Name: nucleofection and in vivo propagation of chicken eimeria parasites
Uploaded: 2020-02-14T12:00:00
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Diese Arbeit wurde vom National Key Research and Development Program of China (2017YFD0501200) und der National Natural Science Foundation of China (31572507, 31772728 und 31873007) unterstützt.

Hühner für alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien des China Agricultural University Institutional Animal Care and Use Committee untergebracht und gepflegt und folgten den internationalen Leitprinzipien für biomedizinische Forschung mit Tieren. Die Experimente wurden vom Beijing Administration Committee of Laboratory Animals genehmigt.
1. Extraktion und Reinigung von Sporozoiten von Eimeria spp. (z.B. E. tenella)
<ol><li>Freisetzung von Sporozysten<ol>
<li>Zentr...

<ol>
	<li>Suo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+and+economic+benefits+of+Supercox,+a+live+anticoccidial+vaccine+in+a+commercial+trial+in+broiler+chickens+in+China.">The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China.</a> Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).</li><li>Kim, K., Soldati, D., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+replacement+in+Toxoplasma+gondii+with+chloramphenicol+acetyltransferase+as+selectable+marker.">Gene replacement in Toxoplasma gondii with chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker.</a> Science. 262 (5135), 911-914 (1993).</li><li>Sibley, L. D., Messina, M., Niesman, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+DNA+transformation+in+the+obligate+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii+by+complementation+of+tryptophan+auxotrophy.">Stable DNA transformation in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii by complementation of tryptophan auxotrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5508-5512 (1994).</li><li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+molecular+transformation+of+Toxoplasma+gondii:+a+selectable+dihydrofolate+reductase-thymidylate+synthase+marker+based+on+drug-resistance+mutations+in+malaria.">Stable molecular transformation of Toxoplasma gondii: a selectable dihydrofolate reductase-thymidylate synthase marker based on drug-resistance mutations in malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11703-11707 (1993).</li><li>Soldati, D., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+and+expression+in+the+obligate+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii.">Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii.</a> Science. 260 (5106), 349-352 (1993).</li><li>Goonewardene, R., Daily, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+the+malaria+parasite+and+expression+of+firefly+luciferase.">Transfection of the malaria parasite and expression of firefly luciferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5234-5236 (1993).</li><li>Kelleher, M., Tomley, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+of+beta-galactosidase+in+differentiating+sporozoites+of+Eimeria+tenella.">Transient expression of beta-galactosidase in differentiating sporozoites of Eimeria tenella.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 97 (1-2), 21-31 (1998).</li><li>Clark, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+facilitating+stable+transfection+of+Eimeria+species.">A toolbox facilitating stable transfection of Eimeria species.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 162 (1), 77-86 (2008).</li><li>Yan, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transfection+of+Eimeria+tenella:+Constitutive+expression+of+the+YFP-YFP+molecule+throughout+the+life+cycle.">Stable transfection of Eimeria tenella: Constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout the life cycle.</a> International Journal for Parasitology. 39 (1), 109-117 (2009).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+Eimeria+mitis+with+Yellow+Fluorescent+Protein+as+Reporter+and+the+Endogenous+Development+of+the+Transgenic+Parasite.">Transfection of Eimeria mitis with Yellow Fluorescent Protein as Reporter and the Endogenous Development of the Transgenic Parasite.</a> PloS One. 9 (12), e114188 (2014).</li><li>Duan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transfection+of+Eimeria+necatrix+through+nucleofection+of+second+generation+merozoites.">Stable transfection of Eimeria necatrix through nucleofection of second generation merozoites.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. , 1-5 (2019).</li><li>Li, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Eimeria+mitis+expressing+chicken+interleukin+2+stimulated+higher+cellular+immune+response+in+chickens+compared+with+the+wild-type+parasites.">Transgenic Eimeria mitis expressing chicken interleukin 2 stimulated higher cellular immune response in chickens compared with the wild-type parasites.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 533 (2015).</li><li>Clark, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eimeria+species+parasites+as+novel+vaccine+delivery+vectors:+anti-Campylobacter+jejuni+protective+immunity+induced+by+Eimeria+tenella-delivered+CjaA.">Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors: anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeria tenella-delivered CjaA.</a> Vaccine. 30 (16), 2683-2688 (2012).</li><li>Eckert, J., Braun, R., Shirley, M. W., Coudert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eimeria+species+and+strains+of+chickens.">Eimeria species and strains of chickens.</a> Biotechnology: Guidelines on techniques in coccidiosis research. Part. I: Eimeria and Isospora, 1-24 (1995).</li><li>Kurth, M., Entzeroth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+gene+expression+in+cell+culture+stages+and+oocysts+of+Eimeria+nieschulzi+(Coccidia,+Apicomplexa).">Reporter gene expression in cell culture stages and oocysts of Eimeria nieschulzi (Coccidia, Apicomplexa).</a> Parasitology Research. 104 (2), 303-310 (2009).</li><li>Tao, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Eimeria+magna+Perard,+1925+Displays+Similar+Parasitological+Properties+to+the+Wild-type+Strain+and+Induces+an+Exogenous+Protein-Specific+Immune+Response+in+Rabbits+(Oryctolagus+cuniculus+L.).">Transgenic Eimeria magna Perard, 1925 Displays Similar Parasitological Properties to the Wild-type Strain and Induces an Exogenous Protein-Specific Immune Response in Rabbits (Oryctolagus cuniculus L.).</a> Frontiers in Immunology. 8, 2 (2017).</li><li>Shi, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Transfection+of+Eimeria+intestinalis+and+Investigation+of+Its+Life+Cycle,+Reproduction+and+Immunogenicity.">Stable Transfection of Eimeria intestinalis and Investigation of Its Life Cycle, Reproduction and Immunogenicity.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 807 (2016).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+telomerase-interacting+OTU+protein+of+Eimeria+tenella+and+its+telomerase-regulating+activity.">A novel telomerase-interacting OTU protein of Eimeria tenella and its telomerase-regulating activity.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (8), 744-745 (2017).</li><li>Li, J. N., Zou, J., Yin, G. W., Liu, X. Y., Suo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+DNA+could+be+delivered+into+Eimeria+maxima+unsporulated+oocyst+with+gene+gun+system.">Plasmid DNA could be delivered into Eimeria maxima unsporulated oocyst with gene gun system.</a> Acta Polytechnica Hungarica. 60 (4), 431-440 (2012).</li></ol>

In den 1990er Jahren wurde ein Transfektionssystem für apicomplexan Parasiten entwickelt, und es wurde für Studien über eimerische Parasiten verwendet. Kürzlich wurde eine stabile Transfektion in E. tenella8,9 und E. nieschulzi15durchgeführt. Wir erreichten die stabile Transfektion von E. necatrix durch transfizierende Merozoiten der zweiten Generation11. Die Impfung der transfizierte...

Eimeria spp. verursacht Kokziidiose, was zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten in der Vieh- und Geflügelindustrie führt. Obwohl Antikokiside und in gewissem Maße abgeschwächte Antikokzien-Impfstoffe häufig zur Bekämpfung der Kokzidizien-Impfung eingesetzt wurden, gibt es immer noch Mängel in Bezug auf ihre Arzneimittelresistenz, Arzneimittelrückstände und die mögliche Diffusion von Impfstoffstämmen, die virulenz zurückgewinnen1. Mit der Entwicklung der Molekularbiologie ist die Transfektion zu einem wichtigen Werkzeug geworden, um Genfunktionen zu untersuchen, neuartige Impfstoffe zu entwickeln und neue Wirkstoffziele für Eimeriazu screening.
In den letzten Jahrzehnten wurde die Transfektion erfolgreich für apicomplexan Parasiten wie Plasmodium und Toxoplasma gondii2,3,4,5,6angewendet. Eine Studie, in der die Transfektion in E. tenella als Reporter für die Transfektion verwendet wurde, führte in Eimeria7auf solche Arbeiten. Die Transfektion von E. tenella8,9, E. mitis10und E. acervulina (Zhang et al., unveröffentlichte Daten) war bei Hühnern erfolgreich. Kürzlich erreichten wir die Transfektion mit Merozoiten von E. necatrix durch Nukleofection11.
Studien zeigten, dass Eimeria, die ein heterologes Antigen exizipieren, das Potenzial hat, als rekombinanter Impfstoff entwickelt zu werden, wie z. B. solche, die Campylobacter Jejuni-Antigen A (CjaA) oder Huhn interleukin 2 (chIL-2)12,13. Daher beschreibt dieses Protokoll eine Nukleofektionsstudie von Eimeria spp. bei Hühnern. Das Verfahren beschreibt die Reinigung von Sporozoiten oder Merozoiten, Die Nukleofektion mit Plasmid-DNA, die cloakale Inokulation/intravenöse Injektion und die In-vivo-Vermehrung, um Forschern zu helfen, Studien über transgene Eimeria-Parasiten zu beginnen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ATP-disodium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A26209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose DE-52</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C8350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Flow Pump</td>
			<td>SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD.</td>
			<td>HL-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>MACGENE</td>
			<td>CM15019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z250473-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>No. V900116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Biotopped</td>
			<td>G6200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>MACGENE</td>
			<td>CC016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>No. V900041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Speed Centrifuge</td>
			<td>BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD.</td>
			<td>DT5-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Mixer</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>MS-H280-Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>449164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo cell sorter</td>
			<td>BeckMan Coulter, US</td>
			<td>201309995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofection device</td>
			<td>LONZA/amaxa</td>
			<td>90900012 (Nucleofector II)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (DG gradient stock solution)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium taurodeoxycholate hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Beijing North TZ-Biotech Develop.co.</td>
			<td>HQ-60-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath Thermostat</td>
			<td>Grant Instruments (Cambridge), Ltd.</td>
			<td>GD120,GM0815010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nucleofection and in vivo propagation of chicken eimeria parasites

Transfektion ist ein technischer Prozess, durch den genetisches Material, wie DNA und doppelsträngige RNA, in Zellen abgegeben werden, um das Gen von Interesse zu modifizieren. Derzeit wird die transgene Technologie zu einem unverzichtbaren Werkzeug für die Untersuchung von Eimeria, den Erregern der Kokzidiose bei Geflügel und Vieh. Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung der stabilen Transfektion bei eimerischen Parasiten: Reinigung und Nukleofektion von Sporozoiten oder Merozoiten der zweiten Generation und in vivo Vermehrung transfizierter Parasiten. Mit diesem Protokoll erreichten wir die Transfektion bei mehreren Eimeria-Arten. Zusammengenommen ist die Nukleofektion ein nützliches Werkzeug, um genetische Manipulationen bei eimerischen Parasiten zu erleichtern.

Dieses Protokoll wurde verwendet, um eimerian Parasiten zu transfekten. In dieser Studie wurden die Meronten und Merozoiten der2. Generation von E. necatrix in Abbildung 2A und Abbildung 2Bdargestellt, während Abbildung 2C und Abbildung 2D die Sporozysten und Sporozoiten von E. t...

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Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Hier boten wir eine Methode zur Erreichung einer stabilen Transfektion von Eimeria-Parasiten durch Nukleofektive Sporozoite oder Merozoitder der zweiten Generation. Genetisch veränderte eimerische Parasiten, die heterologe antigene Gene exdrücken, könnten als Impfstoff-Liefervehikel verwendet werden.

Nukleofection und In Vivo Propagation von Hühner Eimeria Parasiten

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of ...

Die Einrichtung von Transfektionsprotokollen für Eimeria-Arten würde dazu beitragen, die Erforschung der Genfunktionen voranzutreiben, neue Impfstoffe zu entwickeln und neue Wirkstoffziele für Eimeria zu screening. Mit dieser Technik erreichten wir die Transfektion mehrerer Eimeria-Arten, und die Nukleofektion ist ein nützliches Werkzeug, um die Anwendung genetischer Manipulation bei eimerischen Parasiten zu erleichtern. Die Nukleofektion von Eimeria bietet eine Referenz für die Transfektion anderer Parasiten, die nicht in vitro kultiviert werden können und die Untersuchung ihrer genetischen Manipulation beschleunigen wird.Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal ausprobieren, sollten Sie alle Reagenzien und ihre Instrumente vor Beginn der Transfektion gut vorbereiten, um Rührung während des Experiments zu vermeiden. Die Realisierung dieser Methode hilft Menschen, die sich auf die Transfektion von Eimeria konzentrieren, die komplizierten Details dieses Experiments zu sehen. Um mit der Freisetzung von Sporozysten zu beginnen, Zentrifufuge ein mal 10 zu den sieben sporulierten Oozysten in Kaliumdichromat-Lösung bei 2, 300 mal g für fünf Minuten.Waschen Sie sie mit PBS dreimal. Das Pellet mit einem Milliliter PBS aussetzen und das Gemisch in ein 15-Milliliter-Rohr geben. Fügen Sie ein gleiches Volumen von Glasperlen mit einem Millimeterdurchmesser hinzu und oszillieren Sie die Oozystensuspension mit einem Wirbelmischer, um die Sporozysten freizusetzen.Überwachen Sie jede Minute die Freisetzung von Sporozysten durch Mikroskopie. Wenn mehr als 90% der Oozysten gebrochen sind, stoppen Sie das Wirbeln. Übertragen Sie die Sporozystensuspension auf neue 1,5-Milliliter-Röhren und Zentrifugen bei 1,600-fachen g für fünf Minuten.Setzen Sie den Niederschlag mit einem Milliliter 50%Dichte Gradientenlösung und Zentrifuge bei 10.000 mal g für eine Minute aus. Um Sporozoiten freizusetzen, setzen Sie den Niederschlag mit Excystationspuffer wieder auf und in einem 42-Grad-Celsius-Wasserbad für 40 bis 60 Minuten inkubieren, um die Sporozoiten freizusetzen. Schütteln Sie die Rohre einmal alle fünf Minuten während der Excystation.Wenn mehr als 90% der Sporozoiten freigesetzt werden, hören Sie auf zu brüten. Zentrifuge bei 600 mal g für 10 Minuten. Setzen Sie den Niederschlag mit einem Milliliter 55%Dichte Gradientenlösung aus, und zentrifugieren Sie das Rohr mit 10 000 mal g für eine Minute.Setzen Sie den Niederschlag mit einem Milliliter PBS aus, und zählen Sie die Sporozoiten mit einem Hämozytometer. Um die Merozoiten der zweiten Generation von Eimeria necatrix zu sammeln, schneiden Sie den Hühnerdarm längs vom Eigelbstiel in die ileocecal-Öffnung und waschen Sie ihn mit PBS oder HBSS dreimal in einer Petrischale. Den Darm in Stücke schneiden und in einen konischen Kolben mit einem Verdauungspuffer legen.Legen Sie den Kolben auf einen Magnetmischer bei 37 Grad Celsius mit einem Rührbalken für 30 bis 60 Minuten, um Merozoite freizusetzen. Überwachen Sie nach 30 Minuten Inkubation alle fünf Minuten die Freisetzung von Merozoiten durch mikroskopische Untersuchung. Um die Merozoite zu reinigen, gießen Sie die Suspension mit verdauten Merozoiten über vier Schichten Gaze, um in 50-Milliliter-Röhren zu filtern, und zentrifugieren Sie die Rohre bei 600 mal g für 10 Minuten.Nach der Zentrifugation den Überstand, der Darmablagerungen enthält, entsorgen. Übertragen Sie den Niederschlag mit gereinigten Merozoiten auf 1,5-Milliliter-Röhren. Setzen Sie den Niederschlag mit einem Milliliter PBS aus, und zählen Sie die Merozoiten mit einem Hämozytometer.Zunächst zentrifugieren Sie die Sporozoit- oder Merozoitsuspension bei 600 mal g für 10 Minuten. Dann entsorgen Sie den Überstand. In der folgenden Reihenfolge fügen Sie 85 Mikroliter Kerntransfektionspuffer, 10 Mikrogramm Plasmid und 25 Einheiten Restriktionsenzym in die 1,5-Milliliter-Röhre mit Sporozoiten oder Merozoiten ein.Übertragen Sie die Suspension auf einen nuklearen Transfektionsbecher. Den Becher in eine nukleare Transfernut legen. Schalten Sie das Nahltionsgerät mit dem Netzschalter ein, und wählen Sie das Transfektionsverfahren U-033 aus.Wenn das Programm abgeschlossen ist, drücken Sie die X-Taste des Nukleofektionsgeräts, und der Bildschirm zeigt OK an, was darauf hinweist, dass die Nukleofektion erfolgreich ist. Fügen Sie 0,5 bis ein Milliliter Dulbeccos Modified Eagle es Medium in den Nukleofection-Becher, um die Reaktion zu stoppen. Nach dem sanften Mischen die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Rohr geben.Impfen Sie die Nukleofekten Parasiten zu sieben Tage alten Hühnern. Impfen Sie die Merozoiten von Eimeria necatrix oder die Sporozoiten von Eimeria tenella über den kloaken Weg, aber impfen Sie Eimeria acervulina sporozoites durch intravenöse Injektion. Nach dem Sammeln von Oozysten aus Kot, verwenden Sie Fluorescein-aktivierte Zellsortierung und 150 Milligramm pro Kilogramm Pyrimethamin, um das transgene Populationsverhältnis zu erhöhen.Dieses Protokoll wurde verwendet, um eimerian Parasiten zu transfekten. In dieser Studie werden hier die Meronts und Merozoiten der zweiten Generation von Eimeria necatrix sowie die Sporozysten und Sporozoiten von Eimeria tenella nach Verwendung der Dichtegradientenlösungen gezeigt. Die Bilder der Oozysten von Eimeria necatrix nach der Infektin mit den nukleofekten Merozoiten und den Oozysten von Eimeria tenella nach der Infektiierung mit Nukleofekten sporozoiten deuten auf eine erfolgreiche Nukleektion hin.Das Wichtigste beim Versuch dieses Verfahrens ist, sicherzustellen, dass die Reinigung von Sporozoiten und Merozoiten erfolgreich ist und die 50%dichte Gradientenlösung zu verwenden, um das OS2 zu entfernen, während sichergestellt wird, dass die Sporozysten und die Sporozoiten gereinigt werden. Nach diesem Verfahren können Sie dieses Protokoll optimieren, wie z. B. die Transfizierung von Oozysten oder Sporozysten, um die Transfektionsverfahren von Eimeria-Parasiten in Zukunft zu vereinfachen. Mit der Entwicklung der Transfektion in Eimeria wird die CRISPR-Cas9-Technologie in Eimeria die vorsichtige genetische Manipulation von Eimeria deutlich vorbringen und als geeignetes Impfstoff-Lieferfahrzeug eingesetzt werden können.

Research

JoVE Journal

Biology

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Vermehrung von humanen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen)

Forschung

Biologie

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The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

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In Ovo Electroporations von HH Stage 10 Hühnerembryonen

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

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Mechanische Stimulation induzierte Calcium Wellenausbreitung in Zellmonoschichten: Das Beispiel Bovine Endothelzellen

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Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

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Stimulation der DNA-Sensing Zytoplasmatische Pathways<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

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Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

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