Name: nucleofection and in vivo propagation of chicken eimeria parasites
Uploaded: 2020-02-14T12:00:00
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이 작품은 중국의 국가 핵심 연구 개발 프로그램 (2017YFD0501200)과 중국 국립 자연 과학 재단 (31572507, 31772728 및 31873007)에 의해 지원되었습니다.

모든 동물 실험을 위한 닭은 중국 농업 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 지침에 따라 보관 및 유지되었고 동물과 관련된 생물 의학 연구를 위한 국제 지침 원칙을 따랐습니다. 실험은 실험실 동물의 베이징 관리위원회에 의해 승인되었다.
1. 에이메리아 종의 포자화체 추출 및 정제(예: 테넬라)
<ol><li>스포로시스트 의 출시<ol>
<li>원심 분리기 1 x 107칼?...

<ol>
	<li>Suo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+and+economic+benefits+of+Supercox,+a+live+anticoccidial+vaccine+in+a+commercial+trial+in+broiler+chickens+in+China.">The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China.</a> Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).</li><li>Kim, K., Soldati, D., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+replacement+in+Toxoplasma+gondii+with+chloramphenicol+acetyltransferase+as+selectable+marker.">Gene replacement in Toxoplasma gondii with chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker.</a> Science. 262 (5135), 911-914 (1993).</li><li>Sibley, L. D., Messina, M., Niesman, I. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transfection+of+Eimeria+tenella:+Constitutive+expression+of+the+YFP-YFP+molecule+throughout+the+life+cycle.">Stable transfection of Eimeria tenella: Constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout the life cycle.</a> International Journal for Parasitology. 39 (1), 109-117 (2009).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+Eimeria+mitis+with+Yellow+Fluorescent+Protein+as+Reporter+and+the+Endogenous+Development+of+the+Transgenic+Parasite.">Transfection of Eimeria mitis with Yellow Fluorescent Protein as Reporter and the Endogenous Development of the Transgenic Parasite.</a> PloS One. 9 (12), e114188 (2014).</li><li>Duan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transfection+of+Eimeria+necatrix+through+nucleofection+of+second+generation+merozoites.">Stable transfection of Eimeria necatrix through nucleofection of second generation merozoites.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. , 1-5 (2019).</li><li>Li, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Eimeria+mitis+expressing+chicken+interleukin+2+stimulated+higher+cellular+immune+response+in+chickens+compared+with+the+wild-type+parasites.">Transgenic Eimeria mitis expressing chicken interleukin 2 stimulated higher cellular immune response in chickens compared with the wild-type parasites.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 533 (2015).</li><li>Clark, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eimeria+species+parasites+as+novel+vaccine+delivery+vectors:+anti-Campylobacter+jejuni+protective+immunity+induced+by+Eimeria+tenella-delivered+CjaA.">Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors: anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeria tenella-delivered CjaA.</a> Vaccine. 30 (16), 2683-2688 (2012).</li><li>Eckert, J., Braun, R., Shirley, M. W., Coudert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eimeria+species+and+strains+of+chickens.">Eimeria species and strains of chickens.</a> Biotechnology: Guidelines on techniques in coccidiosis research. Part. I: Eimeria and Isospora, 1-24 (1995).</li><li>Kurth, M., Entzeroth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+gene+expression+in+cell+culture+stages+and+oocysts+of+Eimeria+nieschulzi+(Coccidia,+Apicomplexa).">Reporter gene expression in cell culture stages and oocysts of Eimeria nieschulzi (Coccidia, Apicomplexa).</a> Parasitology Research. 104 (2), 303-310 (2009).</li><li>Tao, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Eimeria+magna+Perard,+1925+Displays+Similar+Parasitological+Properties+to+the+Wild-type+Strain+and+Induces+an+Exogenous+Protein-Specific+Immune+Response+in+Rabbits+(Oryctolagus+cuniculus+L.).">Transgenic Eimeria magna Perard, 1925 Displays Similar Parasitological Properties to the Wild-type Strain and Induces an Exogenous Protein-Specific Immune Response in Rabbits (Oryctolagus cuniculus L.).</a> Frontiers in Immunology. 8, 2 (2017).</li><li>Shi, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Transfection+of+Eimeria+intestinalis+and+Investigation+of+Its+Life+Cycle,+Reproduction+and+Immunogenicity.">Stable Transfection of Eimeria intestinalis and Investigation of Its Life Cycle, Reproduction and Immunogenicity.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 807 (2016).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+telomerase-interacting+OTU+protein+of+Eimeria+tenella+and+its+telomerase-regulating+activity.">A novel telomerase-interacting OTU protein of Eimeria tenella and its telomerase-regulating activity.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (8), 744-745 (2017).</li><li>Li, J. N., Zou, J., Yin, G. W., Liu, X. Y., Suo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+DNA+could+be+delivered+into+Eimeria+maxima+unsporulated+oocyst+with+gene+gun+system.">Plasmid DNA could be delivered into Eimeria maxima unsporulated oocyst with gene gun system.</a> Acta Polytechnica Hungarica. 60 (4), 431-440 (2012).</li></ol>

1990 년대에, 형질 전환 시스템은 apicomplexan 기생충을 위해 개발되고, eimerian 기생충에 대한 연구를 위해 이용되었습니다. 최근에는 E. 테넬라8,9 및 E. nieschulzi15에서안정적인 형혈이 수행되었다. 2세대 메로조이트11을트랜스펙팅하여 E. 네카트릭스의 안정적인 형혈을 달성했습니다. 날개 정맥을 통해 ...

Eimeria spp. 가축 및 가금류 산업에 상당한 경제적 손실로 이어지는 coccidiosis를 일으키는 원인이 됩니다. 항구균 약물, 그리고 어느 정도, 감쇠된 항구균 백신은, cocciiosis의 통제를 위해 널리 이용되고 있더라도, 그들의 약 저항, 약 잔류물 및 독성을 되찾는 백신 긴장의 잠재적인 확산에 관하여 아직도 결점이 있습니다1. 분자 생물학의 발달과 함께, 형질감염은 유전자 기능을 연구하고, 새로운 백신을 개발하고, Eimeria를위한 새로운 약 표적을 검열하기 위한 중요한 공구가 되었습니다.
지난 수십 년 동안, 형질감염은 플라스모듐과 톡소플라즈마 곤디2,3,4,5,6과같은 복합기생충에 성공적으로 적용되었다. E. 테넬라에서 형질 감염에 대한 기자로 β-gal을 사용하여 연구는 에이메리아에서이러한 작업을 조종7. E. tenella8,9, E. 미염10,및 E. acervulina (장 외, 미공개 데이터)의 형질감염은 닭에서 성공적이었다. 최근에는핵11을통해 E. necatrix의 메로조이스를 사용하여 형질혈을 달성했습니다.
연구 결과에 따르면 이종항균을 발현하는 에이메리아는 캄필로박터 제자니 항원 A(CjaA) 또는 닭인터류친 2(chIL-2)12,13을 발현하는 것과 같은 재조합 백신으로 개발될 가능성이 있는 것으로 나타났다. 따라서, 이 프로토콜은 닭에 있는 Eimeria spp. 의 핵 제거 연구 결과 기술합니다. 절차는 포자형 Eimeria 기생충에 대한 연구를 시작하는 연구원을 돕기 위하여 포자조이트 또는 merozoites의 정화, 플라스미드 DNA를 가진 핵, cloacal 접종/정맥 주입 및 생체 내 전파를 기술합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ATP-disodium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A26209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose DE-52</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C8350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Flow Pump</td>
			<td>SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD.</td>
			<td>HL-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>MACGENE</td>
			<td>CM15019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z250473-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>No. V900116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Biotopped</td>
			<td>G6200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>MACGENE</td>
			<td>CC016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>No. V900041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Speed Centrifuge</td>
			<td>BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD.</td>
			<td>DT5-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Mixer</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>MS-H280-Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>449164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo cell sorter</td>
			<td>BeckMan Coulter, US</td>
			<td>201309995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofection device</td>
			<td>LONZA/amaxa</td>
			<td>90900012 (Nucleofector II)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (DG gradient stock solution)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium taurodeoxycholate hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Beijing North TZ-Biotech Develop.co.</td>
			<td>HQ-60-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath Thermostat</td>
			<td>Grant Instruments (Cambridge), Ltd.</td>
			<td>GD120,GM0815010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nucleofection and in vivo propagation of chicken eimeria parasites

형질감염은 DNA와 이중 가닥 RNA와 같은 유전 물질이 관심있는 유전자를 수정하기 위해 세포로 전달되는 기술적 과정입니다. 현재, 형질전환 기술은 가금류 및 가축에서 coccidiosis의 원인 인 Eimeria의연구를위한 필수 도구가되고있다. 이 프로토콜은 에이메라체 기생충의 안정적인 형질 감염에 대한 자세한 설명을 제공합니다 : 포자형 또는 2 세대 메로 조이의 정제 및 핵, 형질 감염된 기생충의 생체 전파. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 Eimeria의여러 종에서 형질 감염을 달성했다. 종합하면, 핵은 에이메리안 기생충의 유전자 조작을 촉진하는 유용한 도구입니다.

이 프로토콜은 에이메라 기생충을 트랜스펙트하는 데 사용되었습니다. 본 연구에서,2세대 메론트 및 E. 네카트릭스의 메로조이트는 도 2A 및 도 2B에나타내었으며, 도 2C 및 도 2D는 밀도 그라데이션 용액을 사용한 후 <e...

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Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

여기서, 우리는 포자조이트 또는 2세대 메로조이트에 의한 닭에이메리아 기생충의 안정적인 형질변환을 달성할 수 있는 방법을 제공했다. 이종 항원 유전자를 발현하는 유전자 변형 에이메리안 기생충은 백신 전달 차량으로 사용될 수 있었다.

닭 에이메리아 기생충의 핵 과 생체 내 전파

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of ...

아이메리아 종에 대한 경질 프로토콜의 설립은 유전자 기능의 연구를 진행하는 데 도움이 될 것입니다, 새로운 백신을 개발, 아이메리아에 대한 새로운 약물 목표를 선별. 이 기술을 사용하여, 우리는 Eimeria의 몇몇 종의 전염을 달성하고, 핵은 eimerian 기생충에 있는 유전 조작의 적용을 용이하게 하기 위하여 유용한 공구입니다. Eimeria의 핵은 시험관에서 배양될 수 없는 그밖 기생충의 transfection를 위한 참조를 제공하고 그들의 유전 조작의 연구를 가속화할 것입니다.이 기술을 처음으로 시도하면 실험 중에 스크램블을 피하기 위해 트랜스펙트 시작 전에 모든 시약과 악기를 잘 준비해야합니다. 이 방법의 실현은 이 실험의 복잡한 세부 사항을 볼 수있는 Eimeria의 트랜스포메이션에 집중하는 사람들을 돕는다. 스포로시스트의 방출로 시작하려면, 원심분리기는 칼륨 이드로메이트 용액의 7개의 포자화 난모세포에 1회 10회, 5분 동안 300배.PBS로 세 번 씻으시면 됩니다. PBS의 1 밀리리터로 펠릿을 다시 중단하고 혼합물을 15 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 1mm 직경의 유리 구슬의 동일한 볼륨을 추가하고, 스포로시스트를 방출하기 위해 소용돌이 믹서를 사용하여 난모성 서스펜션을 진동.매 분마다 현미경 검사법에 의한 스포로시스트의 방출을 모니터링합니다. 난모종의 90% 이상이 파손되면 소용돌이를 멈추십시오. 스포로시스트 서스펜션을 새로운 1.5밀리리터 튜브로 옮기고 원심분리기를 5분 동안 1, 600배 g로 옮긴다.침전을 50% 밀도 그라데이션 용액1밀리리터로 재일시 중단하고 원심분리기는 1분 동안 10, 000배 g로 재주합니다. 스포로조이트를 방출하려면 침전물을 침전 버퍼로 재중단하고 42도의 섭씨 수조에서 40~60분 동안 배양하여 산포로조이트방출한다. 퇴출 시 5분마다 한 번씩 튜브를 흔들어 줍니다.산포로조이트 중 90% 이상이 방출되면 인큐베이팅을 중단하십시오. 원심 분리기는 600배 g에서 10분 동안. 55% 밀도 그라데이션 용액의 1밀리리터로 침전을 다시 중단하고 1분 동안 10, 000배 g에서 튜브를 원심분리합니다.PBS의 1 밀리리터로 강수량을 다시 중단하고 혈우세포계를 사용하여 스포로조이트수를 계산합니다. 아이메리아 괴사트릭스의 2세대 메로조이트를 수집하려면 노른자 줄기에서 일레오세칼 오리피스까지 닭장 내 장수를 세로로 자르고, 페트리 접시에 PBS 또는 HBSS로 부드럽게 세 번 씻으십시오. 내장을 조각으로 자르고 소화 버퍼가 있는 원추형 플라스크에 넣습니다.플라스크를 37°C의 마그네틱 믹서에 넣고 30~60분간 교반바를 사용하여 메로조이트를 방출합니다. 인큐베이션 30분 후, 5분마다 현미경 검사를 통해 메로조이트 방출을 모니터링합니다. 메로조이트정화를 위해 소화된 메로조이트(merozoites)를 4겹에 걸쳐 붓고 50밀리리터 튜브로 걸러내고, 10분 동안 600배 g의 원심분리를 한다.원심 분리 후 장 잔해가 들어있는 상체를 폐기하십시오. 정제된 메로조이트로 강수량을 1.5밀리리터 튜브로 옮기. PBS의 1 밀리리터로 강수량을 다시 중단하고 혈류계를 사용하여 메로조이트수를 계산합니다.먼저, 10분 동안 600배 g에서 산포로조이트 또는 메로조이트 서스펜션원심분리를 합니다. 그런 다음 상체를 폐기하십시오. 다음 순서로, 핵 형질 완충제 85 마이크로 리터, 플라스미드 10 마이크로 그램, 및 25 단위의 제한 효소를 스포로조이트 또는 메로조이트함유 1.5 밀리리터 튜브에 추가합니다.서스펜션을 핵 트랜스펙트 컵으로 옮기. 컵을 핵 전달 홈에 넣습니다. 전원 버튼을 사용하여 핵성형 장치를 켜고, 형질 전환 절차 U-033을 선택한다.프로그램이 끝나면 핵형성 장치의 X 버튼을 누르면 화면이 OK를 표시하여 핵포션이 성공했음을 나타냅니다. 0.5를 덜벡코의 수정된 이글 의 매체에 넣고 핵을 제거하여 반응을 멈춥시다. 부드럽게 혼합 한 후 서스펜션을 1.5 밀리리터 튜브로 옮기십시오.뉴클레오감염 기생충을 7일 된 닭으로 접종한다. 에이메리아 괴사트릭스 또는 에이메리아 테넬라의 스포로조이트의 메로조이트는 클로아컬 루트를 통해 접종하지만 정맥 주사를 통해 에이메리아 아세르불리나 스포로조이트에 접종한다. 대변에서 난모세포를 수집한 후, 형광 활성 세포 분류및 1킬로그램 피리메타민당 150 밀리그램을 사용하여 형질 전환 인구 비율을 증가시킵니다.이 프로토콜은 eimerian 기생충을 transfect에 사용되었습니다. 이 연구에서는 밀도 그라데이션 솔루션을 사용한 후 Eimeria 테넬라의 스포로시스트 및 스포로요이트뿐만 아니라 Eimeria 테넬라의 스포로시스트 및 스포로조이트뿐만 아니라 2세대 메론트와 메로조이트가 여기에 표시됩니다. 뉴클레오감염 된 메로조이트와 뉴클레오 감염 스포로조이트에 감염된 후 에이메리아 테넬라의 난모세포에 감염된 후 아이메리아 괴사의 난모의 이미지는 성공적인 뉴클레오션을 나타낸다.이 절차를 시도하는 동안 가장 중요한 것은 스포로조이트와 메로조이트의 정제가 성공하고 스포로시스트와 스포로조이트는 더 정제되도록하면서 OS2를 제거하기 위해 50 % 밀도 그라데이션 솔루션을 사용하는 것입니다. 이 절차에 따라, 당신은 미래에 Eimeria 기생충의 트랜스퍼링을 단순화하기 위해 난모세포 또는 스포로시스트를 위장과 같은이 프로토콜을 최적화 할 수 있습니다. 아이메리아에서 의 형질 전환의 발달과 함께, 아이메리아의 CRISPR-Cas9 기술은 Eimeria의 신중한 유전자 조작을 크게 제시하고 적합한 백신 전달 수단으로 적용 될 것으로 예상될 것입니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

인간의 배아 줄기 (ES) 세포의 전파

연구

생물학

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The study of development has been greatly aided by the use of the chick embryo as an experimental model.  The ease of accessibility of the embryo has ...

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Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

주사 투과 전자 단층 촬영에 의해 준비 및 두꺼운 생물 샘플의 관측

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...