Name: purification of prominin-1+ stem cells from postnatal mouse cerebellum
Uploaded: 2020-04-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum at JoVE.com

Vi takker Opal-laboratoriemedlemmene for deres forslag. Dette arbeidet ble støttet av NIH-tilskudd 1RO1 NS062051 og 1RO1NS08251 (Opal P)

Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med NIHs veiledning for pleie og bruk av laboratoriedyr (2011) og ble godkjent av Northwestern University IACUC (protokoll IS00011368).
1. Utarbeidelse av løsninger
<ol><li>Forbered vevdissosiasjonsoppløsning laget av steril fenol rødholdig Dulbeccos fosfatbufret saltvann (DPBS) med papain (100 E/ml), cystein (0,2 mg/ml) og DNase (250 E/ml).</li>
	<li>For å forberede DNase-oppløsningen fortynnes 100 mg av det lyofiliserte pulveret til DNase I (en f...

<ol>
	<li>Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellum:+history.">Cerebellum: history.</a> Neuroscience. 162, 549-559 (2009).</li><li>Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+modulation+of+the+reward+circuitry+and+social+behavior.">Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior.</a> Science. 363, (2019).</li><li>Sathyanesan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+connections+between+cerebellar+development,+behaviour+and+complex+brain+disorders.">Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 20, 298-313 (2019).</li><li>Wagner, M. J., Kim, T. H., Savall, J., Schnitzer, M. J., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+granule+cells+encode+the+expectation+of+reward.">Cerebellar granule cells encode the expectation of reward.</a> Nature. 544, 96-100 (2017).</li><li>Araujo, A. P. B., Carpi-Santos, R., Gomes, F. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Astrocytes+in+the+Development+of+the+Cerebellum.">The Role of Astrocytes in the Development of the Cerebellum.</a> Cerebellum. , (2019).</li><li>Seto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+identity+transition+from+Purkinje+cell+progenitors+to+GABAergic+interneuron+progenitors+in+the+cerebellum.">Temporal identity transition from Purkinje cell progenitors to GABAergic interneuron progenitors in the cerebellum.</a> Nature Communication. 5, 3337 (2014).</li><li>Marzban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+commitment+in+the+developing+cerebellum.">Cellular commitment in the developing cerebellum.</a> Frontiers in Cell Neurosciences. 8, 450 (2014).</li><li>Koziol, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+paper:+the+cerebellum's+role+in+movement+and+cognition.">Consensus paper: the cerebellum's role in movement and cognition.</a> Cerebellum. 13, 151-177 (2014).</li><li>Ben-Arie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+essential+for+genesis+of+cerebellar+granule+neurons.">Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons.</a> Nature. 390, 169-172 (1997).</li><li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors.">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48, 17-24 (2005).</li><li>Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+expression+redefines+the+rhombic+lip+derivatives+and+reveals+novel+lineages+within+the+brainstem+and+cerebellum.">Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum.</a> Neuron. 48, 31-43 (2005).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+population+of+Nestin-expressing+progenitors+in+the+cerebellum+exhibits+increased+tumorigenicity.">A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity.</a> Nature Neurosciences. 16, 1737-1744 (2013).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum.">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nature Neurosciences. 8, 723-729 (2005).</li><li>Toren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133-positive+hematopoietic+stem+cell+"stemness"+genes+contain+many+genes+mutated+or+abnormally+expressed+in+leukemia.">CD133-positive hematopoietic stem cell "stemness" genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia.</a> Stem Cells. 23, 1142-1153 (2005).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prominin+1+marks+intestinal+stem+cells+that+are+susceptible+to+neoplastic+transformation.">Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation.</a> Nature. 457, 603-607 (2009).</li><li>Man, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Role+for+the+DNA+Sensor+AIM2+in+Stem+Cell+Proliferation+and+Cancer.">Critical Role for the DNA Sensor AIM2 in Stem Cell Proliferation and Cancer.</a> Cell. 162, 45-58 (2015).</li><li>Fleming, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Purkinje+neuron+acts+as+a+central+regulator+of+spatially+and+functionally+distinct+cerebellar+precursors.">The Purkinje neuron acts as a central regulator of spatially and functionally distinct cerebellar precursors.</a> Developmental Cell. 27, 278-292 (2013).</li><li>Panchision, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+flow+cytometric+analysis+of+central+nervous+system+tissue+reveals+novel+functional+relationships+among+cells+expressing+CD133,+CD15,+and+CD24.">Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24.</a> Stem Cells. 25, 1560-1570 (2007).</li><li>Beaudoin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+pyramidal+neurons+from+the+early+postnatal+mouse+hippocampus+and+cortex.">Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex.</a> Nature Protocols. 7, 1741-1754 (2012).</li><li>Edamakanti, C. R., Do, J., Didonna, A., Martina, M., Opal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+ataxin1+disrupts+cerebellar+development+in+spinocerebellar+ataxia+type+1.">Mutant ataxin1 disrupts cerebellar development in spinocerebellar ataxia type 1.</a> Journal of Clinical Investigation. 128, 2252-2265 (2018).</li><li>Erlandsson, A., Enarsson, M., Forsberg-Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immature+neurons+from+CNS+stem+cells+proliferate+in+response+to+platelet-derived+growth+factor.">Immature neurons from CNS stem cells proliferate in response to platelet-derived growth factor.</a> Journal of Neurosciences. 21, 3483-3491 (2001).</li><li>Galli, R., Pagano, S. F., Gritti, A., Vescovi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuronal+differentiation+in+human+CNS+stem+cell+progeny+by+leukemia+inhibitory+factor.">Regulation of neuronal differentiation in human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor.</a> Developmental Neurosciences. 22, 86-95 (2000).</li><li>Silbereis, J., Cheng, E., Ganat, Y. M., Ment, L. R., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursors+with+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+Promoter+Activity+Transiently+Generate+GABA+Interneurons+in+the+Postnatal+Cerebellum.">Precursors with Glial Fibrillary Acidic Protein Promoter Activity Transiently Generate GABA Interneurons in the Postnatal Cerebellum.</a> Stem Cells. 27, 1152-1163 (2009).</li><li>Parmigiani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+Bipotency+of+Astroglial-Like+Cerebellar+Progenitors+along+the+Interneuron+and+Glial+Lineages.">Heterogeneity and Bipotency of Astroglial-Like Cerebellar Progenitors along the Interneuron and Glial Lineages.</a> Journal of Neurosciences. 35, 7388-7402 (2015).</li><li>Wojcinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+granule+cell+replenishment+postinjury+by+adaptive+reprogramming+of+Nestin(+)+progenitors.">Cerebellar granule cell replenishment postinjury by adaptive reprogramming of Nestin(+) progenitors.</a> Nature Neurosciences. 20, 1361-1370 (2017).</li><li>Yang, Z., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP1+is+involved+in+replenishment+of+granule+cell+precursors+following+injury+to+the+neonatal+cerebellum.">YAP1 is involved in replenishment of granule cell precursors following injury to the neonatal cerebellum.</a> Developmental Biology. 1606 (19), 30207 (2019).</li><li>Wang, S. S., Kloth, A. D., Badura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebellum,+sensitive+periods,+and+autism.">The cerebellum, sensitive periods, and autism.</a> Neuron. 83, 518-532 (2014).</li><li>Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+down+and+one+to+go:+modeling+medulloblastoma+subgroups.">Three down and one to go: modeling medulloblastoma subgroups.</a> Cancer Cell. 21, 137-138 (2012).</li><li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+is+a+positive+marker+for+a+distinct+class+of+primitive+human+cord+blood-derived+CD34-negative+hematopoietic+stem+cells.">CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells.</a> Leukemia. 28, 1308-1315 (2014).</li></ol>

Prominin-1-uttrykkende cerebellære stamceller bor i den potensielle hvite substansen i løpet av de første 3 ukene av postnatal liv. Deres spredning er tett kontrollert av den soniske pinnsvinbanen som støttes av Purkinje celler17. Disse stamcellene/stamfarene bidrar til senere fødte GABAergic interneurons kalt kurvceller og stellateceller. Disse interneurons bor i det molekylære laget, hvor de synapse på Purkinje celler og forme PC topografi og funksjon via GABAergic hemming<sup class="xref...

Lillehjernen har lenge blitt anerkjent som en stor nevronal krets som koordinerer frivillig bevegelse1. Den mottar innspill fra de brede swathes av nevroaksen, som inkluderer proprioceptive informasjon fra periferien, slik som å finjustere motorutgang og koordinere bevegelse. Mer nylig har det også vært innblandet i å regulere kognisjon og følelser ved potensielt å bruke lignende informasjonsbehandlingsnettverk2,3,4.
Den voksne lillehjernen består av en ytre cerebellar cortex og indre hvit materie. Ispedd i disse strukturene er dype intracerebellar kjerner. I likhet med resten av nervesystemet, er utviklingen av lillehjernen drevet av spredning av multipotente stamceller (stamceller) som migrerer og skiller seg ut for å gi denne velorganiserte strukturen. I tidlig utvikling (E10.5–E13.5), en ventrikulær stamme nisje rundt den utviklende fjerde ventrikkelen genererer GABAergic nevroner (dvs. Purkinje celler, Lugaro celler, Golgi celler) sammen med Bergmann glia5,6,7,8.
Senere i utviklingen (postnatal uke en), en andre stamcelle nisje i rhombic leppegenererer MATH1- og Nestin-uttrykkende forfedre som gir opphav til eksitatoriskgranule nevroner9,10,11,12. Nylig har en tredje stamcelle nisje blitt beskrevet13. Disse cellene uttrykker prominin-1 (også kjent som CD133), en membran-spenner glykoprotein som definerer en undergruppe av stamceller i tarmen og hematopoetiske systemer14,15,16. In vivo skjebne kartlegging viser at disse stamcellene genererer viktige molekylære lag interneurons (dvs. kurvceller og stellate celler), sammen med astrocytter, i løpet av de tre første postnatal uker. Tidligere har det vært vanskelig å studere disse cellene in vitro fordi tidligere metoder har krevd kostbare og tidkrevende teknikker (dvs. fluorescensaktivert cellesortering [FACS]) som er avhengig av prominin-1 farging12,13,17. Denne protokollen beskriver en immunomagnetisk basert metode for isolering av disse stamcellene som deretter lett kan dyrkes og differensieres.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05%Trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td>0.05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% B27</td>
			<td>Gibco; Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mM EDTA solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- Prominin-1 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biote</td>
			<td>130-092-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>culture plates ultra - low attachment</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4513-1VL</td>
			<td>250 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution-HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G507A</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G502A</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>l-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy</td>
			<td>Lieca TCS SP5 confocal microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Prominin-1</td>
			<td>Affymetrix eBioscience</td>
			<td>14-1331</td>
			<td>1 in 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab27952</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4</td>
			<td>Millopore</td>
			<td>MAB345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>(100 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet- Derived Growth Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8291</td>
			<td>10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-tubulin, b-III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2200</td>
			<td>1 in 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabit anti-GFAP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>1 in 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation columns-MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>40um</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of prominin-1+ stem cells from postnatal mouse cerebellum

De fleste cerebellar nevroner oppstår fra to embryonale stammen nisjer: en rhombic leppe nisje, som genererer alle cerebellar excitatory glutamatergic nevroner, og en ventrikulær sone nisje, som genererer hemmende GABAergic Purkinje celler, som er nevroner som utgjør dyp cerebellar kjerner og Berg glimana. Nylig har en tredje stamcellenisje blitt beskrevet som oppstår som en sekundær germinal sone fra ventrikulær sone nisje. Cellene i denne nisjen er definert av celleoverflatemarkøren prominin-1 og er lokalisert til den utviklende hvite saken om postnatal cerebellum. Denne nisjen står for det avdøde fødte molekylære laget GABAergic interneurons sammen med postnatalt genererte cerebellar astrocytter. I tillegg til deres utviklingsrolle, er denne nisjen økende translasjonell betydning i forhold til sitt engasjement i nevrodegenerasjon og tumorigenesis. Biologien til disse cellene har vært vanskelig å tyde på grunn av mangel på effektive teknikker for rensing. Demonstrert her er effektive metoder for å rense, kultur, og skille disse postnatale cerebellar stamceller.

Prominin-1-positive postnatale cerebellar stamceller dannet nevrosfærer i nevrosfære medium rik på vekstfaktorer (EGF og bFGF). Disse nevrosfærene var positive for prominin-1-farging, markøren som brukes til isolasjon, og også som en flekk for andre stamcellemarkører som Nestin og GFAP13 (Figur 1). Stamcellemarkøruttrykket ble opprettholdt gjennom hele kulturen og i opptil minst åtte passasjer20. Ved tilbaketrekking av vekstfaktorer og...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum at JoVE.com

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Demonstrert her er en effektiv og kostnadseffektiv metode for å rense, kultur, og skille hvite materie stamceller fra postnatal mus cerebellum.

Rensing av Prominin-1+ stamceller fra postnatal mus cerebellum

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

Denne protokollen beskriver en enkel og kostnadseffektiv metode for å rense stamceller fra postnatal lillehjernen. Disse stamcellene står for de senfødte molekylært forvrengte interneurons, men de står også for postnatalt avledede cerebellar astrocytter. Dermed er det helt klart viktig å studere disse cellene for å forstå utviklingen av lillehjernen.Ved hjelp av denne protokollen, utbyttet av stamcelle er sammenlignbar med den av FACS-basert strategi som vanligvis er 10 ganger dyrere. Denne protokollen kan generaliseres for å trekke ut prominin-1 uttrykke stamceller fra andre vev som tarm og benmarg. Begynn med å plassere parabolen med hjernen under et disseksjonsmikroskop.Bruk fin nummer fem tang for å fjerne meninges og store blodkar fra lillehjernen, og skill deretter lillehjernen fra hjernestammen ved hjelp av slikkepotten. Overfør lillehjernen til et 15 milliliter sentrifugerør som inneholder fem milliliter iskald HBSS-løsning. Skyll den og dekanter HBSS.Gjenta vasken to ganger til. Etter siste skylling, tilsett fem milliliter papainbasert vevdissosiasjonsløsning som har blitt forvarmet til 37 grader Celsius. Inkuber vevet i 15 minutter i et 37 graders Celsius vannbad og bland sakte innholdet i røret ved å invertere det tre til fem ganger hvert tredje minutt.Forbered en bred diameter og smal diameter glass Pasteur pipette ved brann polering over en Bunsen brenner. Etter inkubasjonen, vask vevet tre ganger med fem milliliter HBSS-løsning, og sørg for å unngå å miste vev mens dekantering. Etter den siste HBSS-vasken, tilsett fem milliliter DPBS med 250 mikroliter dnase til vevet og dissosier det ved å forsiktig triturere 10 til 15 ganger med den brede diameteren Pasteur pipette.Bruk deretter den smale Pasteur pipetten til å ytterligere triturate vevsslam 10 ganger. Hvis større vevstykker forblir, trykk dem mot bunnen av røret med pipettespissen og fortsett å pipettering til en fin suspensjon er oppnådd. Plasser sentrifugerørene på isen.Deretter spenne dissosierte celler gjennom en 40 mikrometer celle sil inn i en 50 milliliter rør. Topp filteret med 10 milliliter iskald HBSS-løsning for å sikre at cellene passerer gjennom nettet. Overfør de filtrerte cellene til et friskt sentrifugerør på 15 milliliter og sentrifuger suspensjonen ved 300 ganger g i 10 minutter ved fire grader Celsius.Bruk deretter en vakuumaspirator for å fjerne det overnaturlige helt. Resuspend cellepellet i 160 mikroliter iskald magnetisk kolonnebuffer. Tilsett 40 mikroliter anti-prominin-1 mikroperler til cellesuspensjonen.Inkuber deretter rørene i kjøleskap i 15 minutter for å la antistoffet binde seg til prominin-1-uttrykkscellene. Vask cellene med en til to milliliter kolonnebuffer X og sentrifuger dem på 300 ganger g i 10 minutter. Aspirer den overnaturante og resuspend pellet i en milliliter kolonnebuffer X.Plasser de magnetiske kolonnene på magnetstativet og skyll dem en gang med 500 mikroliter buffer X.Påfør den merkede cellesuspensjonen på kolonnen og samle gjennomstrømningen i friske 15 milliliter rør.Vask kolonnen tre ganger med 500 mikroliter buffer X.Fjern deretter kolonnene fra magnetfeltet og legg dem i 1,5 milliliter rør. Legg til en milliliter kulturmedium og skyv stempelet inn i kolonnen for å skylle ut cellene merket med prominin-1 perler. For å passere nevrosfærene, overfør dem sammen med kulturmediet til et sterilt 15 milliliter sentrifugerør.Pellet nevrosfærene ved sentrifugering på 300 ganger g i fem minutter og kast overnatanten. Resuspend pellet i fem milliliter dissosiasjon media med papain eller 0,05% trypsin løsning og inkubere cellene ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Sentrifuger cellefjæringen igjen.Deretter gjenbruke cellene i fem milliliter av neurosphere medium og dissosiere dem ved sakte pipettering dem opp og ned 10 ganger med en Pasteur pipette. Plate cellene i neurosphere media som beskrevet i tekstprotokollen og berike dem med sekundære nevrosfærer etter syv til 10 dager i kultur som tidligere beskrevet. Tell cellene på et hemocytometer og plate det optimale antall celler på poly-D-lysinbelagte plater for fremtidige eksperimenter.Kolonne renset prominin-1 positive postnatal cerebellar stamceller dannet neurosfærer i vekstfaktor rik neurosphere medium. Disse nevrosfærene var positive for prominin-1, deres markør som brukes til isolasjon og for andre stamcellemarkører som nestin og GFAP. Celler i gjennomstrømningen farget negativ for stamcellemarkører prominin-1 og nestin og positiv for nevronal markør beta-III tubulin.Ved tilbaketrekking av vekstfaktorer og i nærvær av leukemi hemmende faktor eller PDGF-AA, prominin-1 positive nevrosfærer differensiert i nevroner, astrocytter og oligodendrocytes. Når du prøver denne teknikken, er det viktig å sørge for at nevrosfærene blir presset gjennom for prominin-1 antistoff, og de kan passeres fordi normale celler også har en tendens til å danne klumper som kan se ut som nevrosfærer. Ved hjelp av denne isolasjonsmetoden kan man karakterisere sine avledede avstamninger som nevroner og glia i helse- og sykdomstilstand.Denne metoden er verdifull og gir ny innsikt i rollen som cerebellar stamceller i lillehjernen utvikling og sykdomsforhold som spinocerebellar ataksi og kreft.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering og kultur neural crest Celler fra Embryonic murin Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-free Utledning av Neural Crest stamceller fra menneskelige pluripotent stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Isolasjon av distinkte cellepopulasjoner fra utviklings Cerebellum av microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Rensing av musehjerne Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolasjon og Culture of Adult Neural stamceller fra mus Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Homochronic transplantasjon av Interneuron forløpere til tidlig Postnatal musen hjerner

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Isolasjon og kultur av embryonale mus embryonale stamceller

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Primær kultur neurons isolert fra embryonale mus lillehjernen

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

Isolasjon og utvidelse av nevrosfærer fra postnatal (P1-3) Mus Neurogenic nisjer

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Neuronal Differensiering fra mus embryonale stamceller In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...