Name: purification of prominin-1+ stem cells from postnatal mouse cerebellum
Uploaded: 2020-04-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum at JoVE.com

Opal laboratuvar üyelerine önerileri için teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH hibe tarafından desteklendi 1RO1 NS062051 ve 1RO1NS08251 (Opal P)

Tüm hayvan deneyleri NIH'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi 'ne (2011) uygun olarak gerçekleştirildi ve Northwestern Üniversitesi IACUC (Protokol IS00011368) tarafından onaylandı.
1. Çözümlerin Hazırlanması
<ol><li>Steril fenol kırmızısı içeren Dulbecco fosfat tamponlu salin (DPBS) papain (100 U/ml), sistein (0.2 mg/ml) ve DNase (250 U/ml) ile yapılan doku dissosinasyon çözeltisi hazırlayın.</li>
	<li>DNase çözeltisi hazırlamak için 100 m...

<ol>
	<li>Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellum:+history.">Cerebellum: history.</a> Neuroscience. 162, 549-559 (2009).</li><li>Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+modulation+of+the+reward+circuitry+and+social+behavior.">Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior.</a> Science. 363, (2019).</li><li>Sathyanesan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+connections+between+cerebellar+development,+behaviour+and+complex+brain+disorders.">Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 20, 298-313 (2019).</li><li>Wagner, M. J., Kim, T. H., Savall, J., Schnitzer, M. J., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+granule+cells+encode+the+expectation+of+reward.">Cerebellar granule cells encode the expectation of reward.</a> Nature. 544, 96-100 (2017).</li><li>Araujo, A. P. B., Carpi-Santos, R., Gomes, F. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Astrocytes+in+the+Development+of+the+Cerebellum.">The Role of Astrocytes in the Development of the Cerebellum.</a> Cerebellum. , (2019).</li><li>Seto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+identity+transition+from+Purkinje+cell+progenitors+to+GABAergic+interneuron+progenitors+in+the+cerebellum.">Temporal identity transition from Purkinje cell progenitors to GABAergic interneuron progenitors in the cerebellum.</a> Nature Communication. 5, 3337 (2014).</li><li>Marzban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+commitment+in+the+developing+cerebellum.">Cellular commitment in the developing cerebellum.</a> Frontiers in Cell Neurosciences. 8, 450 (2014).</li><li>Koziol, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+paper:+the+cerebellum's+role+in+movement+and+cognition.">Consensus paper: the cerebellum's role in movement and cognition.</a> Cerebellum. 13, 151-177 (2014).</li><li>Ben-Arie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+essential+for+genesis+of+cerebellar+granule+neurons.">Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons.</a> Nature. 390, 169-172 (1997).</li><li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors.">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48, 17-24 (2005).</li><li>Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+expression+redefines+the+rhombic+lip+derivatives+and+reveals+novel+lineages+within+the+brainstem+and+cerebellum.">Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum.</a> Neuron. 48, 31-43 (2005).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+population+of+Nestin-expressing+progenitors+in+the+cerebellum+exhibits+increased+tumorigenicity.">A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity.</a> Nature Neurosciences. 16, 1737-1744 (2013).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum.">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nature Neurosciences. 8, 723-729 (2005).</li><li>Toren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133-positive+hematopoietic+stem+cell+"stemness"+genes+contain+many+genes+mutated+or+abnormally+expressed+in+leukemia.">CD133-positive hematopoietic stem cell "stemness" genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia.</a> Stem Cells. 23, 1142-1153 (2005).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prominin+1+marks+intestinal+stem+cells+that+are+susceptible+to+neoplastic+transformation.">Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation.</a> Nature. 457, 603-607 (2009).</li><li>Man, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Role+for+the+DNA+Sensor+AIM2+in+Stem+Cell+Proliferation+and+Cancer.">Critical Role for the DNA Sensor AIM2 in Stem Cell Proliferation and Cancer.</a> Cell. 162, 45-58 (2015).</li><li>Fleming, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Purkinje+neuron+acts+as+a+central+regulator+of+spatially+and+functionally+distinct+cerebellar+precursors.">The Purkinje neuron acts as a central regulator of spatially and functionally distinct cerebellar precursors.</a> Developmental Cell. 27, 278-292 (2013).</li><li>Panchision, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+flow+cytometric+analysis+of+central+nervous+system+tissue+reveals+novel+functional+relationships+among+cells+expressing+CD133,+CD15,+and+CD24.">Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24.</a> Stem Cells. 25, 1560-1570 (2007).</li><li>Beaudoin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+pyramidal+neurons+from+the+early+postnatal+mouse+hippocampus+and+cortex.">Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex.</a> Nature Protocols. 7, 1741-1754 (2012).</li><li>Edamakanti, C. R., Do, J., Didonna, A., Martina, M., Opal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+ataxin1+disrupts+cerebellar+development+in+spinocerebellar+ataxia+type+1.">Mutant ataxin1 disrupts cerebellar development in spinocerebellar ataxia type 1.</a> Journal of Clinical Investigation. 128, 2252-2265 (2018).</li><li>Erlandsson, A., Enarsson, M., Forsberg-Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immature+neurons+from+CNS+stem+cells+proliferate+in+response+to+platelet-derived+growth+factor.">Immature neurons from CNS stem cells proliferate in response to platelet-derived growth factor.</a> Journal of Neurosciences. 21, 3483-3491 (2001).</li><li>Galli, R., Pagano, S. F., Gritti, A., Vescovi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuronal+differentiation+in+human+CNS+stem+cell+progeny+by+leukemia+inhibitory+factor.">Regulation of neuronal differentiation in human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor.</a> Developmental Neurosciences. 22, 86-95 (2000).</li><li>Silbereis, J., Cheng, E., Ganat, Y. M., Ment, L. R., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursors+with+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+Promoter+Activity+Transiently+Generate+GABA+Interneurons+in+the+Postnatal+Cerebellum.">Precursors with Glial Fibrillary Acidic Protein Promoter Activity Transiently Generate GABA Interneurons in the Postnatal Cerebellum.</a> Stem Cells. 27, 1152-1163 (2009).</li><li>Parmigiani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+Bipotency+of+Astroglial-Like+Cerebellar+Progenitors+along+the+Interneuron+and+Glial+Lineages.">Heterogeneity and Bipotency of Astroglial-Like Cerebellar Progenitors along the Interneuron and Glial Lineages.</a> Journal of Neurosciences. 35, 7388-7402 (2015).</li><li>Wojcinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+granule+cell+replenishment+postinjury+by+adaptive+reprogramming+of+Nestin(+)+progenitors.">Cerebellar granule cell replenishment postinjury by adaptive reprogramming of Nestin(+) progenitors.</a> Nature Neurosciences. 20, 1361-1370 (2017).</li><li>Yang, Z., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP1+is+involved+in+replenishment+of+granule+cell+precursors+following+injury+to+the+neonatal+cerebellum.">YAP1 is involved in replenishment of granule cell precursors following injury to the neonatal cerebellum.</a> Developmental Biology. 1606 (19), 30207 (2019).</li><li>Wang, S. S., Kloth, A. D., Badura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebellum,+sensitive+periods,+and+autism.">The cerebellum, sensitive periods, and autism.</a> Neuron. 83, 518-532 (2014).</li><li>Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+down+and+one+to+go:+modeling+medulloblastoma+subgroups.">Three down and one to go: modeling medulloblastoma subgroups.</a> Cancer Cell. 21, 137-138 (2012).</li><li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+is+a+positive+marker+for+a+distinct+class+of+primitive+human+cord+blood-derived+CD34-negative+hematopoietic+stem+cells.">CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells.</a> Leukemia. 28, 1308-1315 (2014).</li></ol>

Prominin-1-ifade serebellar kök hücreler postnatal yaşamın ilk 3 haftasında prospektif beyaz maddede bulunur. Onların çoğalması sıkıca Purkinje hücreleri tarafından desteklenen sonik kirpi yolu tarafından kontrol edilir17. Bu kök hücre / ataları sepet hücreleri ve stellat hücreleri olarak adlandırılan daha sonra doğan GABAerjik interneurons katkıda bulunur. Bu internöronlar moleküler tabakada ikamet, Onlar Purkinje hücreleri üzerine sinaps ve HEYKEL PC topografyası ve G...

Serebellum uzun gönüllü hareket koordine önemli bir nöronal devre olarak kabul edilmiştir1. Motor çıktısını ince ayarlayabilmek ve hareketi koordine etmek için çevreden proprioseptif bilgi içeren nöroaksinin geniş alanlarından giriş alır. Daha yakın zamanda, aynı zamanda potansiyel olarak benzer,bilgi işleme ağları2,3,4kullanarak biliş ve duyguların düzenlenmesinde karıştığı olmuştur.
Erişkin serebellum bir dış serebellar korteks ve iç beyaz madde oluşur. Bu yapıların içinde serpiştirilmiş derin intracerebellar çekirdekleri vardır. Sinir sisteminin geri kalanına benzer şekilde, beyincik gelişimi göç ve bu iyi organize yapı verim farklılaştırmak multipotent progenitor hücrelerinin (kök hücreler) çoğalması tarafından tahrik edilir. Erken gelişimde (E10.5–E13.5), gelişmekte olan dördüncü ventrikül etrafında bir ventriküler kök niş GABAerjik nöronlar üretir (yani, Purkinje hücreleri, Lugaro hücreleri, Golgi hücreleri) Bergmann gliailebirlikte 5,6,7,8.
Daha sonra geliştirme (doğum sonrası hafta bir), eşkenar dudak ikinci bir kök hücre niş MATEMATİk üretir- ve Nestin ifade ataları uyarıcı granül nöronlar 9,9,10,11,12. Son zamanlarda üçüncü bir kök hücre niş tarif edilmiştir13. Bu hücreler prominin-1 (CD133 olarak da bilinir), bağırsak ve hematopoetik sistemlerde kök hücrelerin bir alt kümesi tanımlayan bir membran yayılan glikoprotein14,15,16ifade . In vivo kader haritalama bu kök hücrelerin ilk üç doğum sonrası hafta boyunca, astrositler ile birlikte anahtar moleküler tabaka internöronlar (yani, sepet hücreleri ve stellat hücreleri) oluşturmak gösterir. Geçmişte, önceki yöntemler prominin-1 boyama12,13,,17bağımlı pahalı ve zaman alıcı teknikler (yani, floresan-aktive hücre sıralama [FACS]) gerekli olduğu için bu hücreleri in vitro çalışmak zor olmuştur. Bu protokol, bu kök hücrelerin izolasyonu için daha sonra kolayca kültürlenebilir ve ayırt edilebilir bir immünomanyetik tabanlı yöntemi açıklar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05%Trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td>0.05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% B27</td>
			<td>Gibco; Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mM EDTA solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- Prominin-1 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biote</td>
			<td>130-092-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>culture plates ultra - low attachment</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4513-1VL</td>
			<td>250 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution-HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G507A</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G502A</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>l-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy</td>
			<td>Lieca TCS SP5 confocal microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Prominin-1</td>
			<td>Affymetrix eBioscience</td>
			<td>14-1331</td>
			<td>1 in 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab27952</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4</td>
			<td>Millopore</td>
			<td>MAB345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>(100 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet- Derived Growth Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8291</td>
			<td>10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-tubulin, b-III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2200</td>
			<td>1 in 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabit anti-GFAP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>1 in 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation columns-MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>40um</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of prominin-1+ stem cells from postnatal mouse cerebellum

En serebellar nöronlar iki embriyonik kök nişler ortaya çıkar: bir eşkenar dudak niş, tüm serebellar uyarıcı glutamaterjik nöronlar oluşturur, ve ventriküler zon niş, hangi inhibitör GABAerjik Purkinje hücreleri oluşturur, hangi derin serebellar çekirdekleri ve Bergman glia oluşturan nöronlar vardır. Son zamanlarda, üçüncü bir kök hücre niş ventriküler bölge niş ikincil bir germinal bölge olarak ortaya çıkar tarif edilmiştir. Bu nişin hücreleri hücre yüzeyi belirteci prominin-1 ile tanımlanır ve postnatal serebellumun gelişen beyaz maddesine lokalize edilir. Bu niş postnatal olarak üretilen serebellar astrositler ile birlikte geç doğan moleküler tabaka GABAerjik internöronlar için hesaplar. Gelişimsel rollerine ek olarak, bu niş nörodejenerasyon ve tümörigenezde rol alması açısından çevirisel önem kazanmaktadır. Bu hücrelerin biyolojisi, arınma için etkili tekniklerin eksikliği nedeniyle deşifre etmek zor olmuştur. Burada gösterildiği gibi bu postnatal serebellar kök hücreleri arındırmak, kültür ve ayırt etmek için etkili yöntemler vardır.

Prominin-1-pozitif postnatal serebellar kök hücreler nörosferlerde büyüme faktörleri açısından zengin nörosferler oluşturdular (EGF ve bFGF). Bu nörosferler prominin-1-boyama için pozitif, izolasyon için kullanılan belirteç, ve aynı zamanda Nestin ve GFAP13 gibi diğer kök hücre belirteçleri için bir leke olarak(Şekil 1). Kök hücre işaretleyici ekspresyonu kültür boyunca ve en az sekiz pasaj20kadar muhafaza edildi. B?...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum at JoVE.com

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Burada gösterilen, postnatal fare beyincik beyaz madde kök hücreleri arındırmak, kültür ve ayırt etmek için etkili ve uygun maliyetli bir yöntemdir.

Postnatal Fare Serebellum prominin-1+ Kök Hücrelerin Safifikasyon

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

Bu protokol, postnatal serebellumkök hücreleri arındırmak için kolay ve uygun maliyetli bir yöntem açıklar. Bu kök hücreler geç doğan moleküler olarak bozuk internöronları oluştururlar, ama aynı zamanda postnatal kaynaklı serebellar astrositleri de oluştururlar. Bu nedenle, bu hücrelerin incelenmesi açıkça beyincik gelişimini anlamak için önemlidir.Bu protokolü kullanarak, kök hücre verimi genellikle 10 kat daha pahalı FACS tabanlı strateji ile karşılaştırılabilir. Bu protokol bağırsak ve kemik iliği gibi diğer dokulardan prominin-1 ifade kök hücreleri ayıklamak için genelleştirilmiş olabilir. Bir diseksiyon mikroskobu altında beyin ile çanak yerleştirerek başlayın.Serebellum menenjler ve büyük kan damarları kaldırmak için ince sayı beş forceps kullanın, sonra spatula kullanarak beyin sapından beyincik ayırmak. Serebellum buz gibi HBSS çözeltisi beş mililitre içeren 15 mililitrelik santrifüj tüp içine aktarın. Durulayın sonra HBSS decant.Yıkamayı iki kez daha tekrarlayın. Son durulama dan sonra, 37 santigrat derece önceden ısıtılmış olan papain bazlı doku dissosifikasyon çözeltisi beş mililitre ekleyin. 37 derece santigrat su banyosunda 15 dakika boyunca doku kuluçka ve yavaş yavaş her üç dakikada üç kez ters çevirerek tüp içeriğini karıştırın.Bir Bunsen brülör üzerinde yangın parlatma tarafından geniş çaplı ve dar çaplı cam Pasteur pipet hazırlayın. Kuluçkadan sonra, dekanting sırasında doku kaybetmemek için emin olmak için HBSS çözeltisi beş mililitre ile doku üç kez yıkayın. Son HBSS yıkamadan sonra, dokuya 250 mikrolitre NAAse ile beş mililitre DPBS ekleyin ve geniş çaplı Pasteur pipetiyle 10 ila 15 kez hafifçe üçe tekse ile ayırın.Daha sonra doku bulamacını 10 kez daha fazla triturate için dar Pasteur pipet kullanın. Daha büyük doku parçaları kalırsa, pipet ucuyla tüpün dibine bastırın ve ince bir süspansiyon elde edilene kadar pipetleme devam edin. Santrifüj tüplerini buzüzerine yerleştirin.Sonra 50 mililitrelik bir tüp içine 40 mikrometre hücresüz ile ayrıştırılmış hücreleri süzün. Hücrelerin örgüden geçmesini sağlamak için 10 mililitre buz gibi HBSS çözeltisi ile filtreyi toplayın. Filtrelenmiş hücreleri taze 15 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın ve süspansiyonu 300 kez g'de 10 dakika boyunca 4 santigrat derecede santrifüj edin.Sonra tamamen supernatant kaldırmak için bir vakum aspiratör kullanın. 160 mikrolitre buz gibi manyetik kolon tamponunda hücre peletini yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonuna 40 mikrolitre anti-prominin-1 mikroboncuk ekleyin.Daha sonra tüpleri 15 dakika buzdolabında kuluçkaya yatırArak antikorun prominin-1 ifade eden hücrelere bağlanmasını bekleyin. Hücreleri 1-2 mililitre lik kolon arabelleği X ile yıkayın ve 300 kez g'de 10 dakika santrifüj edin. Supernatant aspirate ve sütun tampon X.Place manyetik sütunlar bir mililitre içinde pelet resuspend manyetik standı üzerinde manyetik sütunlar yerleştirin ve tampon X.100 mikrolitre ile bir kez durulayın sütun üzerine etiketli hücre süspansiyon uygulayın ve taze 15 mililitre tüpler üzerinden akış toplamak.Sütunu 500 mikrolitre tampon X ile üç kez yıkayın.Sonra sütunları manyetik alandan çıkarın ve 1,5 mililitrelik tüplere yerleştirin. Bir mililitre kültür ortamı ekleyin ve prominin-1 boncuklarla etiketlenmiş hücreleri temizlemek için pistonu sütuna itin. Nörosferleri geçiş için, steril bir 15 mililitre santrifüj tüp içine kültür ortamı ile birlikte aktarın.5 dakika boyunca 300 kez g santrifüj ile nörosferler Pelet ve supernatant atın. Papain veya %0.05 tripsin çözeltisi ile beş mililitre ayrışma mediasında peleti yeniden askıya alın ve hücreleri 37 derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Hücre süspansiyonuna tekrar santrifüj edin.Sonra nörosfer orta beş mililitre hücreleri yeniden askıya ve yavaş yavaş bir Pasteur pipet ile 10 kez yukarı ve aşağı boru ile onları ayrıştırın. Metin protokolünde açıklandığı gibi nörosfer medyahücreleri plaka ve daha önce açıklandığı gibi kültür yedi ila 10 gün sonra ikincil nörosferler ile zenginleştirmek. Hücreleri hemositometrede sayın ve gelecekteki deneyler için poli-D-lizin kaplı plakalar üzerindeki en uygun sayıda hücreyi plakalayın.Kolon saflaştırılmış prominin-1 pozitif postnatal serebellar kök hücreler büyüme faktörü zengin nörosfer orta nörosferler oluşturdu. Bu nörosferler prominin-1, izolasyon için kullanılan belirteçleri ve nestin ve GFAP gibi diğer kök hücre belirteçleri için pozitifti. Kök hücre belirteçleri prominin-1 ve nestin ve nöronal marker beta-III tubulin için pozitif için lekeli negatif yoluyla akış hücreleri.Büyüme faktörlerinin geri çekilmesi üzerine ve lösemi inhibitör faktörü veya PDGF-AA varlığında, prominin-1 pozitif nörosferler nöronlar, astrositler ve oligodendrositler farklılaşmış. Bu tekniği denerken, nörosferlerin prominin-1 antikor için itildiğinden emin olmak önemlidir ve normal hücreler de nörosferler gibi görünebilir kümeler oluşturmak eğilimindedir, çünkü onlar geçit edilebilir. Bu izolasyon yöntemini kullanarak, bir sağlık ve hastalık durumunda nöronlar ve glia gibi türev soy karakterize edebilirsiniz.Bu yöntem değerlidir ve serebellar gelişim ve spinocerebellar ataksi ve kanser gibi hastalık koşullarında serebellar kök hücrelerin rolü ne yeni bir fikir sağlar.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Mikrodisseksiyon tarafından Gelişmekte Serebellumunda farklı olarak hücre popülasyonlarının İzolasyonu

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Fare Beyin Gemiler saflaştırılması

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Fare Subcallosal Zone İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kök Hücre Kültürü

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Erken Postnatal fare beyin içine Interneuron öncüleri Homochronic nakli

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Yalıtım ve kültür embriyonik fare nöral kök hücrelerin

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Erken Doğum Sonrası Fare Beyinlerine Kemogenetik Mühendislik Kortikal İnkornöron Progenitorlarının Nakli

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Embriyonik Fare Beyincisinden İzole Edilen Nöronların Birincil Kültürü

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1ÃƒÂ¢Ã‹â€ '3 Mouse Neurogenic Niches

Postnatal (P1−3) Fare Nörojenik Nişlerden Nörosferlerin İzolasyon ve Genişlemesi

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Fare Embriyonik Kök Hücre in vitro nöronal farklılaşma

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...