Name: purification of prominin-1+ stem cells from postnatal mouse cerebellum
Uploaded: 2020-04-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum at JoVE.com

Ringraziamo i membri del laboratorio Opal per i loro suggerimenti. Questo lavoro è stato supportato da NIH sovvenzioni 1RO1 NS062051 e 1RO1NS08251 (Opal P)

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati in conformità con la NiH's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (2011) e sono stati approvati dalla Northwestern University IACUC (Protocollo IS00011368).
1. Preparazione delle soluzioni
<ol><li>Preparare la soluzione di dissociazione dei tessuti realizzata con fenolo sterile rosso di Dulbecco con la salina tamponata da fosfato (DPBS) con papaina (100 U/ml), cisteina (0,2 mg/ml) e DNase (250 U/ml).</li>
	<li>Per preparare...

<ol>
	<li>Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellum:+history.">Cerebellum: history.</a> Neuroscience. 162, 549-559 (2009).</li><li>Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+modulation+of+the+reward+circuitry+and+social+behavior.">Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior.</a> Science. 363, (2019).</li><li>Sathyanesan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+connections+between+cerebellar+development,+behaviour+and+complex+brain+disorders.">Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 20, 298-313 (2019).</li><li>Wagner, M. J., Kim, T. H., Savall, J., Schnitzer, M. J., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+granule+cells+encode+the+expectation+of+reward.">Cerebellar granule cells encode the expectation of reward.</a> Nature. 544, 96-100 (2017).</li><li>Araujo, A. P. B., Carpi-Santos, R., Gomes, F. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Astrocytes+in+the+Development+of+the+Cerebellum.">The Role of Astrocytes in the Development of the Cerebellum.</a> Cerebellum. , (2019).</li><li>Seto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+identity+transition+from+Purkinje+cell+progenitors+to+GABAergic+interneuron+progenitors+in+the+cerebellum.">Temporal identity transition from Purkinje cell progenitors to GABAergic interneuron progenitors in the cerebellum.</a> Nature Communication. 5, 3337 (2014).</li><li>Marzban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+commitment+in+the+developing+cerebellum.">Cellular commitment in the developing cerebellum.</a> Frontiers in Cell Neurosciences. 8, 450 (2014).</li><li>Koziol, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+paper:+the+cerebellum's+role+in+movement+and+cognition.">Consensus paper: the cerebellum's role in movement and cognition.</a> Cerebellum. 13, 151-177 (2014).</li><li>Ben-Arie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+essential+for+genesis+of+cerebellar+granule+neurons.">Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons.</a> Nature. 390, 169-172 (1997).</li><li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors.">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48, 17-24 (2005).</li><li>Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+expression+redefines+the+rhombic+lip+derivatives+and+reveals+novel+lineages+within+the+brainstem+and+cerebellum.">Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum.</a> Neuron. 48, 31-43 (2005).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+population+of+Nestin-expressing+progenitors+in+the+cerebellum+exhibits+increased+tumorigenicity.">A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity.</a> Nature Neurosciences. 16, 1737-1744 (2013).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum.">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nature Neurosciences. 8, 723-729 (2005).</li><li>Toren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133-positive+hematopoietic+stem+cell+"stemness"+genes+contain+many+genes+mutated+or+abnormally+expressed+in+leukemia.">CD133-positive hematopoietic stem cell "stemness" genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia.</a> Stem Cells. 23, 1142-1153 (2005).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prominin+1+marks+intestinal+stem+cells+that+are+susceptible+to+neoplastic+transformation.">Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation.</a> Nature. 457, 603-607 (2009).</li><li>Man, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Role+for+the+DNA+Sensor+AIM2+in+Stem+Cell+Proliferation+and+Cancer.">Critical Role for the DNA Sensor AIM2 in Stem Cell Proliferation and Cancer.</a> Cell. 162, 45-58 (2015).</li><li>Fleming, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Purkinje+neuron+acts+as+a+central+regulator+of+spatially+and+functionally+distinct+cerebellar+precursors.">The Purkinje neuron acts as a central regulator of spatially and functionally distinct cerebellar precursors.</a> Developmental Cell. 27, 278-292 (2013).</li><li>Panchision, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+flow+cytometric+analysis+of+central+nervous+system+tissue+reveals+novel+functional+relationships+among+cells+expressing+CD133,+CD15,+and+CD24.">Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24.</a> Stem Cells. 25, 1560-1570 (2007).</li><li>Beaudoin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+pyramidal+neurons+from+the+early+postnatal+mouse+hippocampus+and+cortex.">Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex.</a> Nature Protocols. 7, 1741-1754 (2012).</li><li>Edamakanti, C. R., Do, J., Didonna, A., Martina, M., Opal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+ataxin1+disrupts+cerebellar+development+in+spinocerebellar+ataxia+type+1.">Mutant ataxin1 disrupts cerebellar development in spinocerebellar ataxia type 1.</a> Journal of Clinical Investigation. 128, 2252-2265 (2018).</li><li>Erlandsson, A., Enarsson, M., Forsberg-Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immature+neurons+from+CNS+stem+cells+proliferate+in+response+to+platelet-derived+growth+factor.">Immature neurons from CNS stem cells proliferate in response to platelet-derived growth factor.</a> Journal of Neurosciences. 21, 3483-3491 (2001).</li><li>Galli, R., Pagano, S. F., Gritti, A., Vescovi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuronal+differentiation+in+human+CNS+stem+cell+progeny+by+leukemia+inhibitory+factor.">Regulation of neuronal differentiation in human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor.</a> Developmental Neurosciences. 22, 86-95 (2000).</li><li>Silbereis, J., Cheng, E., Ganat, Y. M., Ment, L. R., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursors+with+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+Promoter+Activity+Transiently+Generate+GABA+Interneurons+in+the+Postnatal+Cerebellum.">Precursors with Glial Fibrillary Acidic Protein Promoter Activity Transiently Generate GABA Interneurons in the Postnatal Cerebellum.</a> Stem Cells. 27, 1152-1163 (2009).</li><li>Parmigiani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+Bipotency+of+Astroglial-Like+Cerebellar+Progenitors+along+the+Interneuron+and+Glial+Lineages.">Heterogeneity and Bipotency of Astroglial-Like Cerebellar Progenitors along the Interneuron and Glial Lineages.</a> Journal of Neurosciences. 35, 7388-7402 (2015).</li><li>Wojcinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+granule+cell+replenishment+postinjury+by+adaptive+reprogramming+of+Nestin(+)+progenitors.">Cerebellar granule cell replenishment postinjury by adaptive reprogramming of Nestin(+) progenitors.</a> Nature Neurosciences. 20, 1361-1370 (2017).</li><li>Yang, Z., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP1+is+involved+in+replenishment+of+granule+cell+precursors+following+injury+to+the+neonatal+cerebellum.">YAP1 is involved in replenishment of granule cell precursors following injury to the neonatal cerebellum.</a> Developmental Biology. 1606 (19), 30207 (2019).</li><li>Wang, S. S., Kloth, A. D., Badura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebellum,+sensitive+periods,+and+autism.">The cerebellum, sensitive periods, and autism.</a> Neuron. 83, 518-532 (2014).</li><li>Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+down+and+one+to+go:+modeling+medulloblastoma+subgroups.">Three down and one to go: modeling medulloblastoma subgroups.</a> Cancer Cell. 21, 137-138 (2012).</li><li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+is+a+positive+marker+for+a+distinct+class+of+primitive+human+cord+blood-derived+CD34-negative+hematopoietic+stem+cells.">CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells.</a> Leukemia. 28, 1308-1315 (2014).</li></ol>

Le cellule staminali cerebellari che esprimono promininina-1 risiedono nella futura materia bianca durante le prime 3 settimane di vita postnatale. La loro proliferazione è strettamente controllata dalla via del riccio sonico supportata dalle cellule Purkinje17. Queste cellule staminali/progenitori contribuiscono agli interneuroni GABAergici nati più tardi chiamati cellule del pancia e delle cellule stellate. Questi interneuroni risiedono nello strato molecolare, dove si sinsisizzano sulle cellu...

Il cervelletto è stato a lungo riconosciuto come un importante circuito neuronale che coordina il movimento volontario1. Riceve input dalle ampie fasce della neurosaxis, che include informazioni propriocettive dalla periferia, in modo da ottimizzare l'uscita del motore e coordinare il movimento. Più recentemente, è stato anche implicato nella regolazione della cognizione e delle emozioni utilizzando potenzialmente simili reti di elaborazione delle informazioni2,3,4.
Il cervelletto adulto è composto da una corteccia cerebellare esterna e materia bianca interna. Intralciati all'interno di queste strutture sono nuclei intraceri profondi. Simile al resto del sistema nervoso, lo sviluppo del cervelletto è guidato dalla proliferazione di cellule progenitrici multipotenti (cellule staminali) che migrano e si differenziano per produrre questa struttura ben organizzata. Nel primo sviluppo (E10.5–E13.5), una nicchia di stelo ventricolare intorno al quarto ventricolo in via di sviluppo genera neuroni GABAergic (cioè, cellule Purkinje, cellule Lugaro, cellule di Golgi) insieme a Bergmann glia5,6,77,8.
Più avanti nello sviluppo (settimana postnatale uno), una seconda nicchia di cellule staminali nel labbro rombico genera progenitori che esprimono MATH1 e Nestin che esprimono che danno origine a neuroni eccunetadi eccunitari9,10,11,12. Recentemente una terza nicchia di cellule staminali è statadescritta 13. Queste cellule esprimono promininin-1 (noto anche come CD133), una glicoproteina che definisce un sottoinsieme di cellule staminali nei sistemi intestinali ed ematopoietici14,15,16. La mappatura del destino in vivo mostra che queste cellule staminali generano interneuroni chiave dello strato molecolare (cioè le cellule del cesto e le cellule stellate), insieme agli astrociti, durante le prime tre settimane postnatali. In passato, è stato difficile studiare queste cellule in vitro perché i metodi precedenti hanno richiesto tecniche costose e dispendiose in termini di tempo (ad esempio, lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza [FACS]) che dipendono dalla colorazione prominin-112,13,17. Questo protocollo descrive un metodo immunomagnetico per l'isolamento di queste cellule staminali che possono quindi essere facilmente coltivate e differenziate.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05%Trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td>0.05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% B27</td>
			<td>Gibco; Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mM EDTA solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- Prominin-1 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biote</td>
			<td>130-092-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>culture plates ultra - low attachment</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4513-1VL</td>
			<td>250 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution-HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G507A</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G502A</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>l-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy</td>
			<td>Lieca TCS SP5 confocal microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Prominin-1</td>
			<td>Affymetrix eBioscience</td>
			<td>14-1331</td>
			<td>1 in 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab27952</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4</td>
			<td>Millopore</td>
			<td>MAB345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>(100 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet- Derived Growth Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8291</td>
			<td>10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-tubulin, b-III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2200</td>
			<td>1 in 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabit anti-GFAP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>1 in 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation columns-MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>40um</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of prominin-1+ stem cells from postnatal mouse cerebellum

La maggior parte dei neuroni cerebellari derivano da due nicchie di sfiato embrionale: una nicchia di labbra trombica, che genera tutti i neuroni glutamateri eccunitori cerebellari, e una nicchia di zona ventricolare, che genera le cellule inibitorie GABAergic Purkinje, che sono neuroni che costituiscono i nuclei goneturari profondi e Bergman glia. Recentemente, è stata descritta una terza nicchia di cellule staminali che si presenta come una zona germinale secondaria dalla nicchia della zona ventricolare. Le cellule di questa nicchia sono definite dal marcatore di superficie cellulare promininin-1 e sono localizzate per lo sviluppo della materia bianca in via di sviluppo del cervelletto postnatale. Questa nicchia rappresenta lo strato molecolare nato tardivo gabAergic interneurons insieme agli astrociti cerebellari generati postinnatally. Oltre al loro ruolo di sviluppo, questa nicchia sta guadagnando importanza traslazionale per quanto riguarda il suo coinvolgimento nella neurodegenerazione e nella tumorigenesi. La biologia di queste cellule è stata difficile da decifrare a causa della mancanza di tecniche efficienti per la loro purificazione. Didimostrato qui sono metodi efficienti per purificare, coltura, e differenziare queste cellule staminali cerebellari postnatali.

Le cellule staminali del cerebellare postnatale promininininale-1 formato hanno formato neurosfere in neurosfera media ricca di fattori di crescita (EGF e bFGF). Queste neurosfere erano positive per la colorazione promininin-1, il marcatore utilizzato per l'isolamento, e anche come macchia per altri marcatori di cellule staminali come Nestin e GFAP13 (Figura 1). L'espressione del marcatore della cellula staminale è stata mantenuta per tutta la coltura e per almeno ot...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum at JoVE.com

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Dimostrata qui è un metodo efficiente ed economico per purificare, coltura e differenziare le cellule staminali della materia bianca dal cervelletto mureno postnatale.

Purificazione della Prominin-1- Cellule staminali dal cervelletto del topo postnatale

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

Questo protocollo descrive un metodo facile ed economico per purificare le cellule staminali dal cervelletto postnatale. Queste cellule staminali rappresentano gli internauri a grana molecolare recentemente nati, ma rappresentano anche astrociti cerebellari di derivazione postnatal. Pertanto, lo studio di queste cellule è chiaramente importante per comprendere lo sviluppo del cervelletto.Utilizzando questo protocollo, la resa delle cellule staminali è paragonabile a quella della strategia basata su FACS, che in genere è 10 volte più costosa. Questo protocollo può essere generalizzato per estrarre prominina-1 esprimendo cellule staminali da altri tessuti come intestino e midollo osseo. Inizia posizionando il piatto con il cervello al microscopio a dissezione.Utilizzare le forcep bel numero cinque per rimuovere le meningi e i grandi vasi sanguigni dal cervelletto, quindi separare il cervelletto dal tronco encefalico usando la spatola. Trasferire il cervelletto in un tubo di centrifuga da 15 millilitri contenente cinque millilitri di soluzione HBSS ghiacciata. Risciacquare quindi decantare l'HBSS.Ripetere il lavaggio altre due volte. Dopo l'ultimo risciacquo, aggiungere cinque millilitri di soluzione di dissociazione tissutale a base di papaina che è stata pre-riscaldata a 37 gradi Celsius. Incubare il tessuto per 15 minuti in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius e mescolare lentamente il contenuto del tubo inverterlo da tre a cinque volte ogni tre minuti.Preparare una pipetta Pasteur in vetro di grande diametro e di diametro stretto lucidando il fuoco su un bruciatore Bunsen. Dopo l'incubazione, lavare il tessuto tre volte con cinque millilitri di soluzione HBSS assicurandosi di evitare di perdere tessuto durante la decantazione. Dopo l'ultimo lavaggio HBSS, aggiungere cinque millilitri di DPBS con 250 microlitri di DNAsi al tessuto e dissociarlo triturando delicatamente da 10 a 15 volte con la pipetta Pasteur di grande diametro.Quindi utilizzare la stretta pipetta Pasteur per triturare ulteriormente il liquame tissutale 10 volte. Se rimangono pezzi di tessuto più grandi, premerli contro il fondo del tubo con la punta della pipetta e continuare a pipettare fino a ottenere una sospensione fine. Posizionare i tubi della centrifuga sul ghiaccio.Quindi sforzare le cellule dissociate attraverso un colino cellulare di 40 micrometri in un tubo da 50 millilitri. In cima al filtro con 10 millilitri di soluzione HBSS ghiacciata per garantire che le cellule passino attraverso la rete. Trasferire le celle filtrate in un tubo di centrifuga fresco da 15 millilitri e centrifugare la sospensione a 300 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Quindi utilizzare un aspiratore di vuoto per rimuovere completamente il supernatante. Resuspend il pellet cellulare in 160 microlitri di tampone di colonna magnetica ghiacciata. Aggiungere 40 microlitri di microperline anti-prominin-1 alla sospensione cellulare.Quindi incubare i tubi in frigorifero per 15 minuti per consentire all'anticorpo di legarsi alle cellule esprimenti prominin-1. Lavare le cellule con uno o due millilitri di tampone di colonna X e centrifugarle a 300 volte g per 10 minuti. Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet in un millilitro di buffer di colonna X.Posizionare le colonne magnetiche sul supporto magnetico e sciacquarle una volta con 500 microlitri di tampone X.Applicare la sospensione cellulare etichettata sulla colonna e raccogliere il flusso in tubi freschi da 15 millilitri.Lavare la colonna tre volte con 500 microlitri di tampone X.Quindi rimuovere le colonne dal campo magnetico e posizionarle in tubi da 1,5 millilitri. Aggiungere un millilitro di mezzo di coltura e spingere lo stantuffo nella colonna per stanare le cellule taggate con perline prominin-1. Per passare le neurosfere, trasferirle insieme al mezzo di coltura in un tubo di centrifuga sterile da 15 millilitri.Pellettare le neurosfere per centrifugazione a 300 volte g per cinque minuti e scartare il supernatante. Resuspend il pellet in cinque millilitri di mezzi di dissociazione con papaina o soluzione di tripside allo 0,05% e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Centrifugare di nuovo la sospensione cellulare.Quindi rimescolare le cellule in cinque millilitri di mezzo della neurosfera e dissociarle lentamente in pipettandole su e giù 10 volte con una pipetta Pasteur. Placcare le cellule nei mezzi della neurosfera come descritto nel protocollo di testo e arricchirle con neurosfere secondarie dopo sette o 10 giorni di coltura come descritto in precedenza. Contare le cellule su un emocitometro e placcare il numero ottimale di cellule su piastre rivestite in poli-D-lisina per esperimenti futuri.Le cellule staminali cerebellari postnatali positive prominina-1 purificate dalla colonna formavano neurosfere nel mezzo della neurosfera ricco di fattore di crescita. Queste neurosfere erano positive per la prominina-1, il loro marcatore usato per l'isolamento e per altri marcatori di cellule staminali come la nednina e la GFAP. Cellule nel flusso attraverso il negativo macchiato per marcatori di cellule staminali prominina-1 e annidcina e positivo per marcatore neuronale beta-III tubulina.Al ritiro dei fattori di crescita e in presenza di fattore inibitorio della leucemia o PDGF-AA, le neurosfere positive prominina-1 si differenziano in neuroni, astrociti e oligodendrociti. Quando si tenta questa tecnica, è importante assicurarsi che le neurosfere siano spinte attraverso per gli anticorpi prominin-1 e possano essere attraversate perché le cellule normali tendono anche a formare grumi che possono sembrare neurosfere. Usando questo metodo di isolamento, si possono caratterizzare i suoi lignaggi derivati come neuroni e glia in condizioni di salute e malattia.Questo metodo è prezioso e fornisce una nuova visione del ruolo delle cellule staminali cerebellari nello sviluppo cerebellare e in condizioni di malattia come l'atassia spinocerebellare e il cancro.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolamento e la coltura delle cellule della cresta neurale da Embryonic Murine tubo neurale

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Ricerca

Neuroscienze

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Isolamento di distinte popolazioni cellulari dal cervelletto in via di sviluppo da Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Purificazione delle navi cervello di topo

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolamento e la coltura di adulti neurali cellule staminali dal Subcallosal Zona mouse

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Homochronic trapianto di precursori Interneurone in cervelli di topo postnatale precoce

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Isolamento e coltura di cellule staminali neurali embrionali del Mouse

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Trapianto di progenitori interneuroni corticali chemiogeneticamente ingegnerizzati nei primi cervelli dei topi postnatali

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Cultura primaria dei neuroni isolata dal cerbellello del topo embrionale

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1ÃƒÂ¢Ã‹â€ '3 Mouse Neurogenic Niches

Isolamento ed espansione delle neurosfere dalle nicchie neurogeniche del topo postnatali (P1-3)

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Differenziazione neuronale dalle cellule staminali embrionali del topo in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...