Name: purification of prominin-1+ stem cells from postnatal mouse cerebellum
Uploaded: 2020-04-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum at JoVE.com

우리는 그들의 제안에 대한 오팔 실험실 회원에게 감사드립니다. 이 작품은 NIH 교부금 1RO1 NS062051 및 1RO1NS08251 (오팔 P)에 의해 지원되었다

모든 동물 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH의 가이드 (2011)에 따라 수행되었으며 노스 웨스턴 대학 IACUC (프로토콜 IS00011368)에 의해 승인되었습니다.
1. 솔루션 준비
<ol><li>파파인 (100 U / ml), 시스테인 (0.2 mg / ml) 및 DNase (250 U / ml)와 멸균 페놀 레드 함유 덜베코의 인산 완충 식염수 (DPBS)로 만든 조직 해리 솔루션을 준비하십시오.</li>
	<li>DNase 용액을 희석시키기 위해...

<ol>
	<li>Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellum:+history.">Cerebellum: history.</a> Neuroscience. 162, 549-559 (2009).</li><li>Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+modulation+of+the+reward+circuitry+and+social+behavior.">Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior.</a> Science. 363, (2019).</li><li>Sathyanesan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+connections+between+cerebellar+development,+behaviour+and+complex+brain+disorders.">Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 20, 298-313 (2019).</li><li>Wagner, M. J., Kim, T. H., Savall, J., Schnitzer, M. J., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+granule+cells+encode+the+expectation+of+reward.">Cerebellar granule cells encode the expectation of reward.</a> Nature. 544, 96-100 (2017).</li><li>Araujo, A. P. B., Carpi-Santos, R., Gomes, F. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Astrocytes+in+the+Development+of+the+Cerebellum.">The Role of Astrocytes in the Development of the Cerebellum.</a> Cerebellum. , (2019).</li><li>Seto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+identity+transition+from+Purkinje+cell+progenitors+to+GABAergic+interneuron+progenitors+in+the+cerebellum.">Temporal identity transition from Purkinje cell progenitors to GABAergic interneuron progenitors in the cerebellum.</a> Nature Communication. 5, 3337 (2014).</li><li>Marzban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+commitment+in+the+developing+cerebellum.">Cellular commitment in the developing cerebellum.</a> Frontiers in Cell Neurosciences. 8, 450 (2014).</li><li>Koziol, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+paper:+the+cerebellum's+role+in+movement+and+cognition.">Consensus paper: the cerebellum's role in movement and cognition.</a> Cerebellum. 13, 151-177 (2014).</li><li>Ben-Arie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+essential+for+genesis+of+cerebellar+granule+neurons.">Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons.</a> Nature. 390, 169-172 (1997).</li><li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors.">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48, 17-24 (2005).</li><li>Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+expression+redefines+the+rhombic+lip+derivatives+and+reveals+novel+lineages+within+the+brainstem+and+cerebellum.">Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum.</a> Neuron. 48, 31-43 (2005).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+population+of+Nestin-expressing+progenitors+in+the+cerebellum+exhibits+increased+tumorigenicity.">A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity.</a> Nature Neurosciences. 16, 1737-1744 (2013).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum.">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nature Neurosciences. 8, 723-729 (2005).</li><li>Toren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133-positive+hematopoietic+stem+cell+"stemness"+genes+contain+many+genes+mutated+or+abnormally+expressed+in+leukemia.">CD133-positive hematopoietic stem cell "stemness" genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia.</a> Stem Cells. 23, 1142-1153 (2005).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prominin+1+marks+intestinal+stem+cells+that+are+susceptible+to+neoplastic+transformation.">Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation.</a> Nature. 457, 603-607 (2009).</li><li>Man, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Role+for+the+DNA+Sensor+AIM2+in+Stem+Cell+Proliferation+and+Cancer.">Critical Role for the DNA Sensor AIM2 in Stem Cell Proliferation and Cancer.</a> Cell. 162, 45-58 (2015).</li><li>Fleming, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Purkinje+neuron+acts+as+a+central+regulator+of+spatially+and+functionally+distinct+cerebellar+precursors.">The Purkinje neuron acts as a central regulator of spatially and functionally distinct cerebellar precursors.</a> Developmental Cell. 27, 278-292 (2013).</li><li>Panchision, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+flow+cytometric+analysis+of+central+nervous+system+tissue+reveals+novel+functional+relationships+among+cells+expressing+CD133,+CD15,+and+CD24.">Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24.</a> Stem Cells. 25, 1560-1570 (2007).</li><li>Beaudoin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+pyramidal+neurons+from+the+early+postnatal+mouse+hippocampus+and+cortex.">Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex.</a> Nature Protocols. 7, 1741-1754 (2012).</li><li>Edamakanti, C. R., Do, J., Didonna, A., Martina, M., Opal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+ataxin1+disrupts+cerebellar+development+in+spinocerebellar+ataxia+type+1.">Mutant ataxin1 disrupts cerebellar development in spinocerebellar ataxia type 1.</a> Journal of Clinical Investigation. 128, 2252-2265 (2018).</li><li>Erlandsson, A., Enarsson, M., Forsberg-Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immature+neurons+from+CNS+stem+cells+proliferate+in+response+to+platelet-derived+growth+factor.">Immature neurons from CNS stem cells proliferate in response to platelet-derived growth factor.</a> Journal of Neurosciences. 21, 3483-3491 (2001).</li><li>Galli, R., Pagano, S. F., Gritti, A., Vescovi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuronal+differentiation+in+human+CNS+stem+cell+progeny+by+leukemia+inhibitory+factor.">Regulation of neuronal differentiation in human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor.</a> Developmental Neurosciences. 22, 86-95 (2000).</li><li>Silbereis, J., Cheng, E., Ganat, Y. M., Ment, L. R., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursors+with+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+Promoter+Activity+Transiently+Generate+GABA+Interneurons+in+the+Postnatal+Cerebellum.">Precursors with Glial Fibrillary Acidic Protein Promoter Activity Transiently Generate GABA Interneurons in the Postnatal Cerebellum.</a> Stem Cells. 27, 1152-1163 (2009).</li><li>Parmigiani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+Bipotency+of+Astroglial-Like+Cerebellar+Progenitors+along+the+Interneuron+and+Glial+Lineages.">Heterogeneity and Bipotency of Astroglial-Like Cerebellar Progenitors along the Interneuron and Glial Lineages.</a> Journal of Neurosciences. 35, 7388-7402 (2015).</li><li>Wojcinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+granule+cell+replenishment+postinjury+by+adaptive+reprogramming+of+Nestin(+)+progenitors.">Cerebellar granule cell replenishment postinjury by adaptive reprogramming of Nestin(+) progenitors.</a> Nature Neurosciences. 20, 1361-1370 (2017).</li><li>Yang, Z., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP1+is+involved+in+replenishment+of+granule+cell+precursors+following+injury+to+the+neonatal+cerebellum.">YAP1 is involved in replenishment of granule cell precursors following injury to the neonatal cerebellum.</a> Developmental Biology. 1606 (19), 30207 (2019).</li><li>Wang, S. S., Kloth, A. D., Badura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebellum,+sensitive+periods,+and+autism.">The cerebellum, sensitive periods, and autism.</a> Neuron. 83, 518-532 (2014).</li><li>Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+down+and+one+to+go:+modeling+medulloblastoma+subgroups.">Three down and one to go: modeling medulloblastoma subgroups.</a> Cancer Cell. 21, 137-138 (2012).</li><li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+is+a+positive+marker+for+a+distinct+class+of+primitive+human+cord+blood-derived+CD34-negative+hematopoietic+stem+cells.">CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells.</a> Leukemia. 28, 1308-1315 (2014).</li></ol>

Prominin-1 발현 소뇌 줄기 세포는 출생 후 생활의 첫번째 3 주 도중 장래 백색 물질에서 상주합니다. 이들의 증식은 Purkinje세포(17)에의해 지지되는 소닉 고슴도치 통로에 의해 엄격하게 조절된다. 이 줄기 세포/선조는 바구니 세포및 stellate 세포에게 불린 나중에 태어난 GABAergic interneurons에 기여합니다. 이러한 인터뉴런은 분자층에 상주하며, 여기서 그들은 Purkinje 세포에 시냅스를 ?...

소뇌는 오랫동안 자발적 운동1을조정하는 주요 뉴런 회로로 인식되어 왔다. 모터 출력을 미세 조정하고 움직임을 조정하기 위해 주변의 프로피오셉트 정보를 포함하는 신경 축의 넓은 swathes에서 입력을 받습니다. 최근에는 유사 정보 처리 네트워크2,,3,,4를이용하여 인지와 감정을 조절하는 데도 연루되어 있다.
성인 소뇌는 외부 소뇌 피질과 내부 백색 물질로 구성됩니다. 이 구조물 내의 산재는 깊은 intracerebellar 핵입니다. 신경계의 나머지와 마찬가지로, 소뇌의 발달은 이 잘 조직된 구조물을 산출하기 위하여 이동하고 분화하는 다능한 전구 세포 (줄기 세포)의 증식에 의해 구동됩니다. 초기 개발 (E10.5-E13.5), 개발 제 4 심실 주위 심실 줄기 틈새 는 버그만 glia와 함께 GABAergic 뉴런을 생성 (즉, Purkinje 세포, 루가로 세포, 골지 세포) Bergmann glia5,,6,,7,,8.
이후 개발(postnatal week 1)에서, 마름모꼴 입술에서 두 번째 줄기 세포 틈새는 MATH1-및 네스테틴 발현 전구체를 생성하여 흥분성 과립 뉴런9,,10,,11,,12를발생시다. 최근 제3 줄기세포 틈새시장이13에기재되어 있다. 이들 세포는 프로미닌-1(CD133이라고도 함)을 발현하며, 장 및 조혈계에서 줄기 세포의 서브세트를 정의하는 막 스패닝 당단백질14,,15,,16을발현한다. 생체 내 운명 매핑은 이러한 줄기 세포가 처음 3주 동안 성상세포와 함께 주요 분자층 인터뉴런(즉, 바구니 세포 및 성결세포)을 생성한다는 것을 보여줍니다. 과거에는, 사전 방법은 프로민-1 염색12,,13,,17에의존하는 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리는 기술(즉, 형광 활성화 세포 분류[FACS]])을 요구했기 때문에 시험관 내에서 이들 세포를 연구하기가 어려웠다. 이 프로토콜은 이러한 줄기 세포의 분리를 위한 면역자기 기반 방법을 설명하며, 그 후 쉽게 배양되고 분화될 수 있다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05%Trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td>0.05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% B27</td>
			<td>Gibco; Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mM EDTA solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- Prominin-1 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biote</td>
			<td>130-092-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>culture plates ultra - low attachment</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4513-1VL</td>
			<td>250 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution-HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G507A</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G502A</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>l-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy</td>
			<td>Lieca TCS SP5 confocal microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Prominin-1</td>
			<td>Affymetrix eBioscience</td>
			<td>14-1331</td>
			<td>1 in 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab27952</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4</td>
			<td>Millopore</td>
			<td>MAB345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>(100 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet- Derived Growth Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8291</td>
			<td>10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-tubulin, b-III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2200</td>
			<td>1 in 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabit anti-GFAP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>1 in 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation columns-MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>40um</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of prominin-1+ stem cells from postnatal mouse cerebellum

대부분의 소뇌 뉴런은 두 개의 배아 줄기 틈새에서 발생: 마름모꼴 입술 틈새, 모든 소뇌 흥분 성 글루타마테르뉴런을 생성, 및 심실 영역 틈새, 이는 억제 GABAergic Purkinje 세포를 생성하는, 이는 깊은 소뇌를 구성하는 뉴런입니다. 최근, 제3 줄기세포 틈새시장은 심실 영역 틈새에서 이차 발아 영역으로 발생한다는 설명이 있다. 이 틈새의 세포는 세포 표면 마커 prominin-1에 의해 정의되고 출생 후 소뇌의 발전 백색 물질에 국한됩니다. 이 틈새 는 산후 생성 된 소뇌 성상 세포와 함께 늦게 태어난 분자 층 GABAergic interneurons에 대한 계정. 그들의 발달 역할 이외에, 이 틈새 는 신경 변성 및 종양 발생에 그것의 관여에 관하여 번역중요성을 얻고 있습니다. 이 세포의 생물학은 그들의 정화를 위한 능률적인 기술의 부족 때문에 해독하기 어려웠습니다. 여기에서 입증된 것은 이러한 산후 소뇌 줄기 세포를 정화, 배양 및 분화하는 효율적인 방법입니다.

프로민-1-양성 산후 소뇌 줄기 세포는 성장 인자(EGF 및 bFGF)가 풍부한 신경구 배지에서 신경구를 형성하였다. 이들 신경구는 프로미닌-1-염색, 격리에 사용되는 마커, 또한 네스테틴 및 GFAP13과 같은 다른 줄기 세포 마커에 대한 얼룩으로서 양성이었다(도1). 줄기세포 마커 발현은 배양 전반에 걸쳐 적어도 8개의대구(20)에대해 유지되었다. 성?...

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Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

여기에서 입증된 것은 산후 마우스 소뇌로부터 백물 줄기 세포를 정화, 배양 및 분화하는 효율적이고 비용 효율적인 방법입니다.

출생 후 마우스 소뇌에서 프로미닌-1+ 줄기 세포의 정화

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

이 프로토콜은 산후 소뇌에서 줄기 세포를 정화하는 쉽고 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 이 줄기 세포는 늦게 태어난 분자 왜곡 된 인터뉴런을 차지하지만, 그들은 또한 산후 유래 소뇌 성 상살 세포를 차지합니다. 따라서, 이 세포를 공부하는 것은 소뇌의 발달을 이해하는 것을 명확하게 중요합니다.이 프로토콜을 사용하여 줄기 세포의 수율은 일반적으로 10 배 더 비싼 FACS 기반 전략의 수율과 유사합니다. 이 프로토콜은 장 및 골수와 같은 다른 조직에서 줄기 세포를 발현하는 프로민-1을 추출하기 위해 일반화될 수 있다. 먼저 해부 현미경 아래에 뇌와 함께 접시를 배치합니다.미세 한 숫자 다섯 집게를 사용 하 여 소뇌에서 수막과 큰 혈관을 제거 하 고 주걱을 사용 하 여 뇌간에서 소뇌를 분리. 소뇌를 얼음 차가운 HBSS 용액 5밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 이송합니다. 헹도 다음 HBSS를 데산합니다.세탁을 두 번 더 반복합니다. 마지막 헹구기 후에, 섭씨 37도로 미리 온온된 파팡 계 조직 해리 용액의 5밀리리터를 추가하십시오. 37도 수조에서 15분 동안 조직을 배양하고 3분마다 3~5회 반역하여 튜브의 내용물을 천천히 섞어 냅니다.분젠 버너 위로 불을 닦아 직경이 넓고 좁은 직경의 유리 파스퇴르 파이펫을 준비합니다. 인큐베이션 후, HBSS 용액의 5 밀리리터로 조직을 세 번 세척하여 탈수하면서 조직을 잃지 않도록 하십시오. 마지막 HBSS 세척 후, 조직에 DNAse의 250 마이크로 리터와 DPBS의 5 밀리리터를 추가하고 부드럽게 넓은 직경 파스퇴르 파이펫으로 10 ~ 15 시간을 세화하여 해리.그런 다음 좁은 파스퇴르 파이펫을 사용하여 조직 슬러리를 10번 더 세화시합니다. 조직의 큰 조각이 남아있는 경우, 파이펫 팁튜브의 바닥에 그들을 누르고 미세 현탁액이 달성 될 때까지 파이펫을 계속. 원심분리관을 얼음 위에 놓습니다.그런 다음 40 마이크로미터 세포 여과기를 통해 해리된 세포를 50 밀리리터 튜브로 변형시합니다. 10 밀리리터의 얼음 차가운 HBSS 용액으로 필터를 위로 하여 세포가 메시를 통과하도록 합니다. 여과 된 세포를 신선한 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 10 분 동안 300 배 g에서 서스펜션을 원심분리합니다.그런 다음 진공 흡인기를 사용하여 상복부을 완전히 제거합니다. 얼음 차가운 자기 컬럼 버퍼의 160 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 세포 현탁액에 프로미닌-1 마이크로비드 40마이크로리터를 추가합니다.그런 다음 항체가 프로민-1 발현 세포에 결합할 수 있도록 15분 동안 냉장고에 튜브를 배양한다. 컬럼 버퍼 X의 1~2밀리리터로 세포를 씻고 원심분리기는 10분 동안 300배 g로 세척합니다. 상류체를 흡인하고 열 버퍼 X.의 1 밀리리터에 펠릿을 재보행하여 마그네틱 컬럼을 자기 스탠드에 놓고 500 마이크로리터의 완충X.기둥에 라벨이 붙은 셀 서스펜션을 적용하고 신선한 15 밀리리터 튜브로 흐름을 수집합니다.버퍼 X의 500 마이크로 리터로 컬럼을 세 번 씻은 다음 자기장에서 컬럼을 제거하고 1.5 밀리리터 튜브에 넣습니다. 배양 배지의 밀리리터 1밀리리터를 추가하고 플런저를 컬럼에 밀어 프로미닌-1 구슬로 태그된 세포를 플러시합니다. 신경구를 통과하려면 배양 배지와 함께 멸균 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기십시오.신경구는 5분 동안 300배 g에서 원심분리로 신경구를 배출하고 상체를 폐기합니다. papain 또는 0.05%의 트립신 용액으로 해리 질의 5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 10 분 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양하십시오. 세포 현탁액을 다시 원심 분리합니다.그런 다음 신경권 배지의 5 밀리리터에서 세포를 다시 중단하고 파스퇴르 파이펫으로 10번 천천히 피펫을 피펫으로 분리합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 신경권 배지에서 세포를 플레이트하고 이전에 설명한 바와 같이 문화에서 7~10일 후에 이차 신경구로 세포를 풍부하게 한다. 혈전계에 세포를 계산하고 향후 실험을 위해 폴리 D-lysine 코팅 플레이트에 최적의 세포 수를 플레이트.컬럼 정제 프로민-1 양성 산후 소뇌 줄기 세포는 성장 인자가 풍부한 신경권 배지에서 신경구를 형성하였다. 이러한 신경구는 프로민-1에 대 한 긍정적인, 격리에 대 한 사용 하는 그들의 마커 및 nestin와 GFAP 같은 다른 줄기 세포 마커에 대 한. 줄기 세포 마커 프로민-1 및 네신 및 뉴런 마커 베타-III 튜룰린에 대한 양성에 대한 유량에 있는 세포.성장 인자의 철수시 백혈병 억제 인자 또는 PDGF-AA의 존재, 프로민-1 양성 신경 구신경 뉴런으로 분화, 성상 세포와 oligodendrocytes. 이 기술을 시도할 때, 신경구가 prominin-1 항체를 통해 밀려나고 일반적인 세포가 또한 신경구 같이 보일 지도 모르다 덩어리를 형성하는 경향이 있기 때문에 통과될 수 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 격리 방법을 사용하여, 하나는 건강과 질병 조건에서 뉴런과 신경교와 같은 유도 혈통을 특성화 할 수 있습니다.이 방법은 귀중하며 소뇌 발달및 척추 학력 실조 및 암과 같은 질병 조건에서 소뇌 줄기 세포의 역할에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

배아 Murine 신경 튜브에서 신경 크레스트 세포의 분리 및 문화

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

연구

신경과학

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

이외에 Microdissection에 의해 개발 소뇌 차별화 된 세포 집단의 분리

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Purification of Mouse Brain Vessels

마우스 뇌 혈관의 정화

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

마우스 뇌량 밑 영역에서의 분리 및 성인 신경 줄기 세포의 문화

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

이른 출생 후 마우스 두뇌로 Interneuron 선구자의 Homochronic 이식

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

절연 및 마우스 배아 신경 줄기 세포의 문화

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

화학유전학적으로 조작된 피질 인터뉴런 선조를 출생 후 마우스 뇌로 이식

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1ÃƒÂ¢Ã‹â€ '3 Mouse Neurogenic Niches

산후 (P1−3) 마우스 신경성 틈새에서 신경구의 격리 그리고 확장

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

시험관 내 마우스 배아 줄기 세포로부터의 신경 분화

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...