Name: nucleofection and in vivo propagation of chicken eimeria parasites
Uploaded: 2020-02-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites at JoVE.com

Bu çalışma Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2017YFD0501200) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31572507, 31772728 ve 31873007) tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan deneyleri için Tavuklar ev sahipliği ve Çin Tarım Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi yönergelerine göre muhafaza edildi ve Biyomedikal Araştırma Hayvanlar içeren için Uluslararası Rehberlik İlkeleri izledi. Deneyler Pekin Laboratuvar Hayvanları Yönetim Komitesi tarafından onaylandı.
1. Eimeria spp. sporozoitlerinin çıkarılması ve arıtımı (örn. E. tenella)
<ol><li>Sporokistlerin salınımı<ol>
<li>5 dk. 2.300 x g.'...

<ol>
	<li>Suo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+and+economic+benefits+of+Supercox,+a+live+anticoccidial+vaccine+in+a+commercial+trial+in+broiler+chickens+in+China.">The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China.</a> Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).</li><li>Kim, K., Soldati, D., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+replacement+in+Toxoplasma+gondii+with+chloramphenicol+acetyltransferase+as+selectable+marker.">Gene replacement in Toxoplasma gondii with chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker.</a> Science. 262 (5135), 911-914 (1993).</li><li>Sibley, L. D., Messina, M., Niesman, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+DNA+transformation+in+the+obligate+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii+by+complementation+of+tryptophan+auxotrophy.">Stable DNA transformation in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii by complementation of tryptophan auxotrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5508-5512 (1994).</li><li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+molecular+transformation+of+Toxoplasma+gondii:+a+selectable+dihydrofolate+reductase-thymidylate+synthase+marker+based+on+drug-resistance+mutations+in+malaria.">Stable molecular transformation of Toxoplasma gondii: a selectable dihydrofolate reductase-thymidylate synthase marker based on drug-resistance mutations in malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11703-11707 (1993).</li><li>Soldati, D., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+and+expression+in+the+obligate+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii.">Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii.</a> Science. 260 (5106), 349-352 (1993).</li><li>Goonewardene, R., Daily, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+the+malaria+parasite+and+expression+of+firefly+luciferase.">Transfection of the malaria parasite and expression of firefly luciferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5234-5236 (1993).</li><li>Kelleher, M., Tomley, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+of+beta-galactosidase+in+differentiating+sporozoites+of+Eimeria+tenella.">Transient expression of beta-galactosidase in differentiating sporozoites of Eimeria tenella.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 97 (1-2), 21-31 (1998).</li><li>Clark, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+facilitating+stable+transfection+of+Eimeria+species.">A toolbox facilitating stable transfection of Eimeria species.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 162 (1), 77-86 (2008).</li><li>Yan, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transfection+of+Eimeria+tenella:+Constitutive+expression+of+the+YFP-YFP+molecule+throughout+the+life+cycle.">Stable transfection of Eimeria tenella: Constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout the life cycle.</a> International Journal for Parasitology. 39 (1), 109-117 (2009).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+Eimeria+mitis+with+Yellow+Fluorescent+Protein+as+Reporter+and+the+Endogenous+Development+of+the+Transgenic+Parasite.">Transfection of Eimeria mitis with Yellow Fluorescent Protein as Reporter and the Endogenous Development of the Transgenic Parasite.</a> PloS One. 9 (12), e114188 (2014).</li><li>Duan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transfection+of+Eimeria+necatrix+through+nucleofection+of+second+generation+merozoites.">Stable transfection of Eimeria necatrix through nucleofection of second generation merozoites.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. , 1-5 (2019).</li><li>Li, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Eimeria+mitis+expressing+chicken+interleukin+2+stimulated+higher+cellular+immune+response+in+chickens+compared+with+the+wild-type+parasites.">Transgenic Eimeria mitis expressing chicken interleukin 2 stimulated higher cellular immune response in chickens compared with the wild-type parasites.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 533 (2015).</li><li>Clark, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eimeria+species+parasites+as+novel+vaccine+delivery+vectors:+anti-Campylobacter+jejuni+protective+immunity+induced+by+Eimeria+tenella-delivered+CjaA.">Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors: anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeria tenella-delivered CjaA.</a> Vaccine. 30 (16), 2683-2688 (2012).</li><li>Eckert, J., Braun, R., Shirley, M. W., Coudert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eimeria+species+and+strains+of+chickens.">Eimeria species and strains of chickens.</a> Biotechnology: Guidelines on techniques in coccidiosis research. Part. I: Eimeria and Isospora, 1-24 (1995).</li><li>Kurth, M., Entzeroth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+gene+expression+in+cell+culture+stages+and+oocysts+of+Eimeria+nieschulzi+(Coccidia,+Apicomplexa).">Reporter gene expression in cell culture stages and oocysts of Eimeria nieschulzi (Coccidia, Apicomplexa).</a> Parasitology Research. 104 (2), 303-310 (2009).</li><li>Tao, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Eimeria+magna+Perard,+1925+Displays+Similar+Parasitological+Properties+to+the+Wild-type+Strain+and+Induces+an+Exogenous+Protein-Specific+Immune+Response+in+Rabbits+(Oryctolagus+cuniculus+L.).">Transgenic Eimeria magna Perard, 1925 Displays Similar Parasitological Properties to the Wild-type Strain and Induces an Exogenous Protein-Specific Immune Response in Rabbits (Oryctolagus cuniculus L.).</a> Frontiers in Immunology. 8, 2 (2017).</li><li>Shi, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Transfection+of+Eimeria+intestinalis+and+Investigation+of+Its+Life+Cycle,+Reproduction+and+Immunogenicity.">Stable Transfection of Eimeria intestinalis and Investigation of Its Life Cycle, Reproduction and Immunogenicity.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 807 (2016).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+telomerase-interacting+OTU+protein+of+Eimeria+tenella+and+its+telomerase-regulating+activity.">A novel telomerase-interacting OTU protein of Eimeria tenella and its telomerase-regulating activity.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (8), 744-745 (2017).</li><li>Li, J. N., Zou, J., Yin, G. W., Liu, X. Y., Suo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+DNA+could+be+delivered+into+Eimeria+maxima+unsporulated+oocyst+with+gene+gun+system.">Plasmid DNA could be delivered into Eimeria maxima unsporulated oocyst with gene gun system.</a> Acta Polytechnica Hungarica. 60 (4), 431-440 (2012).</li></ol>

1990'larda apikompleks parazitler için bir transfeksiyon sistemi geliştirilmiş ve eimerian parazitler üzerinde çalışmalarda kullanılmıştır. Son zamanlarda, kararlı transfeksiyon E. tenella8yapıldı ,9 ve E. nieschulzi15. İkinci nesil merozoitler 11'i dönüştürerek E. necatrix'in kararlı transfeksiyonuna ulaştık. E. acervulina transfected sporozoitlerin kanat da...

Eimeria spp. koksidoza neden olur ve bu da hayvancılık ve kümes hayvanları endüstrisinde önemli ekonomik kayıplara yol açar. Antikokokidiyal ilaçlar, ve bir ölçüde, zayıflatılmış antikokokidiyal aşılar, coccidiosis kontrolü için yaygın olarak kullanılmaktadır rağmen, hala onların ilaç direnci ile ilgili eksiklikler vardır, ilaç artıkları, ve virülans yeniden aşı suşlarının potansiyel difüzyon1. Moleküler biyolojinin gelişmesiyle transfeksiyon, gen fonksiyonlarını incelemek, yeni aşılar geliştirmek ve Eimeriaiçin yeni ilaç hedeflerinitleme için hayati bir araç haline gelmiştir.
Son yıllarda, transfeksiyon plazmodium ve Toxoplasma gondii2,3,4,5,6gibi apicomplexan parazitler için başarıyla uygulanmıştır. E. tenella transfection için bir muhabir olarak β-gal kullanarak bir çalışma Eimeria7gibi çalışma pilot . E. tenella8transfeksiyon ,9, E. mitis10, ve E. acervulina (Zhang ve ark., yayınlanmamış veri) tavukbaşarılı oldu. Son zamanlarda, biz nükleofection11ile E. necatrix merozoitler kullanarak transfeksiyon elde etti.
Çalışmalar eimeria heterolog antijen ifade bir rekombinant aşı olarak geliştirilebilir potansiyeline sahip olduğunu gösterdi, bu campylobacter jejuni antijen A ifade gibi (CjaA) veya tavuk interlökin 2 (chIL-2)12,13. Bu nedenle, bu protokol tavuklarda Eimeria spp. bir nükleofection çalışma açıklar. Prosedür, sporozoitlerin veya merozoitlerin saflaştırılmasını, plazmid DNA ile nükleofeksiyonu, kloakal aşılama/intravenöz enjeksiyonu ve araştırmacıların transgenik Eimeria parazitleri üzerinde çalışmalara başlamalarına yardımcı olmak için in vivo yayılımı tanımlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ATP-disodium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A26209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose DE-52</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C8350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Flow Pump</td>
			<td>SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD.</td>
			<td>HL-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>MACGENE</td>
			<td>CM15019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z250473-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>No. V900116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Biotopped</td>
			<td>G6200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>MACGENE</td>
			<td>CC016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>No. V900041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Speed Centrifuge</td>
			<td>BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD.</td>
			<td>DT5-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Mixer</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>MS-H280-Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>449164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo cell sorter</td>
			<td>BeckMan Coulter, US</td>
			<td>201309995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofection device</td>
			<td>LONZA/amaxa</td>
			<td>90900012 (Nucleofector II)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (DG gradient stock solution)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium taurodeoxycholate hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Beijing North TZ-Biotech Develop.co.</td>
			<td>HQ-60-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath Thermostat</td>
			<td>Grant Instruments (Cambridge), Ltd.</td>
			<td>GD120,GM0815010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nucleofection and in vivo propagation of chicken eimeria parasites

Transfeksiyon, DNA ve çift iplikli RNA gibi genetik materyalin ilgi genini değiştirmek için hücrelere teslim edildiği teknik bir süreçtir. Şu anda, transgenik teknoloji Eimeriaçalışma için vazgeçilmez bir araç haline geliyor , kümes hayvanları ve hayvancılık koksidoz nedensel ajanlar. Bu protokol eimerian parazitlerde kararlı transfeksiyonun ayrıntılı bir tanımını sağlar: sporozoitlerin veya ikinci nesil merozitlerin saflaştırılması ve nükleofeslenmesi ve transfected parazitlerin in vivo yayılımı. Bu protokolü kullanarak, Eimeriaçeşitli türlerde transfection elde etti. Birlikte ele alındığında, nükleofection eimerian parazitlerde genetik manipülasyon kolaylaştırmak için yararlı bir araçtır.

Bu protokol eimerian parazitleri nakletmek için kullanılmıştır. Bu çalışmada Şekil 2A ve Şekil 2B'de E. necatrix'in 2. nesil meront ve merozoitleri gösterilmiştir, Şekil 2C ve Şekil 2D yoğunluk gradyan çözeltileri kullanılarak E. tenellasporocysts ve sporozo...

Watch this Scientific Journal Video about Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites at JoVE.com

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Burada, sporozoitler veya ikinci nesil merozoitler nükleofekting tavuk Eimeria parazitlerin kararlı transfeksiyon elde etmek için bir yöntem sağladı. Heterolog antijenik genleri ifade eden genetiği değiştirilmiş eimerian parazitler aşı dağıtım aracı olarak kullanılabilir.

Tavuk Eimeria Parazitlerinin Nükleofeksiyon uyup In Vivo Propagation

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of ...

Eimeria türleri için transfeksiyon protokollerinin oluşturulması gen fonksiyonlarının incelenmesine, yeni aşıların geliştirilmesine ve Eimeria için yeni ilaç hedeflerinin taranmasına yardımcı olacaktır. Bu tekniği kullanarak, Eimeria'nın çeşitli türlerinin transfeksiyonuna ulaştık ve nükleofeksiyon eimerian parazitlerde genetik manipülasyon uygulamasını kolaylaştırmak için yararlı bir araçtır. Eimeria'nın çekirdekleri, in vitro olarak kültüre geçirilemeyecek diğer parazitlerin transfeksiyonu için bir referans sağlar ve genetik manipülasyon çalışmalarını hızlandırır.Bu tekniği ilk kez denerseniz, deney sırasında çırpınmamak için transfeksiyon başlamadan önce tüm reaktifleri ve aletlerini iyi hazırlamalısınız. Bu yöntemin gerçekleştirilmesi, Eimeria'nın transfeksiyonuna odaklanan insanların bu deneyin karmaşık ayrıntılarını görmelerine yardımcı olur. Sporokistlerin salınımı ile başlamak için, potasyum dikromat çözeltisi içinde yedi sporlu ookistler bir kez 10 2, 5 dakika için 300 kez g santrifüj.PBS ile üç kez yıkayın. PBS bir mililitre ile pelet resuspend ve 15 mililitrelik bir tüp karışımı aktarın. Bir milimetre çapında cam boncuk eşit hacim ekleyin ve sporokistler serbest bırakmak için bir girdap karıştırıcı kullanarak ookist süspansiyon salınım.Her dakika, mikroskopi ile sporokistlerin salınımını izlemek. Ookistlerin %90'ından fazlası kırıldığında girdaplamayı bırakın. Sporokist süspansiyonu yeni 1.5 mililitrelik tüplere aktarın ve santrifüj1, 600 kez g beş dakika.Çökeltiyi %50 yoğunlukgradient çözeltinin mililitresi ile yeniden askıya alın ve 10,000 kez g'de bir dakika santrifüj edin. Sporozoitleri serbest bırakmak için, ekssistosit tamponu ile çökelti yeniden askıya almak ve sporozoitler serbest bırakmak için 40 ila 60 dakika boyunca 42 derece santigrat su banyosu kuluçka. Ekssestasyon sırasında tüpleri her beş dakikada bir çalkalayın.Sporozoitlerin %90'ından fazlası serbest bırakıldığında kuluçkayı bırakın. 10 dakika boyunca 600 kez g santrifüj. %55 yoğunlukgradient çözeltinin mililitresi ile yağışı yeniden askıya alın ve tüpü 10,000 kez g'de bir dakika santrifüj edin.PBS bir mililitre ile yağış resuspend ve bir hemositometre kullanarak sporozoitler saymak. Eimeria necatrix ikinci nesil merozoites toplamak için, ileocekal orifice sarısı sapı uzunlamasına tavuk bağırsağı kesti ve hafifçe bir Petri kabında PBS veya HBSS ile üç kez yıkayın. Parçalara bağırsak kesin ve bir sindirim tampon ile konik bir şişe yerleştirin.Merozoitler serbest bırakmak için 30 ila 60 dakika karıştırma çubuğu ile 37 santigrat derece bir manyetik karıştırıcı üzerine şişe yerleştirin. Kuluçka 30 dakika sonra, mikroskobik inceleme ile her beş dakikada bir merozoitlerin salınımını izlemek. Merozoitleri arındırmak için, sindirilmiş merozoitleri içeren süspansiyonu gazlı bezin dört katmanı üzerine dökün ve tüpleri 10 dakika boyunca 600 kez g'de santrifüj edin.Santrifüjden sonra, bağırsak enkaz içeren supernatant atın. Saflaştırılmış merozoitlerle yağışı 1.5 mililitrelik tüplere aktarın. PBS bir mililitre ile yağış resuspend ve bir hemositometre kullanarak merorositler saymak.İlk olarak, 10 dakika boyunca 600 kez g sporozoit veya merozoit süspansiyon santrifüj. Sonra supernatant atın. Aşağıdaki sırayla, sporozoitler veya merozoitler içeren 1.5 mililitrelik tüp içine nükleer transfeksiyon tampon85 mikrolitre, plazmid 10 mikrogram ve restriksiyon enzim 25 birim ekleyin.Süspansiyonu nükleer transfeksiyon kabına aktarın. Bardağı nükleer transfer oluğuna koy. Güç düğmesini kullanarak nükleofection cihazını açın ve U-033 transfeksiyon prosedürünü seçin.Program bittiğinde, nükleofection cihazının X düğmesine basın ve ekran tamam'ı görüntüleyerek nükleofection'ın başarılı olduğunu gösterir. Reaksiyonu durdurmak için çekirdeklik kabına 0,5 ila bir mililitre Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta ekleyin. Yavaşça karıştırdıktan sonra süspansiyonu 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.Çekirdekleri yedi günlük tavuklara dönüştürün. Eimeria necatrix meozoitler veya kloakal rota ile Eimeria tenella sporozoitler aşılamak, ama intravenöz enjeksiyon yoluyla Eimeria acervulina sporozoitler inoculate. Dışkıookistler topladıktan sonra, transgenik popülasyon oranını artırmak için floresan aktive hücre sıralaması ve kilogram başına 150 miligram pirimememin kullanın.Bu protokol eimerian parazitleri nakletmek için kullanılmıştır. Bu çalışmada, Eimeria necatrix'in ikinci nesil merontları ve merozoitleri ve yoğunluk gradyan solüsyonlarını kullandıktan sonra Eimeria tenella'nın sporokistleri ve sporozoitleri burada gösterilmiştir. Eimeria necatrix ookistlerinin nükleofekted merozoitler ve eimeria tenella ookistleri ile nükleofektomi sporozoitler ile enfekte sonra enfekte sonra görüntüleri başarılı nükleofection gösterir.Bu prosedürü denerken en önemli şey sporozoitlerin ve meroozitlerin arınmasını sağlamak ve sporokistlerin ve sporozoitlerin daha saf olduğundan emin olurken OS2'yi çıkarmak için %50 yoğunlukgradient çözeltisini kullanmaktır. Bu prosedürü takiben, gelecekte Eimeria parazitlerinin transfeksiyon prosedürlerini basitleştirmek için ookist veya sporokist transfeksiyonu gibi bu protokolü optimize edebilirsiniz. Eimeria transfeksiyon gelişimi ile, Eimeria CRISPR-Cas9 teknolojisi önemli ölçüde Eimeria ihtiyatlı genetik manipülasyon ortaya koymak ve uygun bir aşı dağıtım aracı olarak uygulanacak beklenebilir olacaktır.

Research

JoVE Journal

Biology

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

İnsan Embriyonik Kök Hücre (ES) yayılması

Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies

Gelişim Araştırmaları Pencereleme Tavuk Yumurta

The study of development has been greatly aided by the use of the chick embryo as an experimental model.  The ease of accessibility of the embryo has ...

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

Erken Evre Tavuk Embriyolar Büyüme Faktörü-Kaplı Boncuk yerleştirme

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

HH Sahne 10 Tavuk Embriyolar Ovo Electroporations

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vivo ve in vitro Adaptör-clathrin Etkileşim Çalışmaları

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Hücre Tek katmanlar mekanik uyarılması bağlı Kalsiyum Dalga Yayılım: Sığır Kornea Endotel Hücreleri Örneği

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Sitoplazmik DNA Algılama Pathways uyarılması<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

Fare Testis İn Vivo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

sertliği ölçme<em&gt; Ex Vivo</emAtomik Kuvvet Mikroskobu Kullanma&gt; Fare aorta

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Tarama Transmisyon Elektron Tomografi ile hazırlanması ve Kalın Biyolojik Örneklerinin Gözlem

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...