Name: purification of prominin-1+ stem cells from postnatal mouse cerebellum
Uploaded: 2020-04-12T13:00:00
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Agradecemos aos membros do laboratório opala por suas sugestões. Este trabalho foi apoiado pelas subvenções do NIH 1RO1 NS062051 e 1RO1NS08251 (Opal P)

Todos os experimentos em animais foram realizados em conformidade com o Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (2011) do NIH e aprovados pelo IACUC da Universidade northwestern (Protocolo IS00011368).
1. Preparação de Soluções
<ol><li>Preparar a solução de dissociação tecidual feita a partir do fenol estéril contendo a solução de soro tamponado de dulbecco (DPBS) com papaína (100 U/ml), cisteína (0,2 mg/ml) e DNase (250 U/ml).</li>
	<li>Para preparar a solução DNase ...

<ol>
	<li>Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellum:+history.">Cerebellum: history.</a> Neuroscience. 162, 549-559 (2009).</li><li>Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+modulation+of+the+reward+circuitry+and+social+behavior.">Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior.</a> Science. 363, (2019).</li><li>Sathyanesan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+connections+between+cerebellar+development,+behaviour+and+complex+brain+disorders.">Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 20, 298-313 (2019).</li><li>Wagner, M. J., Kim, T. H., Savall, J., Schnitzer, M. J., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+granule+cells+encode+the+expectation+of+reward.">Cerebellar granule cells encode the expectation of reward.</a> Nature. 544, 96-100 (2017).</li><li>Araujo, A. P. B., Carpi-Santos, R., Gomes, F. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Astrocytes+in+the+Development+of+the+Cerebellum.">The Role of Astrocytes in the Development of the Cerebellum.</a> Cerebellum. , (2019).</li><li>Seto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+identity+transition+from+Purkinje+cell+progenitors+to+GABAergic+interneuron+progenitors+in+the+cerebellum.">Temporal identity transition from Purkinje cell progenitors to GABAergic interneuron progenitors in the cerebellum.</a> Nature Communication. 5, 3337 (2014).</li><li>Marzban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+commitment+in+the+developing+cerebellum.">Cellular commitment in the developing cerebellum.</a> Frontiers in Cell Neurosciences. 8, 450 (2014).</li><li>Koziol, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+paper:+the+cerebellum's+role+in+movement+and+cognition.">Consensus paper: the cerebellum's role in movement and cognition.</a> Cerebellum. 13, 151-177 (2014).</li><li>Ben-Arie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+essential+for+genesis+of+cerebellar+granule+neurons.">Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons.</a> Nature. 390, 169-172 (1997).</li><li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors.">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48, 17-24 (2005).</li><li>Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+expression+redefines+the+rhombic+lip+derivatives+and+reveals+novel+lineages+within+the+brainstem+and+cerebellum.">Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum.</a> Neuron. 48, 31-43 (2005).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+population+of+Nestin-expressing+progenitors+in+the+cerebellum+exhibits+increased+tumorigenicity.">A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity.</a> Nature Neurosciences. 16, 1737-1744 (2013).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum.">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nature Neurosciences. 8, 723-729 (2005).</li><li>Toren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133-positive+hematopoietic+stem+cell+"stemness"+genes+contain+many+genes+mutated+or+abnormally+expressed+in+leukemia.">CD133-positive hematopoietic stem cell "stemness" genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia.</a> Stem Cells. 23, 1142-1153 (2005).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prominin+1+marks+intestinal+stem+cells+that+are+susceptible+to+neoplastic+transformation.">Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation.</a> Nature. 457, 603-607 (2009).</li><li>Man, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Role+for+the+DNA+Sensor+AIM2+in+Stem+Cell+Proliferation+and+Cancer.">Critical Role for the DNA Sensor AIM2 in Stem Cell Proliferation and Cancer.</a> Cell. 162, 45-58 (2015).</li><li>Fleming, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Purkinje+neuron+acts+as+a+central+regulator+of+spatially+and+functionally+distinct+cerebellar+precursors.">The Purkinje neuron acts as a central regulator of spatially and functionally distinct cerebellar precursors.</a> Developmental Cell. 27, 278-292 (2013).</li><li>Panchision, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+flow+cytometric+analysis+of+central+nervous+system+tissue+reveals+novel+functional+relationships+among+cells+expressing+CD133,+CD15,+and+CD24.">Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24.</a> Stem Cells. 25, 1560-1570 (2007).</li><li>Beaudoin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+pyramidal+neurons+from+the+early+postnatal+mouse+hippocampus+and+cortex.">Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex.</a> Nature Protocols. 7, 1741-1754 (2012).</li><li>Edamakanti, C. R., Do, J., Didonna, A., Martina, M., Opal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+ataxin1+disrupts+cerebellar+development+in+spinocerebellar+ataxia+type+1.">Mutant ataxin1 disrupts cerebellar development in spinocerebellar ataxia type 1.</a> Journal of Clinical Investigation. 128, 2252-2265 (2018).</li><li>Erlandsson, A., Enarsson, M., Forsberg-Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immature+neurons+from+CNS+stem+cells+proliferate+in+response+to+platelet-derived+growth+factor.">Immature neurons from CNS stem cells proliferate in response to platelet-derived growth factor.</a> Journal of Neurosciences. 21, 3483-3491 (2001).</li><li>Galli, R., Pagano, S. F., Gritti, A., Vescovi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuronal+differentiation+in+human+CNS+stem+cell+progeny+by+leukemia+inhibitory+factor.">Regulation of neuronal differentiation in human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor.</a> Developmental Neurosciences. 22, 86-95 (2000).</li><li>Silbereis, J., Cheng, E., Ganat, Y. M., Ment, L. R., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursors+with+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+Promoter+Activity+Transiently+Generate+GABA+Interneurons+in+the+Postnatal+Cerebellum.">Precursors with Glial Fibrillary Acidic Protein Promoter Activity Transiently Generate GABA Interneurons in the Postnatal Cerebellum.</a> Stem Cells. 27, 1152-1163 (2009).</li><li>Parmigiani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+Bipotency+of+Astroglial-Like+Cerebellar+Progenitors+along+the+Interneuron+and+Glial+Lineages.">Heterogeneity and Bipotency of Astroglial-Like Cerebellar Progenitors along the Interneuron and Glial Lineages.</a> Journal of Neurosciences. 35, 7388-7402 (2015).</li><li>Wojcinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+granule+cell+replenishment+postinjury+by+adaptive+reprogramming+of+Nestin(+)+progenitors.">Cerebellar granule cell replenishment postinjury by adaptive reprogramming of Nestin(+) progenitors.</a> Nature Neurosciences. 20, 1361-1370 (2017).</li><li>Yang, Z., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP1+is+involved+in+replenishment+of+granule+cell+precursors+following+injury+to+the+neonatal+cerebellum.">YAP1 is involved in replenishment of granule cell precursors following injury to the neonatal cerebellum.</a> Developmental Biology. 1606 (19), 30207 (2019).</li><li>Wang, S. S., Kloth, A. D., Badura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebellum,+sensitive+periods,+and+autism.">The cerebellum, sensitive periods, and autism.</a> Neuron. 83, 518-532 (2014).</li><li>Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+down+and+one+to+go:+modeling+medulloblastoma+subgroups.">Three down and one to go: modeling medulloblastoma subgroups.</a> Cancer Cell. 21, 137-138 (2012).</li><li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+is+a+positive+marker+for+a+distinct+class+of+primitive+human+cord+blood-derived+CD34-negative+hematopoietic+stem+cells.">CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells.</a> Leukemia. 28, 1308-1315 (2014).</li></ol>

As células-tronco cerebelares expressas em prominin-1 residem na matéria branca em potencial durante as primeiras 3 semanas de vida pós-natal. Sua proliferação é fortemente controlada pela via de ouriço sônico apoiada pelas células Purkinje17. Essas células-tronco/progenitores contribuem para interneurônios GABAergic os nascidos posteriormente chamados células cestas e células estelares. Estes interneurônios residem na camada molecular, onde sinapse nas células purkinje e esculpe a ...

O cerebelo foi há muito reconhecido como um grande circuito neuronal que coordena o movimento voluntário1. Ele recebe entrada das amplas faixas do neuroeixo, que inclui informações proprioceptivas da periferia, de modo a ajustar a saída do motor e coordenar o movimento. Mais recentemente, também foi implicado na regulação da cognição e das emoções por potencialmente usar redes de processamento de informações semelhantes2,3,4.
O cerebelo adulto é composto por um córtex cerebelar externo e matéria branca interior. Intercalados dentro dessas estruturas são núcleos intracerebelares profundos. Semelhante ao resto do sistema nervoso, o desenvolvimento do cerebelo é impulsionado pela proliferação de células progenitoras multipotentes (células-tronco) que migram e se diferenciam para produzir essa estrutura bem organizada. No desenvolvimento precoce (E10.5-E13.5), um nicho ventricular em torno do quarto ventrículo em desenvolvimento gera neurônios GABAergic (ou seja, células purkinje, células de Lugaro, células Golgi) juntamente com Bergmann glia5,6,7,8.
Mais tarde em desenvolvimento (semana pós-natal um), um segundo nicho de células-tronco no lábio rombico gera progenitores expressivos math1 e nestin que dão origem a neurônios de granulo excitatório9,,10,11,12. Recentemente, um terceiro nicho de células-tronco foi descrito13. Essas células expressam promininina-1 (também conhecida como CD133), uma glicoproteína de membrana que define um subconjunto de células-tronco no intestino e sistemas hematopoiéticos14,15,16. O mapeamento do destino in vivo mostra que essas células-tronco geram interneurônios de camada molecular chave (ou seja, células cestas e células estelares), juntamente com astrócitos, durante as três primeiras semanas pós-natal. No passado, tem sido difícil estudar essas células in vitro porque métodos anteriores exigiram técnicas caras e demoradas (ou seja, classificação celular ativada por fluorescência [FACS]) que dependem da coloração prominin-112,13,17. Este protocolo descreve um método de base imunomagnética para o isolamento dessas células-tronco que podem então ser facilmente cultivadas e diferenciadas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05%Trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td>0.05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% B27</td>
			<td>Gibco; Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mM EDTA solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- Prominin-1 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biote</td>
			<td>130-092-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>culture plates ultra - low attachment</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4513-1VL</td>
			<td>250 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution-HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G507A</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G502A</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>l-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy</td>
			<td>Lieca TCS SP5 confocal microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Prominin-1</td>
			<td>Affymetrix eBioscience</td>
			<td>14-1331</td>
			<td>1 in 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab27952</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4</td>
			<td>Millopore</td>
			<td>MAB345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>(100 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet- Derived Growth Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8291</td>
			<td>10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-tubulin, b-III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2200</td>
			<td>1 in 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabit anti-GFAP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>1 in 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation columns-MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>40um</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of prominin-1+ stem cells from postnatal mouse cerebellum

A maioria dos neurônios cerebelares surge de dois nichos embrionários: um nicho labial rombônico, que gera todos os neurônios glutamatergicos excitatórios cerebelares, e um nicho de zona ventricular, que gera as células purkinje sinógicas inibidoras, que são neurônios que constituem os núcleos cerebelares e a glia de Bergman. Recentemente, um terceiro nicho de células-tronco foi descrito que surge como uma zona germinal secundária do nicho da zona ventricular. As células deste nicho são definidas pelo marcador de superfície celular prominin-1 e são localizadas para a matéria branca em desenvolvimento do cerebelo pós-natal. Este nicho explica a camada molecular de nascimento tardio dos interneurônios GABAergic, juntamente com os astrócitos cerebelares gerados no pós-natal. Além de seu papel de desenvolvimento, esse nicho vem ganhando importância translacional no que diz respeito ao seu envolvimento na neurodegeneração e tumorigênese. A biologia dessas células tem sido difícil de decifrar devido à falta de técnicas eficientes para sua purificação. Aqui estão demonstrados métodos eficientes para purificar, cultura rastamente e diferenciar essas células-tronco cerebelares pós-natal.

As células-tronco cerebelares pós-natal prominin-1-positivas formaram neuroesferas na média neurosfera rica em fatores de crescimento (EGF e bFGF). Estas neuroesferas foram positivas para a coloração de prominin-1, o marcador usado para o isolamento, e também como uma mancha para outros marcadores de células-tronco como Nestin e GFAP13 (Figura 1). A expressão do marcador de células-tronco foi mantida em toda a cultura e por pelo menos oito passagens<sup class...

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Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Demonstrado aqui é um método eficiente e econômico para purificar, cultura e diferenciar células-tronco de matéria branca do cerebelo de rato pós-natal.

Purificação de Prominin-1+ Células-tronco do Rato Pós-Natal Cerebellum

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

Este protocolo descreve um método fácil e econômico para purificar células-tronco do cerebelo pós-natal. Essas células-tronco são responsáveis pelos interneurônios moleculares, mas também são responsáveis por astrócitos cerebelares derivados pós-naturais. Assim, estudar essas células é claramente importante para entender o desenvolvimento do cerebelo.Usando este protocolo, o rendimento da célula-tronco é comparável ao da estratégia baseada em FACS, que normalmente é 10 vezes mais cara. Este protocolo pode ser generalizado para extrair prominina-1 expressando células-tronco de outros tecidos, como intestino e medula óssea. Comece colocando o prato com o cérebro sob um microscópio de dissecção.Use fórceps de número cinco para remover os meninges e grandes vasos sanguíneos do cerebelo, em seguida, separe o cerebelo do tronco cerebral usando a espátula. Transfira o cerebelo para um tubo centrífuga de 15 mililitros contendo cinco mililitros de solução HBSS gelada. Enxágüe-o e depois decante o HBSS.Repita a lavagem mais duas vezes. Após a última lavagem, adicione cinco mililitros de solução de dissociação de tecido à base de papain que foi pré-aquecida a 37 graus Celsius. Incubar o tecido por 15 minutos em um banho de água de 37 graus Celsius e misturar lentamente o conteúdo do tubo invertendo-o três a cinco vezes a cada três minutos.Prepare uma pipeta pasteur de diâmetro largo e de diâmetro estreito polindo sobre um queimador Bunsen. Após a incubação, lave o tecido três vezes com cinco mililitros de solução HBSS, certificando-se de evitar perder tecido durante a decantação. Após a última lavagem hbss, adicione cinco mililitros de DPBS com 250 microliters de DNAse ao tecido e dissocia-o, triturando suavemente de 10 a 15 vezes com a pipeta Pasteur de diâmetro largo.Em seguida, use a pipeta pasteur estreita para triturar ainda mais o chorume tecidual 10 vezes. Se permanecerem pedaços maiores de tecido, pressione-os contra a parte inferior do tubo com a ponta da pipeta e continue a pipetar até que uma suspensão fina seja alcançada. Coloque os tubos de centrífuga no gelo.Em seguida, coe as células dissociadas através de um coador de células de 40 micrômetros em um tubo de 50 mililitros. Cubra o filtro com 10 mililitros de solução HBSS gelada para garantir que as células passem pela malha. Transfira as células filtradas para um tubo fresco de centrífuga de 15 mililitros e centrifugar a suspensão a 300 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius.Em seguida, use um aspirador de vácuo para remover completamente o supernatante. Resuspend a pelota celular em 160 microliters de tampão de coluna magnética gelada. Adicione 40 microliters de microesferas anti-prominina-1 à suspensão celular.Em seguida, incubar os tubos em uma geladeira por 15 minutos para permitir que o anticorpo se ligue às células expressas de prominina-1. Lave as células com um a dois mililitros de tampão de coluna X e centrifuá-las a 300 vezes g por 10 minutos. Aspire o supernatante e resuspenja a pelota em um mililitro de tampão de coluna X.Coloque as colunas magnéticas no suporte magnético e enxágue-as uma vez com 500 microliters de buffer X.Aplique a suspensão celular rotulada na coluna e colete o fluxo através de tubos frescos de 15 mililitros.Lave a coluna três vezes com 500 microliters de buffer X.Em seguida, remova as colunas do campo magnético e coloque-as em tubos de 1,5 mililitro. Adicione um mililitro de meio de cultura e empurre o êmbolo para dentro da coluna para lavar as células marcadas com contas de prominina-1. Para atravessar as neurosferas, transfira-as junto com o meio de cultura para um tubo de centrífuga de 15 mililitros estéril.Pellule as neuroesferas por centrifugação a 300 vezes g por cinco minutos e descarte o supernatante. Resuspenme a pelota em cinco mililitros de mídia de dissociação com solução de papain ou 0,05% trypsin e incubar as células a 37 graus Celsius por 10 minutos. Centrifugar a suspensão celular novamente.Em seguida, resuspende as células em cinco mililitros de neurosfera média e dissociá-las lentamente pipetando-as para cima e para baixo 10 vezes com uma pipeta Pasteur. Assode as células na mídia da neurosfera, como descrito no protocolo de texto e enriqueça-as com neuroesferas secundárias após sete a dez dias de cultura, como descrito anteriormente. Conte as células em um hemócito e plaque o número ideal de células em placas revestidas de poli-D-lysina para experimentos futuros.A coluna purificada prominina-1 células-tronco cerebelares pós-natal positivas formaram neuroesferas em meio neurosfera rico em fator de crescimento. Essas neuroesferas foram positivas para prominina-1, seu marcador usado para isolamento e para outros marcadores de células-tronco, como nestin e GFAP. Células no fluxo através de marcadores de células-tronco prominin-1 e nestin e positivo para tubulina marcador neuronal beta-III.Após a retirada de fatores de crescimento e na presença de fator inibidor da leucemia ou PDGF-AA, as neuroesferas positivas de prominina-1 se diferenciaram em neurônios, astrócitos e oligodenrócitos. Ao tentar essa técnica, é importante garantir que as neurosferas sejam empurradas para anticorpos prominina-1 e possam ser passagens porque as células normais também tendem a formar aglomerados que podem parecer neurosferas. Usando esse método de isolamento, pode-se caracterizar suas linhagens derivadas como neurônios e glia em saúde e condição de doença.Este método é valioso e fornece uma nova visão sobre o papel das células-tronco cerebelares no desenvolvimento cerebelar e em condições de doenças como ataxia spinocerebellar e câncer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Neurociência

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

O isolamento de populações de células distintas do cerebelo em desenvolvimento por Microdissecção

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Purificação de embarcações do cérebro do rato

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolamento e Cultura de células estaminais adultas neurais do Subcallosal Zona Rato

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Homochronic transplante de precursores interneurônio nos cérebros de Mouse pós-natal precoce

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Isolamento e cultura de células-tronco neurais embrionárias de rato

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Transplantação dos progenitors corticais Quimiogenetically projetados do interneuron em cérebros Postnatal adiantados do rato

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Cultura primária de neurônios isolados do cerebelo embrionário do rato

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1ÃƒÂ¢Ã‹â€ '3 Mouse Neurogenic Niches

Isolamento e Expansão das Neuroesferas a partir de Nichos Neurogênicos de Camundongos (P1-3)

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Diferenciação neuronal de células-tronco embrionárias do rato in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...