Name: purification of prominin-1+ stem cells from postnatal mouse cerebellum
Uploaded: 2020-04-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum at JoVE.com

Мы благодарим членов лаборатории Opal за их предложения. Эта работа была поддержана грантами NIH 1RO1 NS062051 и 1RO1NS08251 (Opal P)

Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных (2011) и были одобрены Макuc Северо-Западного университета (Protocol IS00011368).
1. Подготовка решений
<ol><li>Подготовка раствора диссоциации тканей из стериль?...

<ol>
	<li>Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellum:+history.">Cerebellum: history.</a> Neuroscience. 162, 549-559 (2009).</li><li>Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+modulation+of+the+reward+circuitry+and+social+behavior.">Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior.</a> Science. 363, (2019).</li><li>Sathyanesan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+connections+between+cerebellar+development,+behaviour+and+complex+brain+disorders.">Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 20, 298-313 (2019).</li><li>Wagner, M. J., Kim, T. H., Savall, J., Schnitzer, M. J., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+granule+cells+encode+the+expectation+of+reward.">Cerebellar granule cells encode the expectation of reward.</a> Nature. 544, 96-100 (2017).</li><li>Araujo, A. P. B., Carpi-Santos, R., Gomes, F. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Astrocytes+in+the+Development+of+the+Cerebellum.">The Role of Astrocytes in the Development of the Cerebellum.</a> Cerebellum. , (2019).</li><li>Seto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+identity+transition+from+Purkinje+cell+progenitors+to+GABAergic+interneuron+progenitors+in+the+cerebellum.">Temporal identity transition from Purkinje cell progenitors to GABAergic interneuron progenitors in the cerebellum.</a> Nature Communication. 5, 3337 (2014).</li><li>Marzban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+commitment+in+the+developing+cerebellum.">Cellular commitment in the developing cerebellum.</a> Frontiers in Cell Neurosciences. 8, 450 (2014).</li><li>Koziol, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+paper:+the+cerebellum's+role+in+movement+and+cognition.">Consensus paper: the cerebellum's role in movement and cognition.</a> Cerebellum. 13, 151-177 (2014).</li><li>Ben-Arie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+essential+for+genesis+of+cerebellar+granule+neurons.">Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons.</a> Nature. 390, 169-172 (1997).</li><li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors.">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48, 17-24 (2005).</li><li>Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+expression+redefines+the+rhombic+lip+derivatives+and+reveals+novel+lineages+within+the+brainstem+and+cerebellum.">Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum.</a> Neuron. 48, 31-43 (2005).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+population+of+Nestin-expressing+progenitors+in+the+cerebellum+exhibits+increased+tumorigenicity.">A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity.</a> Nature Neurosciences. 16, 1737-1744 (2013).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum.">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nature Neurosciences. 8, 723-729 (2005).</li><li>Toren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133-positive+hematopoietic+stem+cell+"stemness"+genes+contain+many+genes+mutated+or+abnormally+expressed+in+leukemia.">CD133-positive hematopoietic stem cell "stemness" genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia.</a> Stem Cells. 23, 1142-1153 (2005).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prominin+1+marks+intestinal+stem+cells+that+are+susceptible+to+neoplastic+transformation.">Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation.</a> Nature. 457, 603-607 (2009).</li><li>Man, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Role+for+the+DNA+Sensor+AIM2+in+Stem+Cell+Proliferation+and+Cancer.">Critical Role for the DNA Sensor AIM2 in Stem Cell Proliferation and Cancer.</a> Cell. 162, 45-58 (2015).</li><li>Fleming, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Purkinje+neuron+acts+as+a+central+regulator+of+spatially+and+functionally+distinct+cerebellar+precursors.">The Purkinje neuron acts as a central regulator of spatially and functionally distinct cerebellar precursors.</a> Developmental Cell. 27, 278-292 (2013).</li><li>Panchision, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+flow+cytometric+analysis+of+central+nervous+system+tissue+reveals+novel+functional+relationships+among+cells+expressing+CD133,+CD15,+and+CD24.">Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24.</a> Stem Cells. 25, 1560-1570 (2007).</li><li>Beaudoin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+pyramidal+neurons+from+the+early+postnatal+mouse+hippocampus+and+cortex.">Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex.</a> Nature Protocols. 7, 1741-1754 (2012).</li><li>Edamakanti, C. R., Do, J., Didonna, A., Martina, M., Opal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+ataxin1+disrupts+cerebellar+development+in+spinocerebellar+ataxia+type+1.">Mutant ataxin1 disrupts cerebellar development in spinocerebellar ataxia type 1.</a> Journal of Clinical Investigation. 128, 2252-2265 (2018).</li><li>Erlandsson, A., Enarsson, M., Forsberg-Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immature+neurons+from+CNS+stem+cells+proliferate+in+response+to+platelet-derived+growth+factor.">Immature neurons from CNS stem cells proliferate in response to platelet-derived growth factor.</a> Journal of Neurosciences. 21, 3483-3491 (2001).</li><li>Galli, R., Pagano, S. F., Gritti, A., Vescovi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuronal+differentiation+in+human+CNS+stem+cell+progeny+by+leukemia+inhibitory+factor.">Regulation of neuronal differentiation in human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor.</a> Developmental Neurosciences. 22, 86-95 (2000).</li><li>Silbereis, J., Cheng, E., Ganat, Y. M., Ment, L. R., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursors+with+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+Promoter+Activity+Transiently+Generate+GABA+Interneurons+in+the+Postnatal+Cerebellum.">Precursors with Glial Fibrillary Acidic Protein Promoter Activity Transiently Generate GABA Interneurons in the Postnatal Cerebellum.</a> Stem Cells. 27, 1152-1163 (2009).</li><li>Parmigiani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+Bipotency+of+Astroglial-Like+Cerebellar+Progenitors+along+the+Interneuron+and+Glial+Lineages.">Heterogeneity and Bipotency of Astroglial-Like Cerebellar Progenitors along the Interneuron and Glial Lineages.</a> Journal of Neurosciences. 35, 7388-7402 (2015).</li><li>Wojcinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+granule+cell+replenishment+postinjury+by+adaptive+reprogramming+of+Nestin(+)+progenitors.">Cerebellar granule cell replenishment postinjury by adaptive reprogramming of Nestin(+) progenitors.</a> Nature Neurosciences. 20, 1361-1370 (2017).</li><li>Yang, Z., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP1+is+involved+in+replenishment+of+granule+cell+precursors+following+injury+to+the+neonatal+cerebellum.">YAP1 is involved in replenishment of granule cell precursors following injury to the neonatal cerebellum.</a> Developmental Biology. 1606 (19), 30207 (2019).</li><li>Wang, S. S., Kloth, A. D., Badura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebellum,+sensitive+periods,+and+autism.">The cerebellum, sensitive periods, and autism.</a> Neuron. 83, 518-532 (2014).</li><li>Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+down+and+one+to+go:+modeling+medulloblastoma+subgroups.">Three down and one to go: modeling medulloblastoma subgroups.</a> Cancer Cell. 21, 137-138 (2012).</li><li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+is+a+positive+marker+for+a+distinct+class+of+primitive+human+cord+blood-derived+CD34-negative+hematopoietic+stem+cells.">CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells.</a> Leukemia. 28, 1308-1315 (2014).</li></ol>

Проминин-1-выражения мозжечковые стволовые клетки находятся в перспективных белого вещества в течение первых 3 недель послеродовой жизни. Их пролиферация жестко контролируется звуковым пути ежа поддерживается Purkinje клетки17. Эти стволовые клетки / прародители способствуют...

Мозжечок уже давно признан в качестве основного нейрональной цепи координации добровольного движения1. Он получает входные данные из широких полос нейрооаксиса, который включает в себя проприоцептивную информацию с периферии, с тем чтобы точно настроить выход двигателя и координировать движение. В последнее время он также был вовлечен в регулирование познания и эмоции, потенциально используя аналогичные сети обработки информации2,3,4.
Взрослый мозжечок состоит из внешней мозжечковой коры и внутреннего белого вещества. Перемежаются в этих структурах глубоко интрейреблярных ядер. Как и в остальной части нервной системы, развитие мозжечка обусловлено распространением многопотентных клеток-прародителей (стволовых клеток), которые мигрируют и дифференцируются, чтобы дать эту хорошо организованную структуру. В начале развития (E10.5-E13.5), желудочковой стволовой ниши вокруг развивающихся четвертого желудочка генерирует ГАМК нейронов (т.е., Purkinje клеток, Лугаро клетки, клетки Golgi) вместе с Бергманн глия5,6,7,8.
Позже в развитии (послеродовая неделя один), вторая ниша стволовых клеток в ромбической губы генерирует MATH1- и Nestin-выражения прародителей, которые приводят к возбуждающим гранул нейронов9,10,11,12. Недавно третья ниша стволовых клеток была описана13. Эти клетки выражают проминин-1 (также известный как CD133), мембранно-охватывающий гликопротеин, который определяет подмножество стволовых клеток в кишечнике и гематопогетических системах14,15,16. Картирование судьбы vivo показывает, что эти стволовые клетки генерируют ключевые молекулярные интернейроны (т.е. клетки корзины и стеллатные клетки), наряду с астроцитами, в течение первых трех послеродовых недель. В прошлом, было трудно изучить эти клетки в пробирке, потому что предыдущие методы требуют дорогостоящих и трудоемких методов (т.е. флуоресценция активированных клеток сортировки »FACS» которые зависят от prominin-1 окрашивание12,13,17. Этот протокол описывает иммуномагнитный метод изоляции этих стволовых клеток, которые затем могут быть легко культивированы и дифференцированы.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05%Trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td>0.05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% B27</td>
			<td>Gibco; Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mM EDTA solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- Prominin-1 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biote</td>
			<td>130-092-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>culture plates ultra - low attachment</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4513-1VL</td>
			<td>250 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution-HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G507A</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G502A</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>l-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy</td>
			<td>Lieca TCS SP5 confocal microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Prominin-1</td>
			<td>Affymetrix eBioscience</td>
			<td>14-1331</td>
			<td>1 in 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab27952</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4</td>
			<td>Millopore</td>
			<td>MAB345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>(100 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet- Derived Growth Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8291</td>
			<td>10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-tubulin, b-III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2200</td>
			<td>1 in 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabit anti-GFAP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>1 in 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation columns-MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>40um</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of prominin-1+ stem cells from postnatal mouse cerebellum

Большинство мозжечковых нейронов возникают из двух эмбриональных стволовых ниш: ромбические губы нишу, которая генерирует все мозжечковые возбуждающие глутамамергические нейроны, и желудочковой ниши зоны, которая генерирует ингибирующие GABAergic Purkinje клеток, которые являются нейронами, которые составляют глубокие ядра мочеиссожиек и Бергман. Недавно была описана третья ниша стволовых клеток, которая возникает как второстепенная зародышевая зона из ниши желудочковой зоны. Клетки этой ниши определяются маркером поверхности клеток проминин-1 и локализованы в развивающемся белом веществе послеродового мозжечка. Эта ниша приходится конце родился молекулярный слой ГАМК-интернейронов наряду с послеродовой генерируемых мозжечковых астроцитов. В дополнение к их роли в развитии, эта ниша приобретает переводное значение в отношении его участия в нейродегенерации и опухолевого генезиза. Биологию этих клеток было трудно расшифровать из-за отсутствия эффективных методов их очистки. Здесь демонстрируются эффективные методы очищения, культуры и дифференцирования этих послеродовых стволовых клеток мозжечка.

Проминин-1-положительные послеродовые стволовые клетки формируются нейросферы в нейросфере среды, богатой факторами роста (EGF и bFGF). Эти нейросферы были положительными для prominin-1-окрашивания, маркер, используемый для изоляции, а также в качестве пятна для других маркеров стволовых клето...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum at JoVE.com

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Демонстрируется здесь является эффективным и экономически эффективным методом для очистки, культуры и дифференцировать белые стволовые клетки материи от послеродового мозжечка мыши.

Очистка Проминина-1- Стволовые клетки от постнатального мышиного церебеллума

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

Этот протокол описывает простой и экономически эффективный метод очистки стволовых клеток от послеродового мозжечка. Эти стволовые клетки составляют позднерожденные молекулярно искаженные интернейроны, но они также составляют постнатально полученные мозжечковые астроциты. Таким образом, изучение этих клеток, безусловно, важно для понимания развития мозжечка.Используя этот протокол, выход стволовых клеток сопоставим с стратегией, основанной на FACS, которая, как правило, в 10 раз дороже. Этот протокол может быть обобщен для извлечения проминина-1 экспрессии стволовых клеток из других тканей, таких как кишечник и костный мозг. Начните с размещения блюдо с мозгом под микроскопом вскрытия.Используйте тонкое число пять тибры для удаления опоясывания и крупных кровеносных сосудов из мозжечка, а затем отделить мозжечок от ствола мозга с помощью шпателя. Перенесите мозжечок в 15-миллилитровую центрифугу, содержащую пять миллилитров ледяного раствора HBSS. Промыть его затем decant HBSS.Повторите стирку еще два раза. После последнего полоскания добавьте пять миллилитров раствора диссоциации тканей на основе папаина, который предварительно разогрет до 37 градусов по Цельсию. Инкубировать ткани в течение 15 минут в 37 градусов по Цельсию водяной бане и медленно смешивать содержимое трубки, инвертирование его три-пять раз каждые три минуты.Подготовка широкого диаметра и узкого диаметра стекла Пастер пипетки путем пожара полировки над горелки Bunsen. После инкубации, мыть ткани три раза с пятью миллилитров раствора HBSS убедившись, чтобы избежать потери ткани во время декантации. После последнего мытья HBSS, добавить пять миллилитров DPBS с 250 микролитров DNAse в ткани и разобщить его, мягко тритурируя 10 до 15 раз с широким диаметром Пастер пипетки.Затем используйте узкую трубу Пастера для дальнейшего тритурата навоза ткани 10 раз. Если остаются более крупные кусочки ткани, прижимайте их к нижней части трубки кончиком пипетки и продолжайте трубоубезго до тех пор, пока не будет достигнута тонкая подвеска. Поместите центрифуги труб на льду.Затем процедите диссоциированные клетки через 40-метровый клеточный ситечко в 50 миллилитровую трубку. Топ фильтр с 10 миллилитров ледяного решения HBSS для обеспечения того, чтобы клетки проходят через сетку. Перенесите фильтрованные клетки в свежую 15-миллилитровую центрифугу и центрифуга подвески при 300 раз g в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.Затем используйте вакуумный аспиратор, чтобы удалить супернатант полностью. Перепродюсните гранулы клетки в 160 микролитров буфера ледяной холодной магнитной колонки. Добавьте 40 микролитров антипроминин-1 микробусов к клеточной подвеске.Затем инкубировать трубки в холодильнике в течение 15 минут, чтобы антитела связываться с проминин-1 экспрессии клеток. Вымойте клетки с одного до двух миллилитров буфера столбца X и центрифуги их в 300 раз г в течение 10 минут. Аспирировать супернатант и повторно использовать гранулы в один миллилитр колонки буфера X.Place магнитных столбцов на магнитной подготе и промыть их один раз с 500 микролитров буфера X.Apply помечены подвески клеток на колонку и собирать поток в свежих 15 миллилитров труб.Вымойте столбец три раза с помощью 500 микролитров буфера X.Then удалите колонны из магнитного поля и поместите их в 1,5 миллилитровые трубки. Добавьте один миллилитр среды культуры и нажмите поршень в колонку, чтобы избавиться от клеток, помеченных бусами prominin-1. Чтобы пройти нейросферы, передать их вместе с культурой среды в стерильные 15 миллилитров центрифуги трубки.Пеллет нейросферы центрифугации в 300 раз g в течение пяти минут и отказаться от супернатанта. Повторное увеличение гранул в пяти миллилитров диссоциации средств массовой информации с папаином или 0,05%трипсина раствора и инкубировать клетки при 37 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Снова центрифугировать подвесную клетку.Затем повторного перерасхода клеток в пять миллилитров нейросферы среды и разобщить их медленно трубопроводов их вверх и вниз в 10 раз с Пастер пипетки. Плита клетки в нейросфере средств массовой информации, как описано в текстовом протоколе и обогатить их вторичных нейросфер после семи до 10 дней в культуре, как описано ранее. Подсчитайте клетки на гемоцитометре и пластины оптимальное количество клеток на поли-D-лизин покрытием пластин для будущих экспериментов.Колонка очищенных проминин-1 положительные послеродовые мозжечковые стволовые клетки образуют нейросферы в фактор роста богатых нейросферы среды. Эти нейросферы были положительными для проминина-1, их маркер, используемый для изоляции и для других маркеров стволовых клеток, таких как nestin и GFAP. Клетки в flowthrough окрашенных отрицательных для маркеров стволовых клеток проминин-1 и nestin и положительный для нейронального маркера бета-III тубулин.При снятии факторов роста и при наличии ингибиторного фактора лейкемии или PDGF-AA, проминин-1 положительные нейросферы дифференцированы в нейроны, астроциты и олигодендроциты. При попытке этого метода, важно, чтобы убедиться, что нейросферы проталкиваются для проминина-1 антитела, и они могут быть прошли, потому что нормальные клетки также, как правило, образуют сгустки, которые могут выглядеть как нейросферы. Используя этот метод изоляции, можно охарактеризовать его производные линии, такие как нейроны и глиа в состоянии здоровья и болезней.Этот метод является ценным и дает новое представление о роли мозжечковых стволовых клеток в мозжечковом развитии и заболеваниях, таких как спиноцеребелларная атаксия и рак.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Выделение и культуры клеток нервного гребня из эмбриональных мышей нервной трубки

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Выделение различных клеточных популяций из развивающихся мозжечка микродиссекции

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Очистка сосудов головного мозга мыши

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Выделение и культуры взрослых нервные стволовые клетки от мыши зоны расположенный под мозолистым телом

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Homochronic трансплантация межнейронного прекурсоров в раннем постнатальном мыши мозги

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Изоляции и культуры нервных стволовых клеток эмбриона мыши

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Трансплантация хемогенетически инженерии Кортикальный интернерерон прародителей в начале послеродовой мозг мыши

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Первичная культура нейронов, изолированных от эмбриональной мыши Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1ÃƒÂ¢Ã‹â€ '3 Mouse Neurogenic Niches

Изоляция и расширение нейросфер от постнатальных (P1'3) Мыши нейрогенных ниш

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Нейрональная дифференциация от мыши эмбриональных стволовых клеток in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...