Name: purification of prominin-1+ stem cells from postnatal mouse cerebellum
Uploaded: 2020-04-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum at JoVE.com

אנו מודים לחברי המעבדה של אופל על הצעותיהם. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים 1RO1 NS062051 ו 1RO1NS08251 (אופל P)

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם למדריך NIH של הטיפול והשימוש בחיות מעבדה (2011) ואושרו על ידי האוניברסיטה הצפון מערבי IACUC (פרוטוקול IS00011368).
1. הכנת פתרונות
<ol><li>הכנת פתרון דיסוציאציה לרקמות עשוי מתמיסת פנול בצבע אדום המכיל מלוחים באגירה של dulbecco (dpbs) עם פפאין (100 u/ml), ציסטאין (0.2 מ...

<ol>
	<li>Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellum:+history.">Cerebellum: history.</a> Neuroscience. 162, 549-559 (2009).</li><li>Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+modulation+of+the+reward+circuitry+and+social+behavior.">Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior.</a> Science. 363, (2019).</li><li>Sathyanesan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+connections+between+cerebellar+development,+behaviour+and+complex+brain+disorders.">Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 20, 298-313 (2019).</li><li>Wagner, M. J., Kim, T. H., Savall, J., Schnitzer, M. J., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+granule+cells+encode+the+expectation+of+reward.">Cerebellar granule cells encode the expectation of reward.</a> Nature. 544, 96-100 (2017).</li><li>Araujo, A. P. B., Carpi-Santos, R., Gomes, F. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Astrocytes+in+the+Development+of+the+Cerebellum.">The Role of Astrocytes in the Development of the Cerebellum.</a> Cerebellum. , (2019).</li><li>Seto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+identity+transition+from+Purkinje+cell+progenitors+to+GABAergic+interneuron+progenitors+in+the+cerebellum.">Temporal identity transition from Purkinje cell progenitors to GABAergic interneuron progenitors in the cerebellum.</a> Nature Communication. 5, 3337 (2014).</li><li>Marzban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+commitment+in+the+developing+cerebellum.">Cellular commitment in the developing cerebellum.</a> Frontiers in Cell Neurosciences. 8, 450 (2014).</li><li>Koziol, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+paper:+the+cerebellum's+role+in+movement+and+cognition.">Consensus paper: the cerebellum's role in movement and cognition.</a> Cerebellum. 13, 151-177 (2014).</li><li>Ben-Arie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+essential+for+genesis+of+cerebellar+granule+neurons.">Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons.</a> Nature. 390, 169-172 (1997).</li><li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors.">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48, 17-24 (2005).</li><li>Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+expression+redefines+the+rhombic+lip+derivatives+and+reveals+novel+lineages+within+the+brainstem+and+cerebellum.">Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum.</a> Neuron. 48, 31-43 (2005).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+population+of+Nestin-expressing+progenitors+in+the+cerebellum+exhibits+increased+tumorigenicity.">A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity.</a> Nature Neurosciences. 16, 1737-1744 (2013).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum.">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nature Neurosciences. 8, 723-729 (2005).</li><li>Toren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133-positive+hematopoietic+stem+cell+"stemness"+genes+contain+many+genes+mutated+or+abnormally+expressed+in+leukemia.">CD133-positive hematopoietic stem cell "stemness" genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia.</a> Stem Cells. 23, 1142-1153 (2005).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prominin+1+marks+intestinal+stem+cells+that+are+susceptible+to+neoplastic+transformation.">Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation.</a> Nature. 457, 603-607 (2009).</li><li>Man, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Role+for+the+DNA+Sensor+AIM2+in+Stem+Cell+Proliferation+and+Cancer.">Critical Role for the DNA Sensor AIM2 in Stem Cell Proliferation and Cancer.</a> Cell. 162, 45-58 (2015).</li><li>Fleming, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Purkinje+neuron+acts+as+a+central+regulator+of+spatially+and+functionally+distinct+cerebellar+precursors.">The Purkinje neuron acts as a central regulator of spatially and functionally distinct cerebellar precursors.</a> Developmental Cell. 27, 278-292 (2013).</li><li>Panchision, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+flow+cytometric+analysis+of+central+nervous+system+tissue+reveals+novel+functional+relationships+among+cells+expressing+CD133,+CD15,+and+CD24.">Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24.</a> Stem Cells. 25, 1560-1570 (2007).</li><li>Beaudoin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+pyramidal+neurons+from+the+early+postnatal+mouse+hippocampus+and+cortex.">Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex.</a> Nature Protocols. 7, 1741-1754 (2012).</li><li>Edamakanti, C. R., Do, J., Didonna, A., Martina, M., Opal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+ataxin1+disrupts+cerebellar+development+in+spinocerebellar+ataxia+type+1.">Mutant ataxin1 disrupts cerebellar development in spinocerebellar ataxia type 1.</a> Journal of Clinical Investigation. 128, 2252-2265 (2018).</li><li>Erlandsson, A., Enarsson, M., Forsberg-Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immature+neurons+from+CNS+stem+cells+proliferate+in+response+to+platelet-derived+growth+factor.">Immature neurons from CNS stem cells proliferate in response to platelet-derived growth factor.</a> Journal of Neurosciences. 21, 3483-3491 (2001).</li><li>Galli, R., Pagano, S. F., Gritti, A., Vescovi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuronal+differentiation+in+human+CNS+stem+cell+progeny+by+leukemia+inhibitory+factor.">Regulation of neuronal differentiation in human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor.</a> Developmental Neurosciences. 22, 86-95 (2000).</li><li>Silbereis, J., Cheng, E., Ganat, Y. M., Ment, L. R., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursors+with+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+Promoter+Activity+Transiently+Generate+GABA+Interneurons+in+the+Postnatal+Cerebellum.">Precursors with Glial Fibrillary Acidic Protein Promoter Activity Transiently Generate GABA Interneurons in the Postnatal Cerebellum.</a> Stem Cells. 27, 1152-1163 (2009).</li><li>Parmigiani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+Bipotency+of+Astroglial-Like+Cerebellar+Progenitors+along+the+Interneuron+and+Glial+Lineages.">Heterogeneity and Bipotency of Astroglial-Like Cerebellar Progenitors along the Interneuron and Glial Lineages.</a> Journal of Neurosciences. 35, 7388-7402 (2015).</li><li>Wojcinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+granule+cell+replenishment+postinjury+by+adaptive+reprogramming+of+Nestin(+)+progenitors.">Cerebellar granule cell replenishment postinjury by adaptive reprogramming of Nestin(+) progenitors.</a> Nature Neurosciences. 20, 1361-1370 (2017).</li><li>Yang, Z., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP1+is+involved+in+replenishment+of+granule+cell+precursors+following+injury+to+the+neonatal+cerebellum.">YAP1 is involved in replenishment of granule cell precursors following injury to the neonatal cerebellum.</a> Developmental Biology. 1606 (19), 30207 (2019).</li><li>Wang, S. S., Kloth, A. D., Badura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebellum,+sensitive+periods,+and+autism.">The cerebellum, sensitive periods, and autism.</a> Neuron. 83, 518-532 (2014).</li><li>Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+down+and+one+to+go:+modeling+medulloblastoma+subgroups.">Three down and one to go: modeling medulloblastoma subgroups.</a> Cancer Cell. 21, 137-138 (2012).</li><li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+is+a+positive+marker+for+a+distinct+class+of+primitive+human+cord+blood-derived+CD34-negative+hematopoietic+stem+cells.">CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells.</a> Leukemia. 28, 1308-1315 (2014).</li></ol>

Prominin-1-ביטוי המוח בתאי גזע מתגוררים בחומר הלבן פוטנציאליים במהלך 3 השבועות הראשונים של החיים לאחר הלידה. התפשטות שלהם נשלטת בחוזקה על ידי מסלול קיפוד סוניק נתמך על ידי התאים Purkinje17. אלה תאי גזע/ושלתי לתרום בלידה מאוחרת יותר GABAergic הנקרא תאי סל ו stellate תאים. אלה נוירונים מתגוררים בש...

המוח הקצר מזוהה כאחד המעגלים העיקריים של תיאום תנועה מרצון1. הוא מקבל קלט מתוך העיטורים הרחבים של הציר הנוירולוגי, הכולל מידע באמצעות הפריה הפריפריה, כדי לכוונן את התפוקה ולתאם את התנועה. לאחרונה, הוא גם היה מעורב בוויסות ההכרה והרגשות על-ידי שימוש ברשתות עיבוד מידע דומות2,3,4.
המוח החלק המבוגר מורכב מקליפת מוח חיצונית וחומר לבן פנימי. בתוך מבנים אלה הם גרעיני תאיים עמוק. בדומה לשאר מערכת העצבים, ההתפתחות של המוח ה, הוא מונע על ידי התפשטות של תאים בעלי ממון רב עוצמה (תאי גזע) להגר ולהבדיל כדי להניב מבנה מאורגן היטב. בהתפתחות מוקדמת (e 10.5 – e 13.5), נישה גזע חדרית סביב החדר הרביעי המתפתח מייצר נוירונים gabaergic (כלומר, התאים purkinje, לוגרו תאים, התאים golgi) יחד עם ברז גליה5,6,7,8.
מאוחר יותר בפיתוח (postnatal שבוע אחד), נישה תא גזע שני ב שפתו מעובית מייצר MATH1-ו nestin הביע ושלתי כי להצמיח מגרריר הנוירונים הנירע9,10,11,12. לאחרונה הוגדרה נישה של תא גזע שלישי13. תאים אלה express prominin-1 (הידוע גם כ-CD133), גליקופרוטאין מפורש מקרום המגדיר מערכת משנה של תאי גזע במעי ומערכות המטטיות14,15,16. בשנת vivo מיפוי הגורל מראה כי תאי גזע אלה לייצר מפתח מולקולרי שכבה interneurons (כלומר, תאי סל ותאי stellate), יחד עם astrocytes, במהלך שלושת הימים הראשונים לאחר הלידה. בעבר, היה קשה לחקור את התאים האלה בתוך מבחנה משום שיטות קודמות נדרשו טכניקות יקרות זמן רב (כלומר, מיון המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית [facs]) התלויים על12prominin-1כתמים 12,13,17. פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת החיסונית לבידוד של תאי גזע אלה שיכולים לאחר מכן להיות תרבותי בקלות והבדיל.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05%Trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td>0.05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% B27</td>
			<td>Gibco; Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mM EDTA solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- Prominin-1 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biote</td>
			<td>130-092-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>culture plates ultra - low attachment</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4513-1VL</td>
			<td>250 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution-HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G507A</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G502A</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>l-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy</td>
			<td>Lieca TCS SP5 confocal microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Prominin-1</td>
			<td>Affymetrix eBioscience</td>
			<td>14-1331</td>
			<td>1 in 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab27952</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4</td>
			<td>Millopore</td>
			<td>MAB345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>(100 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet- Derived Growth Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8291</td>
			<td>10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-tubulin, b-III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2200</td>
			<td>1 in 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabit anti-GFAP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>1 in 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation columns-MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>40um</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of prominin-1+ stem cells from postnatal mouse cerebellum

הנוירונים המוח ביותר לנבוע משני נישות גזע עובריים: נישה שפתיים מעובית, אשר מייצרת את כל הנוירונים glutamatergic המוח מרגש, ואת נישה אזור חדרית, אשר מייצרת את העכבות GABAergic מעצור התאים Purkinje, אשר הם נוירונים המהווים את גרעיני המוח עמוק ברגמן גליה. לאחרונה, נישה תא גזע שלישי תוארה שנוצר כאזור נבטי משני מנישה אזור חדרית. התאים של נישה זו מוגדרים על ידי משטח התא סמן prominin-1 והם מותאמים לחומר הלבן המתפתח של המוח התחתי לפני הלידה. זה נישה חשבונות עבור שכבה מולקולרית מאוחר נולד GABAergic האינטרנוירונים יחד עם שנוצר postnatally המוח האסטרוציטים. בנוסף לתפקידם ההתפתחותי, נישה זו מקבלת חשיבות טרנסלתית לגבי מעורבותו בניוון שיניים ובטווריגנזה. הביולוגיה של תאים אלה היה קשה לפענח בגלל חוסר טכניקות יעיל לטיהור שלהם. הפגינו כאן הם שיטות יעילות כדי לטהר, תרבות, ולהבדיל אלה תאי גזע לאחר הלידה.

Prominin-1-חיובי פוסט לידה בתאי גזע יצרו כדורים נוירוספירה בינונית נוירוספרה עשיר בגורמי גדילה (EGF ו-bFGF). נוירוספירות אלה היו חיוביות עבור prominin-1-כתמים, הסמן המשמש בידוד, וגם ככתם עבור סמנים תא גזע אחרים כגון Nestin ו GFAP13 (איור 1). ביטוי בסמן תא הגזע נשמר ברחבי התרבות ובמש?...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum at JoVE.com

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

הפגינו כאן היא שיטה יעילה וחסכונית כדי לטהר, תרבות, ולהבדיל בתאי גזע החומר הלבן מתוך המוח הימני של העכבר.

טיהור של Prominin-1+ בתאי גזע מתוך עכבר המוח פוסט לידתיים

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה וחסכונית לטיהור תאי גזע מהקטנום שלאחר הלידה. תאי גזע אלה אחראים לאינטרואורונים שנולדו מאוחר מדי מבחינה מולקולרית, אך הם גם מהווים אסטרוציטים מוחיים שמקורם לאחר הלידה. לכן, לימוד תאים אלה חשוב בבירור להבנת התפתחות המוח הקטן.באמצעות פרוטוקול זה, התשואה של תאי גזע דומה לזו של אסטרטגיה מבוססת FACS שהיא בדרך כלל יקרה פי 10. פרוטוקול זה יכול להיות מוכלל כדי לחלץ prominin-1 המביעים תאי גזע מרקמות אחרות כגון המעי ומח העצם. התחל על ידי הנחת המנה עם המוח תחת מיקרוסקופ ניתוח.השתמש מדפים מספר חמש בסדר כדי להסיר את קרום המוח וכלי דם גדולים מן המוח הקטן, ולאחר מכן להפריד את המוח הקטן מן המוח באמצעות מרית. העבר את המוח הקטן לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של פתרון HBSS קר כקרח. לשטוף אותו ואז decant HBSS.חזור על לשטוף פעמיים נוספות. לאחר שטיפה האחרונה, להוסיף חמישה מיליליטר של פתרון דיסוציאציה רקמות מבוסס פפאין כי כבר התחמם מראש ל 37 מעלות צלזיוס. דגירה הרקמה במשך 15 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לאט לערבב את התוכן של הצינור על ידי היפוך זה שלוש עד חמש פעמים כל שלוש דקות.הכן קוטר רחב וקוטר צר זכוכית פיפיטור פסטר על ידי ליטוש אש מעל מבער בונזן. לאחר הדגירה, לשטוף את הרקמה שלוש פעמים עם חמישה מיליליטר של פתרון HBSS הקפדה להימנע לאבד רקמה תוך decanting. לאחר לשטוף HBSS האחרון, להוסיף חמישה מיליליטר של DPBS עם 250 microliters של DNAse לרקמה ולנתק אותו על ידי triturating בעדינות 10 עד 15 פעמים עם פיפט פסטר קוטר רחב.לאחר מכן השתמש פיפטה פסטר צר כדי עוד יותר triturate תרחיף הרקמה 10 פעמים. אם חתיכות גדולות יותר של רקמה להישאר, לחץ אותם על החלק התחתון של הצינור עם קצה פיפטה ולהמשיך צינורות עד השעיה בסדר מושגת. מניחים את צינורות הצנטריפוגה על קרח.ואז מסננים את התאים המנותקים דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר לצינור של 50 מיליליטר. העליון את המסנן עם 10 מיליליטר של פתרון HBSS קר כקרח כדי להבטיח כי התאים לעבור דרך רשת. מעבירים את התאים המסוננים לצינור צנטריפוגה טרי של 15 מיליליטר ומעבירים את ההשעיה פי 300 למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן השתמשו בשואפטור ואקום כדי להסיר את העל-טבעי לחלוטין. תן שימוש חוזר לכדור התא ב-160 מיקרוליטרים של חיץ עמודים מגנטיים קר כקרח. הוסף 40 מיקרוליטרים של מיקרוביאדות אנטי-פרומינין-1 לתליית התא.לאחר מכן לה הדגירה את הצינורות במקרר במשך 15 דקות כדי לאפשר לנוגדן להיקשר לתאי ההבעה prominin-1. לשטוף את התאים עם אחד עד שני מיליליטר של חיץ עמוד X צנטריפוגה אותם ב 300 פעמים g במשך 10 דקות. שאפו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את גלולת הכדור במיליליטר אחד של מאגר העמודות X.Place העמודים המגנטיים על הכן המגנטי ושטוף אותם פעם אחת עם 500 מיקרוליטרים של חיץ X.Apply המתלה התא המסומן על העמודה ולאסוף את flowthrough בצינורות טריים 15 מיליליטר.לשטוף את העמודה שלוש פעמים עם 500 microliters של חיץ X.Then להסיר את העמודים מהשדה המגנטי ולמקום אותם 1.5 צינורות מיליליטר. הוסף מיליליטר אחד של מדיום תרבות ולדחוף את הבוכנה לתוך העמודה כדי לשטוף את התאים מתויגים עם חרוזים prominin-1. כדי לעבור את הנוירוספרות, להעביר אותם יחד עם מדיום התרבות לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי 15 מיליליטר.גלולה את הנוירוספרות על ידי צנטריפוגה ב 300 פעמים g במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant. Resuspend גלולה בחמישה מיליליטר של מדיה דיסוציאציה עם פפאין או 0.05% פתרון טריפסין דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. צנטריפוגה ההשעיה התא שוב.ואז תן שימוש חוזר בתאים בחמישה מיליליטר של מדיום נוירוספרה ותנתק אותם על ידי צינורות לאט למעלה ולמטה 10 פעמים עם פיפטה פסטר. צלחת התאים במדיה נוירוספרית כמתואר בפרוטוקול הטקסט ולהעשיר אותם עם נוירוספרות משניות לאחר שבעה עד 10 ימים בתרבות כפי שתואר קודם לכן. לספור את התאים על המוציטמטר צלחת המספר האופטימלי של תאים על לוחות מצופים פולי D-ליסין לניסויים עתידיים.עמודה מטוהרת prominin-1 חיובי לאחר הלידה תאי גזע מוחיים יצרו נוירוספרות במדיום נוירוספרה עשיר גורם גדילה. נוירוספרות אלה היו חיוביות עבור prominin-1, הסמן שלהם המשמש לבידוד עבור סמני תאי גזע אחרים כגון nestin ו GFAP. תאים בזרימה מוכתמים שלילי עבור סמני תאי גזע prominin-1 ו nestin וחיובי עבור סמן עצבי בטא-III tubulin.עם נסיגת גורמי גדילה ובנוכחות גורם מעכב לוקמיה או PDGF-AA, הנוירוספרות החיוביות פרומינין-1 הבדילו לנוירונים, אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים. כאשר מנסים טכניקה זו, חשוב לוודא את הנוירוספרות נדחפים דרך נוגדן prominin-1 והם יכולים להיות מעבר כי תאים נורמליים גם נוטים ליצור גושים אשר עשוי להיראות כמו נוירוספרות. בשיטת בידוד זו, ניתן לאפיין את השושלת הנגזרת שלה כמו נוירונים וגליה במצב בריאותי ומחלות.שיטה זו היא בעלת ערך ומספקת תובנה חדשנית על תפקידם של תאי גזע מוחיים בהתפתחות מוחית ותנאי מחלה כמו ספינוקרבלאר אטקסיה וסרטן.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

בידוד של אוכלוסיות תאים שונות מהמוח הקטן פיתוח על ידי Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Purification of Mouse Brain Vessels

טיהור של כלי מוח עכבר

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

בידוד והתרבות של תאי גזע בוגרים עצביים מאזור העכבר Subcallosal

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

השתלת Homochronic של סימנים מקדימים Interneuron לתוך מוח העכבר כמחנכת מוקדם

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

השתלת כימוגנטית מהונדס בקליפת המוח ושלתי לתוך המוחות המוקדמים של העכבר לנטאל

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

התרבות הראשית של הנוירונים מבודדים מתוך עכבר ממוח עובריים

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1ÃƒÂ¢Ã‹â€ '3 Mouse Neurogenic Niches

בידוד והתרחבות של הנוירוספירות מפוסטנטאל (P1-3) העכבר גומחות נוירוגניים

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

התמיינות עצבית מתאי גזע עובריים של העכבר במבחנה

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...