Name: purification of prominin-1+ stem cells from postnatal mouse cerebellum
Uploaded: 2020-04-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum at JoVE.com

Vi tackar Opal lab medlemmar för deras förslag. Detta arbete stöddes av NIH-bidrag 1RO1 NS062051 och 1RO1NS08251 (Opal P)

Alla djurförsök utfördes i enlighet med NIH:s guide för vård och användning av försöksdjur (2011) och godkändes av Northwestern University IACUC (protokoll IS00011368).
1. Utarbetande av lösningar
<ol><li>Förbered vävnadsdissociationslösning tillverkad av steril fenol som innehåller Dulbeccos fosfatbuffertade koksaltlösning (DPBS) med papain (100 U/ml), cystein (0,2 mg/ml) och DNase (250 U/ml).</li>
	<li>För att förbereda DNase lösning späd 100 mg av det frystorkade pulvre...

<ol>
	<li>Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellum:+history.">Cerebellum: history.</a> Neuroscience. 162, 549-559 (2009).</li><li>Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+modulation+of+the+reward+circuitry+and+social+behavior.">Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior.</a> Science. 363, (2019).</li><li>Sathyanesan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+connections+between+cerebellar+development,+behaviour+and+complex+brain+disorders.">Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 20, 298-313 (2019).</li><li>Wagner, M. J., Kim, T. H., Savall, J., Schnitzer, M. J., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+granule+cells+encode+the+expectation+of+reward.">Cerebellar granule cells encode the expectation of reward.</a> Nature. 544, 96-100 (2017).</li><li>Araujo, A. P. B., Carpi-Santos, R., Gomes, F. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Astrocytes+in+the+Development+of+the+Cerebellum.">The Role of Astrocytes in the Development of the Cerebellum.</a> Cerebellum. , (2019).</li><li>Seto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+identity+transition+from+Purkinje+cell+progenitors+to+GABAergic+interneuron+progenitors+in+the+cerebellum.">Temporal identity transition from Purkinje cell progenitors to GABAergic interneuron progenitors in the cerebellum.</a> Nature Communication. 5, 3337 (2014).</li><li>Marzban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+commitment+in+the+developing+cerebellum.">Cellular commitment in the developing cerebellum.</a> Frontiers in Cell Neurosciences. 8, 450 (2014).</li><li>Koziol, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+paper:+the+cerebellum's+role+in+movement+and+cognition.">Consensus paper: the cerebellum's role in movement and cognition.</a> Cerebellum. 13, 151-177 (2014).</li><li>Ben-Arie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+essential+for+genesis+of+cerebellar+granule+neurons.">Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons.</a> Nature. 390, 169-172 (1997).</li><li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors.">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48, 17-24 (2005).</li><li>Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+expression+redefines+the+rhombic+lip+derivatives+and+reveals+novel+lineages+within+the+brainstem+and+cerebellum.">Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum.</a> Neuron. 48, 31-43 (2005).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+population+of+Nestin-expressing+progenitors+in+the+cerebellum+exhibits+increased+tumorigenicity.">A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity.</a> Nature Neurosciences. 16, 1737-1744 (2013).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum.">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nature Neurosciences. 8, 723-729 (2005).</li><li>Toren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133-positive+hematopoietic+stem+cell+"stemness"+genes+contain+many+genes+mutated+or+abnormally+expressed+in+leukemia.">CD133-positive hematopoietic stem cell "stemness" genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia.</a> Stem Cells. 23, 1142-1153 (2005).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prominin+1+marks+intestinal+stem+cells+that+are+susceptible+to+neoplastic+transformation.">Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation.</a> Nature. 457, 603-607 (2009).</li><li>Man, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Role+for+the+DNA+Sensor+AIM2+in+Stem+Cell+Proliferation+and+Cancer.">Critical Role for the DNA Sensor AIM2 in Stem Cell Proliferation and Cancer.</a> Cell. 162, 45-58 (2015).</li><li>Fleming, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Purkinje+neuron+acts+as+a+central+regulator+of+spatially+and+functionally+distinct+cerebellar+precursors.">The Purkinje neuron acts as a central regulator of spatially and functionally distinct cerebellar precursors.</a> Developmental Cell. 27, 278-292 (2013).</li><li>Panchision, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+flow+cytometric+analysis+of+central+nervous+system+tissue+reveals+novel+functional+relationships+among+cells+expressing+CD133,+CD15,+and+CD24.">Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24.</a> Stem Cells. 25, 1560-1570 (2007).</li><li>Beaudoin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+pyramidal+neurons+from+the+early+postnatal+mouse+hippocampus+and+cortex.">Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex.</a> Nature Protocols. 7, 1741-1754 (2012).</li><li>Edamakanti, C. R., Do, J., Didonna, A., Martina, M., Opal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+ataxin1+disrupts+cerebellar+development+in+spinocerebellar+ataxia+type+1.">Mutant ataxin1 disrupts cerebellar development in spinocerebellar ataxia type 1.</a> Journal of Clinical Investigation. 128, 2252-2265 (2018).</li><li>Erlandsson, A., Enarsson, M., Forsberg-Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immature+neurons+from+CNS+stem+cells+proliferate+in+response+to+platelet-derived+growth+factor.">Immature neurons from CNS stem cells proliferate in response to platelet-derived growth factor.</a> Journal of Neurosciences. 21, 3483-3491 (2001).</li><li>Galli, R., Pagano, S. F., Gritti, A., Vescovi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuronal+differentiation+in+human+CNS+stem+cell+progeny+by+leukemia+inhibitory+factor.">Regulation of neuronal differentiation in human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor.</a> Developmental Neurosciences. 22, 86-95 (2000).</li><li>Silbereis, J., Cheng, E., Ganat, Y. M., Ment, L. R., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursors+with+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+Promoter+Activity+Transiently+Generate+GABA+Interneurons+in+the+Postnatal+Cerebellum.">Precursors with Glial Fibrillary Acidic Protein Promoter Activity Transiently Generate GABA Interneurons in the Postnatal Cerebellum.</a> Stem Cells. 27, 1152-1163 (2009).</li><li>Parmigiani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+Bipotency+of+Astroglial-Like+Cerebellar+Progenitors+along+the+Interneuron+and+Glial+Lineages.">Heterogeneity and Bipotency of Astroglial-Like Cerebellar Progenitors along the Interneuron and Glial Lineages.</a> Journal of Neurosciences. 35, 7388-7402 (2015).</li><li>Wojcinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+granule+cell+replenishment+postinjury+by+adaptive+reprogramming+of+Nestin(+)+progenitors.">Cerebellar granule cell replenishment postinjury by adaptive reprogramming of Nestin(+) progenitors.</a> Nature Neurosciences. 20, 1361-1370 (2017).</li><li>Yang, Z., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP1+is+involved+in+replenishment+of+granule+cell+precursors+following+injury+to+the+neonatal+cerebellum.">YAP1 is involved in replenishment of granule cell precursors following injury to the neonatal cerebellum.</a> Developmental Biology. 1606 (19), 30207 (2019).</li><li>Wang, S. S., Kloth, A. D., Badura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebellum,+sensitive+periods,+and+autism.">The cerebellum, sensitive periods, and autism.</a> Neuron. 83, 518-532 (2014).</li><li>Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+down+and+one+to+go:+modeling+medulloblastoma+subgroups.">Three down and one to go: modeling medulloblastoma subgroups.</a> Cancer Cell. 21, 137-138 (2012).</li><li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+is+a+positive+marker+for+a+distinct+class+of+primitive+human+cord+blood-derived+CD34-negative+hematopoietic+stem+cells.">CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells.</a> Leukemia. 28, 1308-1315 (2014).</li></ol>

Prominin-1-uttrycker cerebellar stamceller bor i den potentiella vita frågan under de första 3 veckorna av postnatala liv. Deras spridning är hårt kontrollerad av sonic igelkott väg stöds av Purkinje celler17. Dessa stamceller/stamfater bidrar till senare födda GABAergic interneurons som kallas korgceller och stellateceller. Dessa interneurons bor i det molekylära lagret, där de synaps på Purkinje celler och skulptera PC topografi och funktion via GABAergic hämning13</...

Lillhjärnan har länge erkänts som en stor neuronal krets samordna frivillig rörelse1. Den får indata från de breda strängarna av neuroaxis, som innehåller proprioceptive information från periferin, för att finjustera motoreffekt och samordna rörelse. På senare tid har det också varit inblandad i regleringen av kognition och känslor genom att eventuellt använda liknande nätverk för informationsbehandling2,3,4.
Den vuxna lillhjärnan består av en yttre cerebellar cortex och inre vit materia. Interspersed inom dessa strukturer är djupa intracerebellar kärnor. I likhet med resten av nervsystemet drivs utvecklingen av lillhjärnan av spridningen av multipotenta stamceller (stamceller) som migrerar och differentierar för att ge denna välorganiserade struktur. I tidig utveckling (E10.5–E13.5), en ventrikulär stam nisch runt den växande fjärde ventrikeln genererar GABAergic nervceller (dvs. Purkinje celler, Lugaro celler, Golgi celler) tillsammans med Bergmann glia5,6,7,8.
Senare i utvecklingen (postnatal vecka ett), en andra stamceller nisch i den rombiska läppen genererar MATH1- och Nestin-uttrycker förfäder som ger upphov till excitatoriska granulat nervceller9,10,11,12. Nyligen har en tredje stamcellsnisch beskrivits13. Dessa celler uttrycker prominin-1 (även känd som CD133), ett membran-spänner glykoprotein som definierar en delmängd av stamceller i tarmen och hematopoietiska system14,15,16. In vivo öde kartläggning visar att dessa stamceller genererar viktiga molekylära lager interneurons (dvs. korgceller och stellate celler), tillsammans med astrocyter, under de första tre postnatala veckorna. Tidigare har det varit svårt att studera dessa celler in vitro eftersom tidigare metoder har krävt kostsamma och tidskrävande tekniker (dvs. fluorescensaktiverad cellsortering [FACS]) som är beroende av prominin-1 färgning12,13,17. Detta protokoll beskriver en immunomagnetisk-baserad metod för isolering av dessa stamceller som sedan lätt kan odlas och differentieras.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05%Trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td>0.05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% B27</td>
			<td>Gibco; Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mM EDTA solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- Prominin-1 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biote</td>
			<td>130-092-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>culture plates ultra - low attachment</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4513-1VL</td>
			<td>250 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution-HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G507A</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G502A</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>l-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy</td>
			<td>Lieca TCS SP5 confocal microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Prominin-1</td>
			<td>Affymetrix eBioscience</td>
			<td>14-1331</td>
			<td>1 in 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab27952</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4</td>
			<td>Millopore</td>
			<td>MAB345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>(100 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet- Derived Growth Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8291</td>
			<td>10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-tubulin, b-III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2200</td>
			<td>1 in 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabit anti-GFAP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>1 in 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation columns-MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>40um</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of prominin-1+ stem cells from postnatal mouse cerebellum

De flesta cerebellar nervceller uppstår från två embryonala stam nischer: en rombisk läpp nisch, som genererar alla cerebellar excitatoriska glutamatergic nervceller, och en ventrikulär zon nisch, som genererar hämmande GABAergic Purkinje celler, som är nervceller som utgör den djupa cerebellar kärnor och Bergman glia. Nyligen har en tredje stamcellsnisch beskrivits som uppstår som en sekundär germinal zon från ventrikulära zonen nisch. Cellerna i denna nisch definieras av cellytan markör prominin-1 och är lokaliserade till den växande vita frågan av postnatala lillhjärnan. Denna nisch står för den sena födda molekylära skiktet GABAergic interneurons tillsammans med postnatally genererade cerebellar astrocyter. Förutom deras utvecklingsmässiga roll, denna nisch vinner translationell betydelse när det gäller dess engagemang i neurodegeneration och tumorigenesis. Biologin hos dessa celler har varit svår att dechiffrera på grund av brist på effektiva tekniker för deras rening. Demonstreras här är effektiva metoder för att rena, kultur och differentiera dessa postnatala cerebellar stamceller.

Prominin-1-positiva postnatala cerebellar stamceller bildade neurosfärer i neurosfären medium rik på tillväxtfaktorer (EGF och bFGF). Dessa neurosfärer var positiva för prominin-1-färgning, markören som används för isolering, och även som en fläck för andra stamceller markörer såsom Nestin och GFAP13 (Figur 1). Stamcellsmarköruttrycket bibehölls i hela kulturen och i upp till minst åtta passager20. Vid återkallande av tillvä...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum at JoVE.com

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Demonstreras här är en effektiv och kostnadseffektiv metod för att rena, odla och skilja vit materia stamceller från postnatalmus lillhjärnan.

Rening av Prominin-1+ stamceller från Postnatal Mus Cerebellum

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

Detta protokoll beskriver en enkel och kostnadseffektiv metod för att rena stamceller från postnatala lillhjärnan. Dessa stamceller står för de sent födda molekylärt förvrängda interneurons, men de står också för postnatally-härledda cerebellar astrocyter. Således är det klart viktigt att studera dessa celler för att förstå lillhjärnans utveckling.Med hjälp av detta protokoll är utbytet av stamceller jämförbar med den för FACS-baserad strategi som vanligtvis är 10 gånger dyrare. Detta protokoll kan generaliseras för att extrahera prominin-1 uttrycker stamceller från andra vävnader såsom tarm och benmärg. Börja med att placera skålen med hjärnan under ett dissekeringsmikroskop.Använd fin nummer fem tärnor för att avlägsna hjärnhinnorna och stora blodkärl från lillhjärnan, separera sedan lillhjärnan från hjärnstammen med hjälp av spateln. Överför lillhjärnan till ett centrifugrör på 15 milliliter som innehåller fem milliliter iskall HBSS-lösning. Skölj den sedan dekantera HBSS.Upprepa tvätten ytterligare två gånger. Efter den sista sköljningen, tillsätt fem milliliter papainbaserad vävnadsdissociationslösning som har förvuppvats till 37 grader Celsius. Inkubera vävnaden i 15 minuter i en 37 graders Celsius vattenbad och långsamt blanda innehållet i röret genom att invertera den tre till fem gånger var tredje minut.Förbered en bred diameter och smal diameter glas Pasteur pipett genom brand polering över en Bunsen brännare. Efter inkubationen, tvätta vävnaden tre gånger med fem milliliter HBSS-lösning se till att undvika att förlora vävnad medan dekantera. Efter den sista HBSS-tvätten, tillsätt fem milliliter DPBS med 250 mikroliter DNAse till vävnaden och separera den genom att försiktigt triturisera 10 till 15 gånger med den breda diametern Pasteur pipetter.Använd sedan den smala Pasteurpipetten för att ytterligare triturtera vävnadsslampet 10 gånger. Om större vävnadsbitar finns kvar, tryck dem mot rörets botten med pipettens spets och fortsätt pipettering tills en fin suspension uppnås. Placera centrifugrören på is.Sedan stam de dissocierade cellerna genom en 40 mikrometer cell sil i en 50 milliliter rör. Toppa filtret med 10 milliliter iskall HBSS-lösning för att säkerställa att cellerna passerar genom nätet. Överför de filtrerade cellerna till ett färskt centrifugrör på 15 milliliter och centrifug suspensionen vid 300 g i 10 minuter vid fyra grader Celsius.Använd sedan en vakuumaspirator för att ta bort supernatanten helt. Resuspend cell pelleten i 160 mikroliter av iskall magnetisk kolumn buffert. Lägg till 40 mikroliter av anti-prominin-1 mikropärlor till cellen suspension.Inkubera sedan rören i ett kylskåp i 15 minuter för att låta antikroppen binda till prominin-1 uttrycker celler. Tvätta cellerna med en till två milliliter kolumnbuffert X och centrifug dem på 300 gånger g i 10 minuter. Aspirera supernatanten och resuspend pelleten i en milliliter av kolonnbuffert X.Placera de magnetiska kolumnerna på magnetstativ och skölj dem en gång med 500 mikroliter av buffert X.Applicera den märkta cellupphängningen på kolonnen och samla in genomströmningen i färska 15 milliliterrör.Tvätta kolonnen tre gånger med 500 mikroliter av buffert X.Ta sedan bort kolumnerna från magnetfältet och placera dem i 1,5 milliliterrör. Lägg till en milliliter odlingsmedium och tryck in kolven i kolonnen för att spola ut de celler som taggats med prominin-1 pärlor. För att passage neurosfärerna, överföra dem tillsammans med odlingsmediet i en steril 15 milliliter centrifugrör.Pellet neurosfärerna genom centrifugation vid 300 gånger g i fem minuter och kassera supernatanten. Resuspend pelleten i fem milliliter av dissociation media med papain eller 0,05%trypsin lösning och inkubera cellerna i 37 grader Celsius i 10 minuter. Centrifugera cellupphängningen igen.Sedan återanvänder cellerna i fem milliliter neurosfären medium och dissociate dem genom att långsamt pipettering dem upp och ner 10 gånger med en Pasteur pipett. Plate cellerna i neurosphere media som beskrivs i text protokollet och berika dem med sekundära neurospheres efter sju till 10 dagar i kultur som tidigare beskrivits. Räkna cellerna på en hemocytometer och platta det optimala antalet celler på poly-D-lysinbelagda plattor för framtida experiment.Kolumn renas prominin-1 positiva postnatala cerebellar stamceller bildade neurospheres i tillväxtfaktor rika neurosphere medium. Dessa neurospheres var positiva för prominin-1, deras markör som används för isolering och för andra stamceller markörer såsom nestin och GFAP. Celler i flödet genom färgas negativt för stamceller markörer prominin-1 och nestin och positiva för neuronal markör beta-III tubulin.Vid återkallande av tillväxtfaktorer och i närvaro av leukemi hämmande faktor eller PDGF-AA, den prominin-1 positiva neurosfärer differentieras till nervceller, astrocyter och oligodeudocyter. När du försöker denna teknik, Det är viktigt att se till att neurosfärer skjuts igenom för prominin-1 antikropp och de kan passaged eftersom normala celler tenderar också att bilda klumpar som kan se ut som neurosfärer. Med hjälp av denna isolering metod, kan man karakterisera dess derivat härstamningar som nervceller och glia i hälsa och sjukdomstillstånd.Denna metod är värdefull och ger ny insikt i cerebellarstamcellernas roll i cerebellärutveckling och sjukdomstillstånd som spinocerebellar ataxi och cancer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering och odling av neurallistceller från embryonala Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Isolering av Distinkta cellpopulationer från utvecklings Cerebellum från Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Rening av Mouse Brain Fartyg

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolering och kultur av vuxna neurala stamceller från mus Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Homochronic Transplantation av Interneuron prekursorer i tidig Postnatal mus hjärnor

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Isolering och kultur av embryonala mus neurala stamceller

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Transplantation av Chemogenetiskt konstruerade kortikala Interneuron progenitorer till tidiga postnatal mus hjärnor

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Primär kultur av neuroner isolerade från embryonala mus cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1ÃƒÂ¢Ã‹â€ '3 Mouse Neurogenic Niches

Isolering och expansion av neurosfärer från Postnatala (P1−3) Mus neurogena nischer

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Neuronal differentiering från mus embryonala stamceller in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...