Name: use of the pyrimidine analog, 5-iodo-2&prime;-deoxyuridine (idu) with cell cycle markers to establish cell cycle phases in a mass cytometry platform
Uploaded: 2021-10-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2Ã¢â‚¬Â²-Deoxyuridine IdU with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform at JoVE.com

يود المؤلفون أن يشكروا جهود بالاك صخري وحسام الخلايلة وهسياوتشي تشانغ وجوستين ليبرغر على دعمهم التجريبي. تم دعم هذا العمل من قبل برنامج زمالة بيلوتونيا. أي آراء ونتائج واستنتاجات يتم التعبير عنها في هذه المادة هي آراء المؤلف (المؤلفين) ولا تعكس بالضرورة آراء برنامج زمالة بيلوتونيا ".

1. إعداد مخزونات IdU
<ol><li>قم بإذابة 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU) في DMSO بتركيز 50 mM. مرشح معقم ، قسمة في أنابيب 10-50 ميكرولتر ، وتخزينها في -80 درجة مئوية</li>
	<li>أخرج IdU من الفريزر ، وقم بإذابة الثلج في درجة حرارة الغرفة. قم بتخفيف IdU في RPMI-1640 لعمل حل عملي بتركيز نهائي قدره 1 mM. ماصة صعودا وهبوطا أو دوامة لخلط.<ol><li>عا?...

<ol>
	<li>Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+cellular+antigen+detection+by+ICP-MS.">Multiple cellular antigen detection by ICP-MS.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).</li><li>Ornatsky, O. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+cell+antigens+and+intracellular+DNA+by+identification+of+element-containing+labels+and+metallointercalators+using+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry.">Study of cell antigens and intracellular DNA by identification of element-containing labels and metallointercalators using inductively coupled plasma mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 80 (7), 2539-2547 (2008).</li><li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle.">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).</li><li>Raval, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversibility+of+Defective+Hematopoiesis+Caused+by+Telomere+Shortening+in+Telomerase+Knockout+Mice.">Reversibility of Defective Hematopoiesis Caused by Telomere Shortening in Telomerase Knockout Mice.</a> PLoS One. 10 (7), 0131722 (2015).</li><li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Cytometric+Functional+Profiling+of+Acute+Myeloid+Leukemia+Defines+Cell-Cycle+and+Immunophenotypic+Properties+That+Correlate+with+Known+Responses+to+Therapy.">Mass Cytometric Functional Profiling of Acute Myeloid Leukemia Defines Cell-Cycle and Immunophenotypic Properties That Correlate with Known Responses to Therapy.</a> Cancer Discovery. 5 (9), 988-1003 (2015).</li><li>Kimmey, S. C., Borges, L., Baskar, R., Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+analysis+of+tri-molecular+biosynthesis+with+cell+identity+and+function+in+single+cells.">Parallel analysis of tri-molecular biosynthesis with cell identity and function in single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1185 (2019).</li><li>Rabinovitch, P. S., Kubbies, M., Chen, Y. C., Schindler, D., Hoehn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU-Hoechst+flow+cytometry:+a+unique+tool+for+quantitative+cell+cycle+analysis.">BrdU-Hoechst flow cytometry: a unique tool for quantitative cell cycle analysis.</a> Experimental Cell Research. 174 (2), 309-318 (1988).</li><li>Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin+reduces+nonspecific+eosinophil+staining+artifacts+in+mass+cytometry+experiments.">Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments.</a> Cytometry A. 89 (6), 601-607 (2016).</li><li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis.">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e54394 (2017).</li><li>Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+by+Mass+Cytometry.">Immunophenotyping by Mass Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 2032, 31-51 (2019).</li><li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer.">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4398 (2012).</li><li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).</li><li>Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Web-based+analysis+and+publication+of+flow+cytometry+experiments.">Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments.</a> Current Protocols in Cytometry. , 17 (2010).</li><li>Devine, R. D., Sekhri, P., Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+storage+time+and+temperature+on+cell+cycle+analysis+by+mass+cytometry.">Effect of storage time and temperature on cell cycle analysis by mass cytometry.</a> Cytometry A. 93 (11), 1141-1149 (2018).</li><li>Campos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+immunological+markers+on+leukemic+cells+before+and+after+cryopreservation+and+thawing.">Expression of immunological markers on leukemic cells before and after cryopreservation and thawing.</a> Cryobiology. 25 (1), 18-22 (1988).</li><li>Kadic, E., Moniz, R. J., Huo, Y., Chi, A., Kariv, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cryopreservation+on+delineation+of+immune+cell+subpopulations+in+tumor+specimens+as+determinated+by+multiparametric+single+cell+mass+cytometry+analysis.">Effect of cryopreservation on delineation of immune cell subpopulations in tumor specimens as determinated by multiparametric single cell mass cytometry analysis.</a> BMC Immunology. 18 (1), 6 (2017).</li><li>Shabihkhani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+procurement,+storage,+and+quality+assurance+of+frozen+blood+and+tissue+biospecimens+in+pathology,+biorepository,+and+biobank+settings.">The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings.</a> Clinical Biochemistry. 47 (4-5), 258-266 (2014).</li></ol>

توضح الأمثلة المقدمة هنا كيفية استخدام منصة MCM لتحليل توزيع دورة الخلية. وقد ثبت أيضا أن تحليل دورة الخلية حساس للظروف التجريبية مثل الوقت ودرجة الحرارة ، وهو اعتبار مهم يجب على الباحثين اتخاذه عند التفكير في MCM لتحليل دورة الخلية14. العينات التي تترك في التخزين لفترة قصيرة من ?...

يتيح قياس الكتلة الخلوي الكشف عن ما يقرب من 40 معلمة من خلال الاستفادة من الدقة العالية والطبيعة الكمية لتحليل الطيف الكتلي. تستخدم الأجسام المضادة ذات العلامات المعدنية بدلا من الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور التي تسمح بعدد أكبر من القنوات وتنتج الحد الأدنى من التداعيات 1,2. MCM له مزايا وعيوب فيما يتعلق بتحليل دورة الخلية مقارنة بقياس التدفق الخلوي. تتمثل إحدى المزايا الرئيسية ل MCM في أن العدد الكبير من المعلمات يتيح القياس المتزامن لحالة دورة الخلية عبر عدد كبير من أنواع الخلايا التائية المتميزة المناعية في عينات غير متجانسة للغاية. تم استخدام MCM بنجاح لقياس حالة دورة الخلية أثناء تكون الدم الطبيعي في نخاع العظمالبشري 3 ونماذج الفئران المعدلة وراثيا لنقص التيلوميراز4. أظهر تحليل حالة دورة الخلية في ابيضاض الدم النخاعي الحاد (AML) أن دورة الخلية مرتبطة بالاستجابات المعروفة للعلاجات السريرية ، مما يوفر نظرة ثاقبة في الجسم الحي للخصائص الوظيفية التي يمكن أن تفيد اختيارات العلاج5. الميزة الثانية لتحليل دورة الخلية الخلوية الجماعية هي القدرة على قياس عدد كبير من العلامات الوظيفية الأخرى التي قد تكون مرتبطة بحالة دورة الخلية. تمكنت الأعمال الحديثة من ربط تخليق البروتين والحمض النووي الريبي بحالة دورة الخلية من خلال استخدام IdU والأجسام المضادة الموسومة بالمعدن إلى BRU و rRNA6. هذا النوع من التحليل البارامتري للغاية الذي يقيس حالة دورة الخلية عبر العديد من المجموعات السكانية في سلسلة متصلة من التمايز سيكون شبه مستحيل مع تقنية قياس التدفق الخلوي الحالية. العيب الرئيسي ل MCM هو عدم وجود بقع الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي مماثلة لتلك المستخدمة في قياس التدفق الخلوي الفلوري (على سبيل المثال ، DAPI ، Hoechst ، Pyronin Y ، إلخ). يمكن أن تعطي الأصباغ الفلورية قياسات دقيقة نسبيا لمحتوى الحمض النووي والحمض النووي الريبي ، ولكن هذه الدقة ممكنة فقط بسبب التغيرات في خصائص الفلورسنت لهذه الأصباغ التي تحدث عند الإقحام بين قواعد النيوكليوتيدات. وبالتالي فإن تحليل MCM غير قادر على قياس محتوى الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي بدقة مماثلة. بدلا من ذلك ، يعتمد تحليل دورة الخلية الخلوية الجماعية على قياسات البروتينات المتعلقة بحالة دورة الخلية مثل سيكلين B1 ، وبروتين الورم الأرومي الشبكي المفسفر (pRb) ، وهيستون H3 المفسفر (pHH3) جنبا إلى جنب مع القياس المباشر لذرة اليود من دمج IdU في خلايا المرحلة S. ينتج عن هذين النهجين للقياس نتائج متشابهة للغاية أثناء الانتشار الخلوي الطبيعي ، ولكن يمكن أن يكونا متنافرين عندما يتعطل تقدم دورة الخلية.
يعد قياس عدد الخلايا في كل مرحلة من مراحل دورة الخلية أمرا مهما في فهم تطور دورة الخلية الطبيعية وكذلك اضطراب دورة الخلية ، والذي يلاحظ بشكل شائع في السرطانات والأمراض المناعية. يوفر MCM قياسا موثوقا للعوامل خارج الخلية وداخل الخلايا باستخدام الأجسام المضادة الموسومة بالمعادن. ومع ذلك ، كان قياس المرحلة S محدودا لأن مقحم الحمض النووي القائم على الإيريديوم لم يكن قادرا على التمييز بين الحمض النووي 2N و 4N. من أجل تحديد مراحل دورة الخلية ، طور بهبهاني طريقة تستخدم IdU بكتلة 127 ، والتي تقع ضمن نطاق مقياس الكتلة الخلوية وتسمح بالقياس المباشر للخلايا في المرحلةS 3. يتحايل هذا القياس المباشر على الحاجة إلى الأجسام المضادة الثانوية أو استخدام عوامل تغيير طبيعة الحمض النووي مثل الحمض أو DNase. بالاقتران مع علامات ركوب الدراجات داخل الخلايا ، فإنه يسمح بدقة عالية لتوزيع دورة الخلية في النماذج التجريبية.
يتكيف هذا البروتوكول مع قياسات دورة الخلية من بروتوكولات قياس التدفق الخلوي الشائعة ل MCM. توفر أساليبنا طريقة مريحة وبسيطة لتضمين معلمات دورة الخلية. يتطلب دمج IdU للعينات في المختبر من 10 إلى 15 دقيقة فقط من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، وهو أقصر من معظم بروتوكولات تلطيخ BrdU التي توصي بأوقات حضانة لعدة ساعات 3,7. يمكن تثبيت العينات المدمجة IdU و BrdU باستخدام مثبت بروتيني ثم تخزينها لبعض الوقت في مجمد -80 درجة مئوية. وهذا يسمح بأرشفة أعداد كبيرة من العينات الملطخة ب IdU لتحليل الدفعات دون تقليل جودة العينة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3059</td>
			<td>Component of CSM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td>Sample centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved-PARP (D214)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>F21-852</td>
			<td>Identification of apoptotic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclin B1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>GNS-1</td>
			<td>G2 Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Cryopreservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQ Four Element Calibration Beads</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201078</td>
			<td>Internal metal standard for CyTOF performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Tube w/ mesh strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td>Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Cell culture growth supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helios</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td>CyTOF System/Platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393</td>
			<td>Staining additive to prevent non-specific staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IdU (5-Iodo-2&#8242;-deoxyuridine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7125</td>
			<td>Incorporates in S-phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki-67</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>SolA15</td>
			<td>Confirmation of G0/G1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxPar Multi Label Kit</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201300</td>
			<td>Metal labeling kit, attaches metals to antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880023</td>
			<td>Mixing samples during staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201192</td>
			<td>Cell identification during CyTOF acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-H2AX (S139)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>JBW301</td>
			<td>Detection of DNA damage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-HH3 (S28)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>HTA28</td>
			<td>M-phase Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Wash solution for cell culture and component of fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Rb (S807/811)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>J112906</td>
			<td>G0/G1 Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteomic Stabilizer</td>
			<td>SmartTube Inc</td>
			<td>PROT1</td>
			<td>Sample fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21870-076</td>
			<td>Cell culture growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC447810250</td>
			<td>Component of CSM/Antibody buffer, biocide</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the pyrimidine analog, 5-iodo-2&prime;-deoxyuridine (idu) with cell cycle markers to establish cell cycle phases in a mass cytometry platform

يعد تنظيم مرحلة دورة الخلية جانبا مهما من جوانب الانتشار الخلوي والاتزان الداخلي. يعد تعطيل الآليات التنظيمية التي تحكم دورة الخلية سمة من سمات عدد من الأمراض ، بما في ذلك السرطان. تتطلب دراسة دورة الخلية القدرة على تحديد عدد الخلايا في كل جزء من تقدم دورة الخلية وكذلك التحديد الواضح بين كل مرحلة من مراحل دورة الخلية. يوفر ظهور القياس الخلوي الشامل (MCM) إمكانات هائلة لتحليل الخلية المفردة عالية الإنتاجية من خلال القياسات المباشرة للنظائر الأولية ، كما أن تطوير طريقة لقياس حالة دورة الخلية بواسطة MCM يزيد من فائدة MCM. هنا نصف طريقة تقيس مباشرة 5-iodo-2′-deoxyuridine (IdU) ، على غرار 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) ، في نظام MCM. يوفر استخدام MCM المستند إلى IdU العديد من المزايا. أولا ، يتم دمج IdU بسرعة في الحمض النووي أثناء تخليقه ، مما يسمح بقياس موثوق للخلايا في المرحلة S مع حضانات قصيرة تصل إلى 10-15 دقيقة. ثانيا ، يتم قياس IdU دون الحاجة إلى أجسام مضادة ثانوية أو الحاجة إلى تدهور الحمض النووي. ثالثا ، يمكن دمج تلطيخ IdU بسهولة مع قياس سيكلين B1 ، وبروتين الورم الأرومي الشبكي المفسفر (pRb) ، والهستون المفسفر H3 (pHH3) ، والذي يوفر مجتمعة تحديدا واضحا لمراحل دورة الخلية الخمس. يسمح الجمع بين علامات دورة الخلية هذه مع العدد الكبير من المعلمات الممكنة مع MCM بالاندماج مع العديد من المقاييس الأخرى.

باستخدام خلايا HL-60 ونضح نخاع العظم البشري ، من الممكن إظهار كيف يمكن أن تؤثر الظروف التجريبية على توزيع دورة الخلية وتحليلها. أولا ، يجب إنشاء استراتيجية البوابة لتوضيح كيفية اشتقاق مراحل دورة الخلية. في الشكل 1 ، نعرض إنشاء البوابة المفردة ، وهو أمر مهم في فصل الحطام الخلو?...

Watch this Scientific Journal Video about Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2Ã¢â‚¬Â²-Deoxyuridine IdU with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform at JoVE.com

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²-Deoxyuridine IdU with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

يقوم هذا البروتوكول بتكييف قياسات دورة الخلية لاستخدامها في منصة قياس الخلايا الجماعية. مع قدرات متعددة المعلمات لقياس الكتلة الخلوية ، يسمح القياس المباشر لدمج اليود بتحديد الخلايا في المرحلة S بينما تتيح علامات الدورة داخل الخلايا توصيف كل حالة دورة خلية في مجموعة من الظروف التجريبية.

استخدام بيريميدين التناظري ، 5-iodo-2′-deoxyuridine (IdU) مع علامات دورة الخلية لإنشاء مراحل دورة الخلية في منصة قياس الخلايا الجماعية

The regulation of cell cycle phase is an important aspect of cellular proliferation and homeostasis. Disruption of the regulatory mechanisms governing the ...

يسمح لنا هذا البروتوكول بفحص دورة الخلية على مستوى الخلية المفردة باستخدام مقياس الكتلة الخلوية ، وهذا يتيح إجراء العديد من الأبحاث والدراسات السريرية الجديدة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي بساطتها. يضاف IdU مباشرة إلى الخلايا وليس هناك حاجة لمزيد من العلاج أو الأجسام المضادة.لقد استخدمنا هذه التقنية للتحقيق في حالة دورة الخلية في المرضى الذين يعانون من سرطان الدم النخاعي الحاد داخل حجرات الخلايا الجذعية والسلفية. وهذا يدل على أن خصائص دورة الخلية لهذه الأنواع المحددة من الخلايا قد ترتبط بالنتائج السريرية للمرضى الذين يعانون من هذه الأمراض. يمكن أن تكون هذه التقنية مفيدة لفهم خصائص نمو الخلايا السرطانية النادرة وفهم تكاثر المجموعات الفرعية للخلايا المناعية.قبل وبعد إضافة IdU إلى عينات الخلايا ، حافظ على الخلايا في ظروف النمو ذات الأهمية. في هذه الحالة ، حاضنة مرطبة 37 درجة مئوية عند 5٪ CO2 لتسمية الخلايا ب IdU ، تمييع محلول مخزون IdU المركز من واحد إلى 50 في وسائط نمو الخلايا. ثم انقل العينات إلى غطاء للسلامة الحيوية وأضف 10 ميكرولتر من وحدة IdU المليمولية الواحدة إلى كل ملليلتر واحد من الخلايا.أعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة 10 إلى 15 دقيقة قبل نقل العينات إلى أنابيب مخروطية فردية. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في أنابيب مخروطية 15 ملليلتر وإعادة تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من PBS لكل أنبوب. إذا لزم الأمر ، قم بتسمية الخلايا ببقعة حية / ميتة مناسبة لتمييز الخلايا الميتة.بعد البقعة الحية / الميتة ، قم بإخماد الخلايا بوسائط مغسولة ب CSM قبل تثبيت الخلايا ب 25 ميكرولترا من 16٪ بارافورمالدهيد. بعد حضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أضف خمسة إلى 15 ملليلتر من CSM وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى.أعد تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من وسط تلطيخ الخلايا المكمل ب 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد. ثم انقل الخلايا إلى أنابيب أصغر لتخزينها في سالب 80 درجة سلزية. لتطبيع تحليل دورة الخلية الخاصة بهم ، قم باستيراد الملفات إلى برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي المناسب وإنشاء مخطط ثنائي المحور لطول الحدث مقابل 191 إيريديوم.ستشكل الخلايا عددا كبيرا من الإيريديوم الساطع. قم بتغيير مقياس طول الحدث لجعل الخلايا تبدو أكثر بروزا. ثم قم بإنشاء بوابة مفردة لاستبعاد 50 إلى 60٪ من الثنائيات والحطام وقم بتعيين المعلمات الغاوسية المتبقية والإزاحة لإزالة أي ثنائيات وحطام متبقية.لتعيين بوابة المرحلة S، قم بإنشاء مخطط ثنائي المحور ل IdU مقابل علامة انتشار. ستشكل الخلايا الإيجابية IdU في المرحلة S مجموعة متميزة. بالنسبة إلى بوابات G0 / G1 و G2 / M ، قم بإنشاء البوابات على قطعة أرض IdU مقابل Cyclin B1.ستكون المرحلة G0 / G1 منخفضة Cyclin B1 ، و IdU سلبية ، وستكون مرحلة G2 / M عالية Cyclin B1 ، و IdU سلبية. لبوابة لأنواع معينة من الخلايا ، ارسم فقط خلايا الطور S على الرسم البياني Cyclin B1 مقابل IdU للمساعدة في إنشاء الفصل بين خلايا المرحلة G0 / G1 وخلايا الطور G2 / M. ارسم بوابة حول ارتفاع عدد السكان في Cyclin B1.في بعض الحالات ، قد يكون من الصعب تمييز ذلك ، لكن مستوى Cyclin B1 لأعلى 5٪ تقريبا من سكان المرحلة S هو عادة نقطة التوقف بين بوابات المرحلة G0 / G1 و G2 / M. ستكون الخلايا الموجودة داخل البوابة السابقة هي مجموعة الطور G2 / M ، بينما ستكون الخلايا المتبقية هي مجموعة الطور G0 / G1. لتحديد مجموعة المرحلة G0 ، قم بإنشاء بروتين الورم الأرومي الشبكي المفسفر مقابل مخطط IdU.سيتم تمثيل المرحلة G0 ببروتين الورم الأرومي الشبكي المفسفر المنخفض ، والسكان السالبون IdU. نظرا لأن السكان النشطين لركوب الدراجات سيظهرون بروتين الورم الأرومي الشبكي عالي الفسفرة ودمج IdU ، يمكن رسم بوابة المرحلة G0 على هذه الحدود لأنها تعبر عادة عن مجموعتين متميزتين. إذا كان من الصعب تحديد بوابة G0 ، فاجعل سكان المرحلة S هم السكان النشطون وارسم بوابة تضم أعلى 90 إلى 100٪ من بروتين الورم الأرومي الشبكي المفسفر.عادة ما يكون بروتين الورم الأرومي الشبكي المفسفر المنخفض خارج البوابة هو عدد G0 ، في حين أن خلايا G0 / G1 ذات مستويات pRb التي تقع في هذه البوابة هي خلايا G1. بالنسبة للبوابات ذات الطور M ، قم بإنشاء IdU مقابل هيستون H3 المفسفر عن طريق المخطط المحوري. سيتم ملاحظة المرحلة M على أنها جزء صغير جدا من الخلايا داخل مجموعة هيستون H3 المفسفرة.الخلايا في السكان G2 / M مع مستويات أقل من pHH3 هي خلايا G2. إذا فشل دمج IdU أو لم يكن ممكنا ، فحدد كسور الخلايا الدائرية وليس التدوير باستخدام Ki67 وبروتين الورم الأرومي الشبكي المفسفر. سيمثل السكان الإيجابيون المزدوجون السكان النشطين لركوب الدراجات المرتبطين بمراحل G1 و S و G2 و M.سيمثل عدد السكان المنخفض المزدوج السكان غير الدراجين المرتبطين بمرحلة G0. بمجرد إنشاء جميع البوابات ، قم بتصدير القيم العددية من البوابات. يمكن تحقيق النسب المئوية في كل دورة عن طريق طرح المجموعات الفردية من المجموعات السكانية المجمعة لإنشاء قيم عددية لكل مرحلة من مراحل دورة الخلية الفردية للرسوم البيانية والتحليل الإحصائي اللاحق.يعد إنشاء البوابة المفردة أمرا مهما لفصل الحطام الخلوي والزوجي للسماح بعزل مجموعة الخلايا المفردة. يمكن بعد ذلك إجراء تحليل دورة الخلية للخلايا المفردة. يمكن أن يتأثر وضع العلامات على IdU وبالتالي تحليل دورة الخلية النهائية بشكل كبير بالوقت ودرجة الحرارة.على سبيل المثال ، الخلايا التي تبقى لفترة طويلة جدا في الأوعية المغلقة أو في النقل بين المواقع ستقلل من كسور الطور S ولن يكون ذلك دقيقا لتحليل دورة الخلية. لا تزال عينات الخلايا المحتفظ بها لفترات قصيرة من ساعة أو أقل تظهر توزيعا طبيعيا لدورة الخلية ، مما يشير إلى أن النقل السريع قد لا يؤثر سلبا على التحليل. قد تتطلب الخلايا المحفوظة بالتبريد فترة توازن طويلة قبل أن تعود الخلايا إلى دورة الخلية النشطة ، والتي قد لا تعكس حالة دورة الخلية قبل الحفظ بالتبريد.قد تتأثر أنواع الخلايا المختلفة أيضا بشكل مختلف بظروف الصيانة. على سبيل المثال ، في عينة نخاع العظم البشري هذه ، أظهرت الخلايا التائية انخفاضا في أعداد الخلايا مقارنة بالخلايا الأحادية من نفس العينة. فائدة أخرى لقياس الكتلة الخلوية هي القدرة على تمييز الخلايا في توقف دورة الخلية أو التي لها توزيع غير طبيعي لدورة الخلية.الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها متوافقة بسهولة مع قياسات قياس الكتلة الخلوية الأخرى مثل التنميط الظاهري السطحي ، وهيكل الكروماتين ، وتحفيز السيتوكين داخل الخلايا ، والتي يمكن ربطها بحالة دورة الخلية. لقد استخدمنا هذه التقنية لدراسة استنفاد الخلايا المناعية ، والشيخوخة ، ولإظهار أن الاستجابة للعلاج الكيميائي في المرضى الذين يعانون من سرطان الدم الحاد قد ترتبط بخصائص دورة الخلية لخلايا سرطان الدم.

Research

JoVE Journal

Genetics

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2&prime;-Deoxyuridine (IdU) with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

عالية الإنتاجية آليا عزل بمساعدة من درجة الحرارة التي تراعي القاتلة المسوخ في<em&gt; كلاميدوموناس reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

تربية ومزدوجة الذين تقطعت بهم السبل بوساطة الحمض النووي الريبي الجينات ضربة قاضية في إخفاء بيتل،<em&gt; Dermestes المبقعة</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

الكشف عن نسخة عدد التعديلات عن طريق التسلسل خلية واحدة

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

باستخدام تقنية PCR-نيون الشعرية جل الكهربائي إلى التركيب الوراثي كريسبر / Cas9 بوساطة خروج المغلوب المسوخ في تنسيق عالية الإنتاجية

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

دراسة الخلية التعبير عن تنظيم دورة الجينات من قبل اثنين من بروتوكولات التزامن الخلية التكميلية

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

التنميط الحمض النووي توقيت النسخ المتماثل باستخدام الزرد كنظام نموذجي في فيفو

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

الجينات المرشح الاختبار في الدراسات الفوجية السريرية مع التنميط متعدد والطيف الكتلي

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

اتباع نهج خلية واحدة اندماجي لتوصيف الجزيئية والتغاير إيمونوفينوتيبيك الجذعية البشرية والسكان السلف

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

تستخدم في المختبر وفي خلايا الشكل للتحقيق في جزيء الصغيرة التي يسببها مرناً قبل إجراء تغييرات هيكلية

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

استخدام الخلايا السرطانية الثديية الماوس في مختبر الغزو الاختباري كمقياس لسلوك الخلايا الأنكجينية

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...