Name: purification of prominin-1+ stem cells from postnatal mouse cerebellum
Uploaded: 2020-04-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum at JoVE.com

نشكر أعضاء مختبر أوبال على اقتراحاتهم. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة المنح 1RO1 NS062051 و 1RO1NS08251 (أوبال P)

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا ً لدليل المعاهد القومية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (2011) وتمت الموافقة عليها من قبل جامعة نورث وسترن IACUC (بروتوكول IS00011368).
1- إعداد الحلول
<ol><li>إعداد محلول انفصال الأنسجة المصنوعة من الفينول المعقم المحتوي على أحمر الحمرا?...

<ol>
	<li>Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellum:+history.">Cerebellum: history.</a> Neuroscience. 162, 549-559 (2009).</li><li>Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+modulation+of+the+reward+circuitry+and+social+behavior.">Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior.</a> Science. 363, (2019).</li><li>Sathyanesan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+connections+between+cerebellar+development,+behaviour+and+complex+brain+disorders.">Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 20, 298-313 (2019).</li><li>Wagner, M. J., Kim, T. H., Savall, J., Schnitzer, M. J., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+granule+cells+encode+the+expectation+of+reward.">Cerebellar granule cells encode the expectation of reward.</a> Nature. 544, 96-100 (2017).</li><li>Araujo, A. P. B., Carpi-Santos, R., Gomes, F. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Astrocytes+in+the+Development+of+the+Cerebellum.">The Role of Astrocytes in the Development of the Cerebellum.</a> Cerebellum. , (2019).</li><li>Seto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+identity+transition+from+Purkinje+cell+progenitors+to+GABAergic+interneuron+progenitors+in+the+cerebellum.">Temporal identity transition from Purkinje cell progenitors to GABAergic interneuron progenitors in the cerebellum.</a> Nature Communication. 5, 3337 (2014).</li><li>Marzban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+commitment+in+the+developing+cerebellum.">Cellular commitment in the developing cerebellum.</a> Frontiers in Cell Neurosciences. 8, 450 (2014).</li><li>Koziol, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+paper:+the+cerebellum's+role+in+movement+and+cognition.">Consensus paper: the cerebellum's role in movement and cognition.</a> Cerebellum. 13, 151-177 (2014).</li><li>Ben-Arie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+essential+for+genesis+of+cerebellar+granule+neurons.">Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons.</a> Nature. 390, 169-172 (1997).</li><li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors.">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48, 17-24 (2005).</li><li>Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+expression+redefines+the+rhombic+lip+derivatives+and+reveals+novel+lineages+within+the+brainstem+and+cerebellum.">Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum.</a> Neuron. 48, 31-43 (2005).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+population+of+Nestin-expressing+progenitors+in+the+cerebellum+exhibits+increased+tumorigenicity.">A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity.</a> Nature Neurosciences. 16, 1737-1744 (2013).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum.">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nature Neurosciences. 8, 723-729 (2005).</li><li>Toren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133-positive+hematopoietic+stem+cell+"stemness"+genes+contain+many+genes+mutated+or+abnormally+expressed+in+leukemia.">CD133-positive hematopoietic stem cell "stemness" genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia.</a> Stem Cells. 23, 1142-1153 (2005).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prominin+1+marks+intestinal+stem+cells+that+are+susceptible+to+neoplastic+transformation.">Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation.</a> Nature. 457, 603-607 (2009).</li><li>Man, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Role+for+the+DNA+Sensor+AIM2+in+Stem+Cell+Proliferation+and+Cancer.">Critical Role for the DNA Sensor AIM2 in Stem Cell Proliferation and Cancer.</a> Cell. 162, 45-58 (2015).</li><li>Fleming, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Purkinje+neuron+acts+as+a+central+regulator+of+spatially+and+functionally+distinct+cerebellar+precursors.">The Purkinje neuron acts as a central regulator of spatially and functionally distinct cerebellar precursors.</a> Developmental Cell. 27, 278-292 (2013).</li><li>Panchision, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+flow+cytometric+analysis+of+central+nervous+system+tissue+reveals+novel+functional+relationships+among+cells+expressing+CD133,+CD15,+and+CD24.">Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24.</a> Stem Cells. 25, 1560-1570 (2007).</li><li>Beaudoin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+pyramidal+neurons+from+the+early+postnatal+mouse+hippocampus+and+cortex.">Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex.</a> Nature Protocols. 7, 1741-1754 (2012).</li><li>Edamakanti, C. R., Do, J., Didonna, A., Martina, M., Opal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+ataxin1+disrupts+cerebellar+development+in+spinocerebellar+ataxia+type+1.">Mutant ataxin1 disrupts cerebellar development in spinocerebellar ataxia type 1.</a> Journal of Clinical Investigation. 128, 2252-2265 (2018).</li><li>Erlandsson, A., Enarsson, M., Forsberg-Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immature+neurons+from+CNS+stem+cells+proliferate+in+response+to+platelet-derived+growth+factor.">Immature neurons from CNS stem cells proliferate in response to platelet-derived growth factor.</a> Journal of Neurosciences. 21, 3483-3491 (2001).</li><li>Galli, R., Pagano, S. F., Gritti, A., Vescovi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuronal+differentiation+in+human+CNS+stem+cell+progeny+by+leukemia+inhibitory+factor.">Regulation of neuronal differentiation in human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor.</a> Developmental Neurosciences. 22, 86-95 (2000).</li><li>Silbereis, J., Cheng, E., Ganat, Y. M., Ment, L. R., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursors+with+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+Promoter+Activity+Transiently+Generate+GABA+Interneurons+in+the+Postnatal+Cerebellum.">Precursors with Glial Fibrillary Acidic Protein Promoter Activity Transiently Generate GABA Interneurons in the Postnatal Cerebellum.</a> Stem Cells. 27, 1152-1163 (2009).</li><li>Parmigiani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+Bipotency+of+Astroglial-Like+Cerebellar+Progenitors+along+the+Interneuron+and+Glial+Lineages.">Heterogeneity and Bipotency of Astroglial-Like Cerebellar Progenitors along the Interneuron and Glial Lineages.</a> Journal of Neurosciences. 35, 7388-7402 (2015).</li><li>Wojcinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+granule+cell+replenishment+postinjury+by+adaptive+reprogramming+of+Nestin(+)+progenitors.">Cerebellar granule cell replenishment postinjury by adaptive reprogramming of Nestin(+) progenitors.</a> Nature Neurosciences. 20, 1361-1370 (2017).</li><li>Yang, Z., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP1+is+involved+in+replenishment+of+granule+cell+precursors+following+injury+to+the+neonatal+cerebellum.">YAP1 is involved in replenishment of granule cell precursors following injury to the neonatal cerebellum.</a> Developmental Biology. 1606 (19), 30207 (2019).</li><li>Wang, S. S., Kloth, A. D., Badura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebellum,+sensitive+periods,+and+autism.">The cerebellum, sensitive periods, and autism.</a> Neuron. 83, 518-532 (2014).</li><li>Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+down+and+one+to+go:+modeling+medulloblastoma+subgroups.">Three down and one to go: modeling medulloblastoma subgroups.</a> Cancer Cell. 21, 137-138 (2012).</li><li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+is+a+positive+marker+for+a+distinct+class+of+primitive+human+cord+blood-derived+CD34-negative+hematopoietic+stem+cells.">CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells.</a> Leukemia. 28, 1308-1315 (2014).</li></ol>

الخلايا الجذعية الركرياتين-1-التعبير عن المخيخ يقيم في المادة البيضاء المحتملة خلال الأسابيع 3 الأولى من الحياة بعد الولادة. يتم التحكم في انتشارها بإحكام من قبل مسار القنفذ الصوتي الذي تدعمه خلايا Purkinje17. هذه الخلايا الجذعية / السلف تسهم في لاحق ولدت GABAergic interneurons تسمى خلايا ال?...

وقد اعترف المخيخ منذ فترة طويلة كدائرة الخلايا العصبية الرئيسية تنسيق الحركة الطوعية1. ويتلقى مدخلات من مساحات واسعة من المحور العصبي ، والذي يتضمن معلومات تنبؤية من المحيط ، وذلك لضبط إخراج المحرك وتنسيق الحركة. في الآونة الأخيرة ، كما تورط في تنظيم الإدراك والعواطف عن طريق استخدام شبكات معالجة المعلومات المماثلة2،3،4.
يتكون المخيخ البالغ من قشرة المخيخ الخارجي والمادة البيضاء الداخلية. تتخللها داخل هذه الهياكل هي نواة عميقة intracerebellar. على غرار بقية الجهاز العصبي ، يتم تحفيز تطور المخيخ بسبب انتشار الخلايا السلف متعددة القدرات (الخلايا الجذعية) التي تهاجر وتفرق لتسفر عن هذا الهيكل المنظم جيدًا. في التنمية المبكرة (E10.5 -E13.5) ، والمتخصصة الجذعية البطينية حول البطين الرابع النامية يولد الخلايا العصبية GABAergic (أي، خلايا Purkinje، خلايا لوغانو، خلايا غولجي) جنبا إلى جنب مع بيرغمان غليا5،6،7،8.
في وقت لاحق في التنمية (بعد الولادة الأسبوع الأول), مكانة الخلية الجذعية الثانية في الشفة rhombic يولد MATH1- ونستين التعبير عن السلف التي تؤدي إلى الخلايا العصبية الحبيبية مثير9,10,11,12. في الآونة الأخيرة تم وصف مكانة ثالثة للخلايا الجذعية13. هذه الخلايا التعبير عن prominin-1 (المعروف أيضا باسم CD133), غشاء تمتد الجليكوبروتين الذي يحدد مجموعة فرعية من الخلايا الجذعية في الأمعاء والنظم الهيماتوبويتيك14,,15,,16. في خريطة مصير الجسم الحي يظهر أن هذه الخلايا الجذعية تولد الطبقة الجزيئية الرئيسية interneurons (أي خلايا السلال والخلايا ستيلاتي)، جنبا إلى جنب مع الخلايا الفلكية، خلال الأسابيع الثلاثة الأولى بعد الولادة. في الماضي، كان من الصعب دراسة هذه الخلايا في المختبر لأن الأساليب السابقة قد تتطلب تقنيات مكلفة وتستغرق وقتا طويلا (أي، فرز الخلايا المنشطة فلورسينس [FACS]) التي تعتمد على prominin-1 تلطيخ12،,13،,17. يصف هذا البروتوكول طريقة تعتمد على المغناطيسية المناعية لعزل هذه الخلايا الجذعية التي يمكن بعد ذلك أن تكون مثقفة ومتمايزة بسهولة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05%Trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td>0.05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% B27</td>
			<td>Gibco; Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mM EDTA solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- Prominin-1 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biote</td>
			<td>130-092-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>culture plates ultra - low attachment</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4513-1VL</td>
			<td>250 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution-HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G507A</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G502A</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>l-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy</td>
			<td>Lieca TCS SP5 confocal microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Prominin-1</td>
			<td>Affymetrix eBioscience</td>
			<td>14-1331</td>
			<td>1 in 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab27952</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4</td>
			<td>Millopore</td>
			<td>MAB345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>(100 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet- Derived Growth Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8291</td>
			<td>10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-tubulin, b-III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2200</td>
			<td>1 in 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabit anti-GFAP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>1 in 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation columns-MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>40um</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of prominin-1+ stem cells from postnatal mouse cerebellum

معظم الخلايا العصبية المخيخ تنشأ من اثنين من المنافذ الجذعية الجنينية: كوة الشفاه rhombic، الذي يولد جميع الخلايا العصبية الجلوتاتيرية المنقفية المخيخ، ومكانة المنطقة البطينية، والتي تولد الخلايا GABAergic Purkinje المثبطة، والتي هي الخلايا العصبية التي تشكل نواة المخيخ العميق وبيرغمان جليا. في الآونة الأخيرة ، وصفت مكانة ثالثة للخلايا الجذعية التي تنشأ كمنطقة إنباتية ثانوية من منطقة البطين. يتم تعريف خلايا هذا المتخصصة من قبل علامة سطح الخلية prominin-1 ويتم توطينها إلى المسألة البيضاء النامية من المخيخ بعد الولادة. هذا المتخصصة حسابات للطبقة الجزيئية ولدت في وقت متأخر GABAergic interneurons جنبا إلى جنب مع الخلايا الفلكية المخيخ ولدت بعد الولادة. بالإضافة إلى دورها التنموي ، تكتسب هذه المتخصصة أهمية ترجمة فيما يتعلق بمشاركتها في التنكس العصبي وورم. كان من الصعب فك شفرة بيولوجيا هذه الخلايا بسبب عدم وجود تقنيات فعالة لتنقيتها. أظهرت هنا هي أساليب فعالة لتنقية والثقافة، والتمييز بين هذه الخلايا الجذعية المخيخ بعد الولادة.

شكلت الخلايا الجذعية المخيخية الإيجابية من برومينين-1 بعد الولادة الخلايا العصبية في الغلاف العصبي المتوسط الغني بعوامل النمو (EGF و bFGF). كانت هذه الخلايا العصبية إيجابية لبلتينين-1-تلطيخ، علامة تستخدم للعزل، وأيضا كوصمة عار لعلامات الخلايا الجذعية الأخرى مثل نيستين وGFAP13 <strong c...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum at JoVE.com

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

يتجلى هنا هو وسيلة فعالة وفعالة من حيث التكلفة لتنقية والثقافة ، والتمييز بين الخلايا الجذعية المادة البيضاء من المخيخ الماوس بعد الولادة.

تنقية Prominin-1+ الخلايا الجذعية من المخيخ الماوس بعد الولادة

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

يصف هذا البروتوكول طريقة سهلة وفعالة من حيث التكلفة لتنقية الخلايا الجذعية من المخيخ بعد الولادة. هذه الخلايا الجذعية مسؤولة عن المتأخرات من الولادة المُتدرّبة المشوهة جزيئياً، لكنها أيضاً مسؤولة عن الخلايا الفلكية cerebellar المشتقة بعد الولادة. وهكذا، دراسة هذه الخلايا مهم بوضوح لفهم تطور المخيخ.وباستخدام هذا البروتوكول، فإن عائد الخلايا الجذعية يماثل عائد الاستراتيجية القائمة على FACS والتي عادة ما تكون أكثر تكلفة بعشر مرات. يمكن تعميم هذا البروتوكول لاستخراج الخلايا الجذعية المعبرة عن البرامين-1 من الأنسجة الأخرى مثل الأمعاء ونخاع العظام. تبدأ بوضع الطبق مع الدماغ تحت مجهر تشريح.استخدام غرامة عدد خمسة ملقط لإزالة السحايا والأوعية الدموية الكبيرة من المخيخ، ثم فصل المخيخ من جذع الدماغ باستخدام ملعقة. نقل المخيخ إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر يحتوي على خمسة ملليلترات من الجليد الباردة HBSS حل. شطف ثم decant HBSS.كرر الغسيل مرتين اُكرَان. بعد الشطف الأخير ، أضف خمسة ملليلترات من محلول تفكك الأنسجة القائم على البابين الذي تم تسخينه مسبقًا إلى 37 درجة مئوية. احتضان الأنسجة لمدة 15 دقيقة في حمام الماء 37 درجة مئوية وخلط محتويات الأنبوب ببطء عن طريق عكس ثلاث إلى خمس مرات كل ثلاث دقائق.إعداد قطر واسع وضيق القطر الزجاج باستور ماصة عن طريق تلميع النار على الموقد بونسن. بعد الحضانة، وغسل الأنسجة ثلاث مرات مع خمسة ملليلتر من حل HBSS التأكد من تجنب فقدان الأنسجة أثناء decanting. بعد غسل HBSS الماضي، إضافة خمسة ملليلتر من DPBS مع 250 ميكرولتر من DNAse إلى الأنسجة وفصله عن طريق triturating بلطف 10 إلى 15 مرات مع ماصة باستر قطرها الواسع.ثم استخدام ماصة باستور الضيقة لزيادة triturate الطين الأنسجة 10 مرات. إذا بقيت قطع أكبر من الأنسجة، اضغط عليها ضد الجزء السفلي من الأنبوب مع طرف الماصات وتستمر pipetting حتى يتم تحقيق تعليق غرامة. ضع أنابيب الطرد المركزي على الجليد.ثم سلالة الخلايا المتفككة من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب 50 ملليلتر. قم بالتصفية مع 10 ملليلترات من محلول HBSS البارد الجليدي لضمان مرور الخلايا عبر الشبكة. نقل الخلايا المصفاة إلى أنبوب جديد للطرد المركزي 15 ملليلتر والطرد المركزي في تعليق 300 مرة ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية.ثم استخدام الطامح فراغ لإزالة عظمى تماما. Resuspend بيليه الخلية في 160 ميكرولترات من الجليد الباردة العازلة العمود المغناطيسي. أضف 40 ميكرولترات من الميكروبات المضادة للبرومينين-1 إلى تعليق الخلية.ثم احتضان الأنابيب في الثلاجة لمدة 15 دقيقة للسماح للجسم المضاد لربط الخلايا المعبرة عن البرمينيين-1. اغسل الخلايا بميليلتر إلى مليلتر من عمود العازلة X والطرد المركزي لهم في 300 مرة ز لمدة 10 دقائق. اشعاعات عظمى و resuspend بيليه في ملليلتر واحد من العمود العازلة X.Place الأعمدة المغناطيسية على الحامل المغناطيسي وشطف لهم مرة واحدة مع 500 ميكرولترات من العازلة X.Apply تعليق الخلية المسمى على العمود وجمع تدفق من خلال في أنابيب 15 ملليلتر الطازجة.غسل العمود ثلاث مرات مع 500 ميكرولترات من X.ثم العازلة إزالة الأعمدة من المجال المغناطيسي ووضعها في أنابيب 1.5 ملليلتر. إضافة ملليلتر واحد من الثقافة المتوسطة ودفع المكبس في العمود لطرد الخلايا الموسومة مع الخرز prominin-1. لتمرير الـ neurospheres، نقلها جنبا إلى جنب مع المتوسطة الثقافة في أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر معقمة.بيليه في الاعصاب عن طريق الطرد المركزي في 300 مرة ز لمدة خمس دقائق والتخلص من عظمى. Resuspend بيليه في خمسة ملليلتر من وسائل الإعلام تفكك مع باباين أو 0.05٪ تريبسين الحل واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الطرد المركزي تعليق الخلية مرة أخرى.ثم إعادة تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من وسط الغلاف العصبي وفصلها عن طريق الأنابيب ببطء لهم صعودا وهبوطا 10 مرات مع ماصة باستور. لوحة الخلايا في وسائط الغلاف العصبي كما هو موضح في بروتوكول النص وإثراء لهم مع neurospheres الثانوية بعد سبعة إلى 10 أيام في الثقافة كما وصف سابقا. عد الخلايا على مقياس الهيموسيت وطبقة العدد الأمثل من الخلايا على لوحات المغلفة بولي-D-lysine للتجارب المستقبلية.العمود تنقية برومينين-1 إيجابية بعد الولادة cerebellar الخلايا الجذعية شكلت الخلايا العصبية في عامل النمو الغنية neurosphere المتوسطة. وكانت هذه الخلايا العصبية إيجابية بالنسبة للبرومينين-1، وهي علامة تستخدم لعزلها ولعلامات الخلايا الجذعية الأخرى مثل النسستين وGFAP. الخلايا في التدفق من خلال السلبية الملطخة لعلامات الخلايا الجذعية برومينين-1 و نستين وإيجابية لعلامة الخلايا العصبية بيتا الثالث tubulin.عند سحب عوامل النمو وفي وجود عامل مثبط لسرطان الدم أو PDGF-AA، فإن الخلايا العصبية الإيجابية prominin-1 تختلف إلى الخلايا العصبية، الخلايا الفلكية و oligodendrocytes. عند محاولة هذه التقنية، من المهم للتأكد من أن يتم دفع الخلايا العصبية من خلال للأجسام المضادة البروميين-1 ويمكن أن تمر لأن الخلايا الطبيعية تميل أيضا إلى تشكيل كتل التي قد تبدو وكأنها الخلايا العصبية. باستخدام هذه الطريقة العزل، يمكن للمرء أن يميز أنساب مشتقة مثل الخلايا العصبية وglia في حالة الصحة والمرض.هذه الطريقة قيمة وتوفر نظرة جديدة على دور الخلايا الجذعية cerebellar في التنمية cerebellar وظروف المرض مثل الرنح spinocerebellar والسرطان.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية كريست من الأنبوبة العصبية الجنينية الفئران

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

عزل بالسكان خلية متميزة من المخيخ تطوير من تسليخ مجهري

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Purification of Mouse Brain Vessels

تنقية ماوس سفن الدماغ

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية البالغة العصبية من المنطقة تحت الثفني ماوس

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

زرع هوموتشرونيك إينتيرنيورون السلائف في أوائل العقول الماوس بعد الولادة

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس العصبية

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

زرع الذرية القشرية الهندسية كيميائياً في عقول الفئران المبكرة بعد الولادة

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

الثقافة الاساسيه للخلايا العصبية معزولة عن المخيخ الفئران الجنينية

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1ÃƒÂ¢Ã‹â€ '3 Mouse Neurogenic Niches

عزل وتوسعة المجالات العصبية من بعد الولادة (P1−3) منافذ عصبية للفأر

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

التمايز العصبي من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في المختبر

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...