Name: nucleofection and in vivo propagation of chicken eimeria parasites
Uploaded: 2020-02-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי של סין (2017YFD0501200) והקרן הלאומית למדע הטבע של סין (31572507, 31772728 ו 31873007).

תרנגולות עבור כל הניסויים בבעלי חיים היו שוכנו ושמרו על פי הנחיות בעלי חיים מוסדיים באוניברסיטה החקלאית והשתמש בהנחיות ובעקבות העקרונות המנחים הבינלאומיים למחקר ביו-רפואי המעורב בבעלי חיים. הניסויים אושרו על ידי ועדת המינהל של בייג של חיות מעבדה.
1. הפקת וטיהור של הספוראוזו...

<ol>
	<li>Suo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+and+economic+benefits+of+Supercox,+a+live+anticoccidial+vaccine+in+a+commercial+trial+in+broiler+chickens+in+China.">The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China.</a> Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).</li><li>Kim, K., Soldati, D., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+replacement+in+Toxoplasma+gondii+with+chloramphenicol+acetyltransferase+as+selectable+marker.">Gene replacement in Toxoplasma gondii with chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker.</a> Science. 262 (5135), 911-914 (1993).</li><li>Sibley, L. D., Messina, M., Niesman, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+DNA+transformation+in+the+obligate+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii+by+complementation+of+tryptophan+auxotrophy.">Stable DNA transformation in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii by complementation of tryptophan auxotrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5508-5512 (1994).</li><li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+molecular+transformation+of+Toxoplasma+gondii:+a+selectable+dihydrofolate+reductase-thymidylate+synthase+marker+based+on+drug-resistance+mutations+in+malaria.">Stable molecular transformation of Toxoplasma gondii: a selectable dihydrofolate reductase-thymidylate synthase marker based on drug-resistance mutations in malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11703-11707 (1993).</li><li>Soldati, D., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+and+expression+in+the+obligate+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii.">Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii.</a> Science. 260 (5106), 349-352 (1993).</li><li>Goonewardene, R., Daily, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+the+malaria+parasite+and+expression+of+firefly+luciferase.">Transfection of the malaria parasite and expression of firefly luciferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5234-5236 (1993).</li><li>Kelleher, M., Tomley, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+of+beta-galactosidase+in+differentiating+sporozoites+of+Eimeria+tenella.">Transient expression of beta-galactosidase in differentiating sporozoites of Eimeria tenella.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 97 (1-2), 21-31 (1998).</li><li>Clark, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+facilitating+stable+transfection+of+Eimeria+species.">A toolbox facilitating stable transfection of Eimeria species.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 162 (1), 77-86 (2008).</li><li>Yan, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transfection+of+Eimeria+tenella:+Constitutive+expression+of+the+YFP-YFP+molecule+throughout+the+life+cycle.">Stable transfection of Eimeria tenella: Constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout the life cycle.</a> International Journal for Parasitology. 39 (1), 109-117 (2009).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+Eimeria+mitis+with+Yellow+Fluorescent+Protein+as+Reporter+and+the+Endogenous+Development+of+the+Transgenic+Parasite.">Transfection of Eimeria mitis with Yellow Fluorescent Protein as Reporter and the Endogenous Development of the Transgenic Parasite.</a> PloS One. 9 (12), e114188 (2014).</li><li>Duan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transfection+of+Eimeria+necatrix+through+nucleofection+of+second+generation+merozoites.">Stable transfection of Eimeria necatrix through nucleofection of second generation merozoites.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. , 1-5 (2019).</li><li>Li, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Eimeria+mitis+expressing+chicken+interleukin+2+stimulated+higher+cellular+immune+response+in+chickens+compared+with+the+wild-type+parasites.">Transgenic Eimeria mitis expressing chicken interleukin 2 stimulated higher cellular immune response in chickens compared with the wild-type parasites.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 533 (2015).</li><li>Clark, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eimeria+species+parasites+as+novel+vaccine+delivery+vectors:+anti-Campylobacter+jejuni+protective+immunity+induced+by+Eimeria+tenella-delivered+CjaA.">Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors: anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeria tenella-delivered CjaA.</a> Vaccine. 30 (16), 2683-2688 (2012).</li><li>Eckert, J., Braun, R., Shirley, M. W., Coudert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eimeria+species+and+strains+of+chickens.">Eimeria species and strains of chickens.</a> Biotechnology: Guidelines on techniques in coccidiosis research. Part. I: Eimeria and Isospora, 1-24 (1995).</li><li>Kurth, M., Entzeroth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+gene+expression+in+cell+culture+stages+and+oocysts+of+Eimeria+nieschulzi+(Coccidia,+Apicomplexa).">Reporter gene expression in cell culture stages and oocysts of Eimeria nieschulzi (Coccidia, Apicomplexa).</a> Parasitology Research. 104 (2), 303-310 (2009).</li><li>Tao, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Eimeria+magna+Perard,+1925+Displays+Similar+Parasitological+Properties+to+the+Wild-type+Strain+and+Induces+an+Exogenous+Protein-Specific+Immune+Response+in+Rabbits+(Oryctolagus+cuniculus+L.).">Transgenic Eimeria magna Perard, 1925 Displays Similar Parasitological Properties to the Wild-type Strain and Induces an Exogenous Protein-Specific Immune Response in Rabbits (Oryctolagus cuniculus L.).</a> Frontiers in Immunology. 8, 2 (2017).</li><li>Shi, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Transfection+of+Eimeria+intestinalis+and+Investigation+of+Its+Life+Cycle,+Reproduction+and+Immunogenicity.">Stable Transfection of Eimeria intestinalis and Investigation of Its Life Cycle, Reproduction and Immunogenicity.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 807 (2016).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+telomerase-interacting+OTU+protein+of+Eimeria+tenella+and+its+telomerase-regulating+activity.">A novel telomerase-interacting OTU protein of Eimeria tenella and its telomerase-regulating activity.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (8), 744-745 (2017).</li><li>Li, J. N., Zou, J., Yin, G. W., Liu, X. Y., Suo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+DNA+could+be+delivered+into+Eimeria+maxima+unsporulated+oocyst+with+gene+gun+system.">Plasmid DNA could be delivered into Eimeria maxima unsporulated oocyst with gene gun system.</a> Acta Polytechnica Hungarica. 60 (4), 431-440 (2012).</li></ol>

בשנות ה-90, פותחה מערכת העברה עבור טפילים apicomplexan והיא שימש למחקרים על טפילים איציריאנית. לאחרונה, נערך הזיהום היציב ב -tenella8,9 ו -e. nies,15. השגנו את ההעברה היציבה של E. necatrix על ידי העברה של הדור השני merozoites11. החיסונים של הנבגים...

Eimeria spp. גורם coccidiosis, אשר מוביל הפסדים כלכליים ניכרים בתעשיית החי והעופות. למרות תרופות anticoccidial, ובמידה רבה, חיסונים anticoccidial הקלוש, השתמשו באופן נרחב עבור השליטה של coccidiosis, יש עדיין חסרונות לגבי התנגדות הסמים שלהם, שאריות סמים, ואת הדיפוזיה הפוטנציאלית של זנים החיסון כי להחזיר התקפה אלימה1. עם התפתחות של ביולוגיה מולקולרית, ההתפתחות הפכה לכלי חיוני ללימוד פונקציות גן, פיתוח חיסונים חדשניים, והקרנת מטרות סמים חדשים עבור Eimeria.
בעשורים האחרונים, החלה העברה בהצלחה עבור טפילים apicomplexan כגון פלמודיום ו טוקסופלזמה gondii2,3,4,5,6. מחקר העושה שימוש בβ-גל כעיתונאי עבור התרגום ב -E. tenella ניווט עבודה כזאת ב eimeria7. הזיהום של e. tenella8,9, e. mitis10, ו -E. אכוקלינה (זאנג ואח ', נתונים שלא פורסמו) הצליחה בעופות. לאחרונה, השגנו העברה באמצעות merozoites של אי-מטריקס דרך נוקלאוזיהום11.
מחקרים הראו כי eimeria ביטוי אנטיגן הטרוולוגי יש את הפוטנציאל להיות מפותח כמו חיסון רקומביננטי, כגון אלה ביטוי campylobacter jejuni אנטיגן (cjaa) או עוף אינטרלויקין 2 (צ'יל-2)12,13. לכן, פרוטוקול זה מתאר מחקר של התגרריה של Eimeria spp. בתרנגולות. ההליך מתאר טיהור של הספאוזוענים או merozoites, נוקלאוזיהום עם דנ א פלבמיד, הזרקה של הזרקת ורידית ובהפצה vivo כדי לעזור לחוקרים להתחיל ללמוד על טפילים Eimeria הטרנסגניים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ATP-disodium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A26209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose DE-52</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C8350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Flow Pump</td>
			<td>SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD.</td>
			<td>HL-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>MACGENE</td>
			<td>CM15019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z250473-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>No. V900116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Biotopped</td>
			<td>G6200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>MACGENE</td>
			<td>CC016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>No. V900041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Speed Centrifuge</td>
			<td>BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD.</td>
			<td>DT5-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Mixer</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>MS-H280-Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>449164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo cell sorter</td>
			<td>BeckMan Coulter, US</td>
			<td>201309995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofection device</td>
			<td>LONZA/amaxa</td>
			<td>90900012 (Nucleofector II)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (DG gradient stock solution)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium taurodeoxycholate hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Beijing North TZ-Biotech Develop.co.</td>
			<td>HQ-60-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath Thermostat</td>
			<td>Grant Instruments (Cambridge), Ltd.</td>
			<td>GD120,GM0815010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nucleofection and in vivo propagation of chicken eimeria parasites

החצייה היא תהליך טכני שדרכו חומר גנטי, כגון DNA ו-RNA כפול, מועברים לתאים כדי לשנות את גן העניין. כיום, הטכנולוגיה הטרנסגניים הופכת כלי הכרחי לחקר Eimeria, הסוכנים סיבתי של coccidiosis ב עופות ובעלי חיים. פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של התפשטות יציבה בטפילים eimerian: טיהור והתגרצות של הנבגים או הדור השני, ובהפצה vivo של טפילים מזוהמים. באמצעות פרוטוקול זה, השגנו. העברה בכמה מינים של איאימריה . כדי להקל על מניפולציה גנטית בטפילים

הפרוטוקול הזה השתמש. כדי לעבור טפילים במחקר זה,הדור 2 meronts ו Merozoites של E. necatrix הוצגו באיור 2A ו- איור 2B, בעוד איור 2C ו- איור 2הראו את הספורלוציסטים והספוראוזוטים של ...

Watch this Scientific Journal Video about Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites at JoVE.com

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

כאן, סיפקנו שיטה כדי להשיג שינוי יציב של העוף Eimeria טפילים על-ידי נוקלאונופיטים sporozoites או הדור השני merozoites. טפילים מהונדסים גנטית שונה ביטוי הטרוולוגי הגנים ניתן להשתמש ככלי משלוח החיסון.

נוקלאופלוט ובהפצת Vivo של העופות האימריריה טפילים

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of ...

הקמת פרוטוקולי transfection עבור מינים Eimeria יעזור לקדם את המחקר של תפקודי גנים, פיתוח חיסונים חדשניים, וסינון מטרות תרופות חדשות עבור Eimeria. באמצעות טכניקה זו, השגנו את החיתוך של מספר מינים של Eimeria, ו nucleofection הוא כלי שימושי כדי להקל על היישום של מניפולציה גנטית טפילים eimerian. הגרעין של Eimeria מספק התייחסות transfection של טפילים אחרים כי לא ניתן לתרבת במבחנה יהיה להאיץ את המחקר של המניפולציה הגנטית שלהם.אם אתה מנסה טכניקה זו בפעם הראשונה, אתה צריך להכין היטב את כל reagents ואת המכשירים שלהם לפני תחילת transfection כדי למנוע לטרוף במהלך הניסוי. מימוש שיטה זו מסייע לאנשים המתמקדים בהתמרה של אמריה לראות את הפרטים המורכבים של ניסוי זה. כדי להתחיל עם שחרורו של sporocysts, צנטריפוגה אחת פעמים 10 כדי שבעה oocysts sporulated בתספורת אשלגן dichromate ב 2, 300 פעמים גרם במשך חמש דקות.לשטוף אותם עם PBS שלוש פעמים. תן את גלולה עם מיליליטר אחד של PBS, ולהעביר את התערובת לצינור 15 מיליליטר. הוסיפו נפח שווה של גם חמוזי זכוכית בקוטר מילימטר אחד, והתנודדו במתלים הוציסטים באמצעות מערבל מערבולת לשחרור האפורוציסטים.בכל דקה, לפקח על שחרורו של sporocysts על ידי מיקרוסקופיה. כאשר יותר מ-90% מהבעיות שבורות, הפסיקו למערבולת. העבר את ההשעיה sporocyst לצינורות חדשים 1.5 מיליליטר, וצנטריפוגה ב 1, 600 פעמים g במשך חמש דקות.יש למגר את המשקעים במיליליטר אחד של 50% צפיפות, ובצנטריפוגה ב-10,000 פעמים לדקה אחת. כדי לשחרר ספורוזויטים, יש להשתמש מחדש במשקעים עם חיץ אקססיישן, ולטגר באמבט מים של 42 מעלות צלזיוס למשך 40 עד 60 דקות כדי לשחרר את האפורוזואיטים. לנער את הצינורות פעם בחמש דקות במהלך excystation.כאשר יותר מ-90% מהספורוזואיטים משתחררים, הפסיקו להידגר. צנטריפוגה ב 600 פעמים g במשך 10 דקות. יש למגר מחדש את המשקעים עם מיליליטר אחד של 55% צפיפות תוסף הדרגתי, וצנטריפוגה הצינור ב 10, 000 פעמים גרם לדקה אחת.תן מחדש את המשקעים עם מיליליטר אחד של PBS, וספור את הספירוזואיטים באמצעות המוציטומטר. כדי לאסוף את המזוזואיטים מהדור השני של Eimeria necatrix, חותכים את מעי העוף לאורך הגבעול החלמון אל פתח איליוכסל, ולשטוף אותו עם PBS או HBSS בעדינות שלוש פעמים בצלחת פטרי. חותכים את המעי לחתיכות, ומ מניחים אותם בבקבוק חרוט עם חיץ עיכול.מניחים את הבקבוק על מערבל מגנטי ב 37 מעלות צלזיוס עם בר ערבוב במשך 30 עד 60 דקות כדי לשחרר merozoites. לאחר 30 דקות של דגירה, לפקח על שחרורו של merozoites על ידי בדיקה מיקרוסקופית כל חמש דקות. כדי לטהר את merozoites, יוצקים את ההשעיה המכילה merozoites מתעכל על ארבע שכבות של גזה כדי לסנן לתוך צינורות 50 מיליליטר, צנטריפוגה הצינורות ב 600 פעמים גרם במשך 10 דקות.לאחר צנטריפוגה, להשליך את העל טבעי המכיל פסולת המעי. מעבירים את המשקעים עם מזוזואיטים מטוהרים לצינורות 1.5 מיליליטר. לתפור מחדש את המשקעים עם מיליליטר אחד של PBS, ולספירת merozoites באמצעות המוציטמטר.ראשית, צנטריפוגה ההשעיה ספורוזויט או merozoite ב 600 פעמים g במשך 10 דקות. ואז להשליך את העל-טבעי. בסדר הבא, להוסיף 85 microliters של מאגר transfection גרעיני, 10 מיקרוגרם של פלסמיד, ו 25 יחידות של אנזים הגבלה לתוך הצינור 1.5 מיליליטר המכיל ספורוזויטים או merozoites.מעבירים את ההשעיה לתפנית גרעינית. שים את ה לתוך חריץ העברה גרעינית. הפעל את התקן הגרעין באמצעות לחצן ההפעלה ובחר את הליך ההמרה U-033.כאשר התוכנית מסתיימת, לחץ על לחצן X של התקן הגרעין והמסך מציג אישור, המציין שהגרעין הצליח. הוסף 0.5 למיליליטר אחד של מדיום הנשר שונה של Dulbecco לגביע הגרעין כדי לעצור את התגובה. לאחר ערבוב עדין, מעבירים את ההשעיה לצינור 1.5 מיליליטר.לחסן את הטפילים הגרעינים לתרנגולות בן שבעה ימים. לחסן את merozoites של Eimeria necatrix או את sporozoites של אמריה טנלה דרך המסלול cloacal, אבל לחסן אמריה acervulina sporozoites באמצעות הזרקה תוך וררית. לאחר איסוף oocysts מצואה, להשתמש במיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצין ו 150 מיליגרם לקילוגרם pyrimethamine כדי להגדיל את יחס האוכלוסייה מהודק.פרוטוקול זה שימש כדי לשנות טפילי eimerian. במחקר זה מוצגים כאן מירוטים ומרוזואיטים מהדור השני של אימריה נקטריקס, כמו גם את האפורוציסטים והספורוזואיטים של אמריה טנלה לאחר שימוש בפתרונות שיפוע הצפיפות. התמונות של oocysts של Eimeria necatrix לאחר להדביק עם merozoites nucleofected ואת oocysts של אמריה טנלה לאחר להדביק עם sporozoites גרעין המוזהב מצביעים על גרעין מוצלח.הדבר החשוב ביותר בעת ניסיון הליך זה הוא לוודא טיהור של sporozoites ו merozoites הם מוצלחים להשתמש בתספור שיפוע 50%density כדי להסיר את OS2 תוך כדי לוודא sporocysts ואת sporozoites מטוהרים יותר. בעקבות הליך זה, אתה יכול לייעל את הפרוטוקול הזה, כגון שינוי oocyst או sporocyst כדי לפשט את הליכי transfection של טפילי Eimeria בעתיד. עם התפתחות transfection באיימריה, טכנולוגיית CRISPR-Cas9 באיימריה צפויה לקדם באופן משמעותי את המניפולציה הגנטית הזהירה של Eimeria ולהחיל אותה ככלי משלוח חיסון מתאים.

Research

JoVE Journal

Biology

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

רביה של האדם גזע עובריים (ES) תאים

Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies

עוף Windowing ביצים למחקרים התפתחותיים

The study of development has been greatly aided by the use of the chick embryo as an experimental model.  The ease of accessibility of the embryo has ...

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

הצבת פקטור מצופה חרוזים צמיחה על עוברי תרנגולת בשלב מוקדם

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

ב Electroporations אובו של HH 10 עוברים שלב עוף

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vivo ו במבחנה של אינטראקציה מתאם-clathrin

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

הרבייה מכאנית מושרה גירוי סיד גל בmonolayers הסלולרי: דוגמה לתאי אנדותל קרני שור

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

גירוי של cytoplasmic מסלולי חישה DNA<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

בVivo Microinjection וElectroporation של אשך העכבר

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

מדידת הקשיחות של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עכבר Aortas באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

הכנה תצפית של דגימות ביולוגיות העבה ידי סריקת הילוכים אלקטרונים טומוגרפיה

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...