hun genetische manipulatie zullen versnellen.Als u deze techniek voor de eerste keer probeert, moet u alle reagentia en hun instrumenten voor het begin van de transfectie goed voorbereiden om te voorkomen dat u tijdens het experiment klautert. De realisatie van deze methode helpt mensen die zich richten op de transfectie van Eimeria om de ingewikkelde details van dit experiment te zien. Om te beginnen met het vrijkomen van sporocysten, centrifuge een keer 10 tot de zeven sporulated oocysten in kalium dichromaat oplossing op 2, 300 keer g gedurende vijf minuten.Was ze drie keer met PBS. Resuspend de pellet met een milliliter PBS, en breng het mengsel naar een 15-milliliter buis. Voeg een gelijk volume van een millimeter diameter glazen kralen, en oscilleren de oocyst suspensie met behulp van een vortex mixer om de sporocysten vrij te geven.Elke minuut, monitor de release van sporocysten door microscopie. Wanneer meer dan 90% van de eicellen zijn gebroken, stop met vortexen. Breng de sporocyst-ophanging over naar nieuwe buizen van 1,5 milliliter en centrifuge gedurende vijf minuten op 1,600 g.Resuspend het neerslag met een milliliter van 50% dichtheid gradiënt oplossing, en centrifuge op 10,000 keer g gedurende een minuut. Om sporozoïesse vrij te geven, resuspend de neerslag met excystation buffer, en uitbroeden in een 42-graden Celsius waterbad gedurende 40 tot 60 minuten om de sporozoïes vrij te geven. Schud de buizen eens in de vijf minuten tijdens de excystation.Wanneer meer dan 90% van de sporozoïsten worden vrijgegeven, stop met uitbroeden. Centrifuge op 600 keer g gedurende 10 minuten. Resuspend de neerslag met een milliliter van 55% dichtheid gradiënt oplossing, en centrifugeren de buis op 10.000 keer g gedurende een minuut.Resuspend de neerslag met een milliliter PBS, en tel de sporozoïesstoffen met behulp van een hemocytometer. Om de tweede generatie merozoïeten van Eimeria necatrix te verzamelen, snijd je de kippendarm in de lengterichting van de dooiersteel tot de ileocecale opening en was je deze met PBS of HBSS drie keer zachtjes in een petrischaaltje. Snijd de darm in stukken, en leg ze in een conische fles met een spijsvertering buffer.Plaats de kolf op een magnetische mixer op 37 graden Celsius met een roerstaaf gedurende 30 tot 60 minuten om merozoïsten los te laten. Na 30 minuten incubatie, controleer de afgifte van merozoïsten door microscopisch onderzoek om de vijf minuten. Om de merozoïten te zuiveren, giet de suspensie met verteerde merozoïsten over vier lagen gaas om in 50 milliliter buizen te filteren en de buizen gedurende 10 minuten op 600 keer g te centrifugeren.Gooi na centrifugatie het supernatant met darmafval weg. Breng de neerslag met gezuiverde merozoïsten over naar buizen van 1,5 milliliter. Resuspend de neerslag met een milliliter PBS, en tel de merozoïsten met behulp van een hemocytometer.Ten eerste, centrifugeren de sporozoite of merozoite schorsing op 600 keer g gedurende 10 minuten. Gooi dan de supernatant weg. Voeg in de volgende volgorde 85 microliter nucleaire transfectiebuffer, 10 microgram plasmide en 25 eenheden beperkingsenzym toe aan de buis van 1,5 milliliter met sporozoïes of merozoïsten.Breng de schorsing over naar een kerntransfection cup. Zet de beker in een nucleaire transfer groef. Schakel het kernapparaat in met de aan/uit-knop en selecteer de transfectieprocedure U-033.Wanneer het programma is voltooid, drukt u op de X-knop van het kernapparaat en wordt het scherm OK weergegeven, wat aangeeft dat de kernsectie succesvol is. Voeg 0,5 aan een milliliter van Dulbecco's Modified Eagle's Medium toe aan de kernvan dection cup om de reactie te stoppen. Breng de suspensie na het mengen voorzichtig over op een buis van 1,5 milliliter.Inenting van de nucleofected parasieten in zeven dagen oude kippen. Inoculeren de merozoïsten van Eimeria necatrix of de sporozoïeten van Eimeria tenella via de cloacal route, maar inenting Eimeria acervulina sporozoïes via intraveneuze injectie. Na het verzamelen van eicellen uit uitwerpselen, gebruik fluoresceïne geactiveerde celsorling en 150 milligram per kilogram pyrimethamine om de transgene populatieratio te verhogen.Dit protocol is gebruikt om eimerian parasieten te transfecteren. In deze studie worden hier de tweede generatie meronts en merozoites van Eimeria necatrix getoond, evenals de sporocysten en sporozoïesse van Eimeria tenella na het gebruik van de dichtheidgradiëntoplossingen. De beelden van de eicysten van Eimeria necatrix na het infecteren met de nucleofected merozoites en de eicellen van Eimeria tenella na het infecteren met nucleofected sporozoites wijzen op succesvolle nucleofection.Het belangrijkste tijdens een poging deze procedure is om ervoor te zorgen dat de zuivering van sporozoïsten en merozoïsten succesvol zijn en om de 50% dichtheid gradiënt oplossing te gebruiken om de OS2 te verwijderen, terwijl ervoor te zorgen dat de sporocysieten en de sporozoïsten zijn meer gezuiverd. Na deze procedure u dit protocol optimaliseren, zoals het transfecteren van oocyst of sporocyst om de transfectieprocedures van Eimeria-parasieten in de toekomst te vereenvoudigen. Met de ontwikkeling van transfectie in Eimeria, crispr-Cas9 technologie in Eimeria zal worden verwacht aanzienlijk naar voren brengen van de voorzichtige genetische manipulatie van Eimeria en worden toegepast als een geschikt vaccin levering voertuig.

Research

JoVE Journal

Biology

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Verspreiding van menselijke embryonale stamcellen (ES) cellen

Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies

Windowing Kip Eieren voor Ontwikkelingsbiologie Studies

The study of development has been greatly aided by the use of the chick embryo as an experimental model.  The ease of accessibility of the embryo has ...

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

Het plaatsen van Growth Factor-Coated Kralen op Early Stage kippenembryo&#39;s

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

In Ovo Electroporations van HH Stage 10 kippenembryo&#39;s

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vivo en in vitro studies van Adapter-clathrine Interactie

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Mechanische stimulatie geïnduceerde Calcium golfvoortplanting in celmonolagen: Het voorbeeld van Bovine corneale endotheelcellen

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Stimulatie van Cytoplasmatische DNA Sensing Pathways<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

In vivo micro-injectie en elektroporatie of Mouse Testikel

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Meten van de stijfheid van<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aorta&#39;s met behulp van Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Voorbereiding en observatie van Thick biologische monsters door Scanning Transmission Electron Tomografie

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...