Name: use of the pyrimidine analog, 5-iodo-2&prime;-deoxyuridine (idu) with cell cycle markers to establish cell cycle phases in a mass cytometry platform
Uploaded: 2021-10-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2Ã¢â‚¬Â²-Deoxyuridine IdU with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke indsatsen fra Palak Sekhri, Hussam Alkhalaileh, Hsiaochi Chang og Justin Lyeberger for deres eksperimentelle støtte. Dette arbejde blev støttet af Pelotonia Fellowship Program. Eventuelle meninger, resultater og konklusioner udtrykt i dette materiale er forfatterens (e) og afspejler ikke nødvendigvis dem fra Pelotonia Fellowship Program.

1. Forberedelse af IDU-lagre
<ol><li>5-iodo-2'-deoxyuridin (IdU) opløses i DMSO i en koncentration på 50 mM. Sterilt filter, alikvote i 10-50 μL reagensglas og opbevares ved -80 °C</li>
	<li>Fjern IdU fra fryseren, og tø op ved stuetemperatur. Fortynd IdU i RPMI-1640 for at lave en arbejdsløsning ved en slutkoncentration på 1 mM. Pipette op og ned eller hvirvel for at blande.<ol><li>Fortynd typisk den koncentrerede IdU i det medie, hvori cellerne dyrkes (f.eks. DMEM, IMDM osv.), eller fortynd den til PBS til til...

<ol>
	<li>Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+cellular+antigen+detection+by+ICP-MS.">Multiple cellular antigen detection by ICP-MS.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).</li><li>Ornatsky, O. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+cell+antigens+and+intracellular+DNA+by+identification+of+element-containing+labels+and+metallointercalators+using+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry.">Study of cell antigens and intracellular DNA by identification of element-containing labels and metallointercalators using inductively coupled plasma mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 80 (7), 2539-2547 (2008).</li><li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle.">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).</li><li>Raval, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversibility+of+Defective+Hematopoiesis+Caused+by+Telomere+Shortening+in+Telomerase+Knockout+Mice.">Reversibility of Defective Hematopoiesis Caused by Telomere Shortening in Telomerase Knockout Mice.</a> PLoS One. 10 (7), 0131722 (2015).</li><li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Cytometric+Functional+Profiling+of+Acute+Myeloid+Leukemia+Defines+Cell-Cycle+and+Immunophenotypic+Properties+That+Correlate+with+Known+Responses+to+Therapy.">Mass Cytometric Functional Profiling of Acute Myeloid Leukemia Defines Cell-Cycle and Immunophenotypic Properties That Correlate with Known Responses to Therapy.</a> Cancer Discovery. 5 (9), 988-1003 (2015).</li><li>Kimmey, S. C., Borges, L., Baskar, R., Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+analysis+of+tri-molecular+biosynthesis+with+cell+identity+and+function+in+single+cells.">Parallel analysis of tri-molecular biosynthesis with cell identity and function in single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1185 (2019).</li><li>Rabinovitch, P. S., Kubbies, M., Chen, Y. C., Schindler, D., Hoehn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU-Hoechst+flow+cytometry:+a+unique+tool+for+quantitative+cell+cycle+analysis.">BrdU-Hoechst flow cytometry: a unique tool for quantitative cell cycle analysis.</a> Experimental Cell Research. 174 (2), 309-318 (1988).</li><li>Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin+reduces+nonspecific+eosinophil+staining+artifacts+in+mass+cytometry+experiments.">Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments.</a> Cytometry A. 89 (6), 601-607 (2016).</li><li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis.">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e54394 (2017).</li><li>Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+by+Mass+Cytometry.">Immunophenotyping by Mass Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 2032, 31-51 (2019).</li><li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer.">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4398 (2012).</li><li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).</li><li>Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Web-based+analysis+and+publication+of+flow+cytometry+experiments.">Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments.</a> Current Protocols in Cytometry. , 17 (2010).</li><li>Devine, R. D., Sekhri, P., Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+storage+time+and+temperature+on+cell+cycle+analysis+by+mass+cytometry.">Effect of storage time and temperature on cell cycle analysis by mass cytometry.</a> Cytometry A. 93 (11), 1141-1149 (2018).</li><li>Campos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+immunological+markers+on+leukemic+cells+before+and+after+cryopreservation+and+thawing.">Expression of immunological markers on leukemic cells before and after cryopreservation and thawing.</a> Cryobiology. 25 (1), 18-22 (1988).</li><li>Kadic, E., Moniz, R. J., Huo, Y., Chi, A., Kariv, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cryopreservation+on+delineation+of+immune+cell+subpopulations+in+tumor+specimens+as+determinated+by+multiparametric+single+cell+mass+cytometry+analysis.">Effect of cryopreservation on delineation of immune cell subpopulations in tumor specimens as determinated by multiparametric single cell mass cytometry analysis.</a> BMC Immunology. 18 (1), 6 (2017).</li><li>Shabihkhani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+procurement,+storage,+and+quality+assurance+of+frozen+blood+and+tissue+biospecimens+in+pathology,+biorepository,+and+biobank+settings.">The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings.</a> Clinical Biochemistry. 47 (4-5), 258-266 (2014).</li></ol>

De eksempler, der præsenteres her, viser, hvordan man bruger en MCM-platform til at analysere cellecyklusfordeling. Det er også blevet påvist, at cellecyklusanalyse er følsom over for eksperimentelle forhold som tid og temperatur, hvilket er en vigtig overvejelse, som forskere skal tage, når de overvejer MCM til deres cellecyklusanalyse14. Prøver, der opbevares i en kort periode, ikke længere end en time, vil have IdU-inkorporering, der kan sammenlignes med deres normale tilstand. Prøver i...

Massecytometri muliggør detektion af ca. 40 parametre ved at drage fordel af massespektroskopiens høje opløsning og kvantitative karakter. Metalmærkede antistoffer anvendes i stedet for fluoroforkonjugerede antistoffer, der giver mulighed for et højere antal kanaler og producerer minimal afsmitning 1,2. MCM har fordele og ulemper med hensyn til cellecyklusanalyse sammenlignet med flowcytometri. En stor fordel ved MCM er, at det store antal parametre muliggør samtidig måling af cellecyklustilstand på tværs af et stort antal immunofænotypisk forskellige T-celletyper i meget heterogene prøver. MCM er med succes blevet anvendt til at måle cellecyklustilstanden under normal hæmatopoiesis i humant knoglemarv3 og transgene murinmodeller af telomerasemangel4. Analyse af cellecyklustilstand ved akut myeloid leukæmi (AML) viste, at cellecyklus korrelerede med kendte reaktioner på kliniske terapier, hvilket giver en in vivo-indsigt i funktionelle egenskaber, der kan informere behandlingsvalg5. En anden fordel ved massecytometrisk cellecyklusanalyse er evnen til at måle et stort antal andre funktionelle markører, der kan korreleres med cellecyklustilstand. Nyligt arbejde har været i stand til at korrelere protein- og RNA-syntese med cellecyklustilstand ved brug af IdU og metalmærkede antistoffer mod BRU og rRNA6. Denne form for meget parametrisk analyse, der måler cellecyklustilstand på tværs af adskillige populationer i et kontinuum af differentiering, ville være næsten umuligt med den nuværende flowcytometriteknologi. Den største ulempe ved MCM er manglen på DNA- eller RNA-pletter, der kan sammenlignes med dem, der anvendes i fluorescerende flowcytometri (f.eks. DAPI, Hoechst, Pyronin Y osv.). Fluorescerende farvestoffer kan give relativt præcise målinger af DNA- og RNA-indhold, men denne præcision er kun mulig på grund af ændringerne i disse farvestoffers fluorescerende egenskaber, der opstår ved interkalering mellem nukleotidbaser. MCM-analyse er således ikke i stand til at måle DNA- eller RNA-indhold med tilsvarende præcision. I stedet er massecytometrisk cellecyklusanalyse afhængig af målinger af proteiner relateret til cellecyklustilstand, såsom cyclin B1, phosphoryleret retinoblastomprotein (pRb) og phosphoryleret Histone H3 (pHH3) kombineret med direkte måling af jodatomet fra IdU-inkorporering i S-faseceller. Disse to målemetoder giver meget ens resultater under normal cellulær proliferation, men kan potentielt være uoverensstemmende, når cellecyklusprogression forstyrres.
Måling af antallet af celler i hver cellecyklusfase er vigtig for at forstå normal cellecyklusudvikling samt cellecyklusforstyrrelse, som almindeligvis observeres i kræft og immunologiske sygdomme. MCM giver pålidelig måling af ekstracellulære og intracellulære faktorer ved hjælp af metalmærkede antistoffer; Måling af S-fasen var imidlertid begrænset, da den iridiumbaserede DNA-interkalator ikke var i stand til at skelne mellem 2N- og 4N-DNA. For at definere cellecyklusfaser udviklede Behbehani en metode, der anvender IdU med en masse på 127, hvilket falder inden for massecytometerets område og tillader direkte måling af celler i S-fase3. Denne direkte måling omgår behovet for sekundære antistoffer eller brug af DNA-denatureringsmidler såsom syre eller DNase. I forbindelse med intracellulære cykelmarkører tillader det høj opløsning af cellecyklusfordeling i eksperimentelle modeller.
Denne protokol tilpasser cellecyklusmålinger fra almindelige flowcytometriprotokoller til MCM. Vores metoder giver en bekvem og enkel måde at inkludere cellecyklusparametre på. Inkorporering af in vitro-prøver kræver kun 10 til 15 minutters inkubation ved 37 °C, hvilket er kortere end de fleste BrdU-farvningsprotokoller, der anbefaler inkubationstider på flere timer 3,7. IdU- og BrdU-inkorporerede prøver kan fastgøres ved hjælp af en proteomisk stabilisator og derefter opbevares i nogen tid i en fryser på -80 °C. Dette gør det muligt at arkivere et stort antal IdU-farvede prøver til batchanalyse uden at reducere prøvekvaliteten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3059</td>
			<td>Component of CSM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td>Sample centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved-PARP (D214)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>F21-852</td>
			<td>Identification of apoptotic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclin B1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>GNS-1</td>
			<td>G2 Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Cryopreservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQ Four Element Calibration Beads</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201078</td>
			<td>Internal metal standard for CyTOF performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Tube w/ mesh strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td>Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Cell culture growth supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helios</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td>CyTOF System/Platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393</td>
			<td>Staining additive to prevent non-specific staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IdU (5-Iodo-2&#8242;-deoxyuridine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7125</td>
			<td>Incorporates in S-phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki-67</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>SolA15</td>
			<td>Confirmation of G0/G1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxPar Multi Label Kit</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201300</td>
			<td>Metal labeling kit, attaches metals to antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880023</td>
			<td>Mixing samples during staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201192</td>
			<td>Cell identification during CyTOF acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-H2AX (S139)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>JBW301</td>
			<td>Detection of DNA damage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-HH3 (S28)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>HTA28</td>
			<td>M-phase Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Wash solution for cell culture and component of fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Rb (S807/811)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>J112906</td>
			<td>G0/G1 Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteomic Stabilizer</td>
			<td>SmartTube Inc</td>
			<td>PROT1</td>
			<td>Sample fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21870-076</td>
			<td>Cell culture growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC447810250</td>
			<td>Component of CSM/Antibody buffer, biocide</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the pyrimidine analog, 5-iodo-2&prime;-deoxyuridine (idu) with cell cycle markers to establish cell cycle phases in a mass cytometry platform

Reguleringen af cellecyklusfase er et vigtigt aspekt af cellulær proliferation og homeostase. Forstyrrelse af de reguleringsmekanismer, der styrer cellecyklussen, er et træk ved en række sygdomme, herunder kræft. Undersøgelse af cellecyklussen kræver evnen til at definere antallet af celler i hver del af cellecyklusprogressionen samt klart at afgrænse mellem hver cellecyklusfase. Fremkomsten af massecytometri (MCM) giver et enormt potentiale for enkeltcelleanalyse med høj kapacitet gennem direkte målinger af elementære isotoper, og udviklingen af en metode til måling af cellecyklustilstanden ved MCM udvider yderligere nytten af MCM. Her beskriver vi en metode, der direkte måler 5-iodo-2′-deoxyuridin (IdU), svarende til 5-brom-2'-deoxyuridin (BrdU), i et MCM-system. Brug af denne IdU-baserede MCM giver flere fordele. For det første inkorporeres IdU hurtigt i DNA under dets syntese, hvilket muliggør pålidelig måling af celler i S-fasen med inkubationer så korte som 10-15 minutter. For det andet måles IdU uden behov for sekundære antistoffer eller behov for DNA-nedbrydning. For det tredje kan IdU-farvning let kombineres med måling af cyclin B1, phosphoryleret retinoblastomprotein (pRb) og phosphoryleret histon H3 (pHH3), som samlet giver klar afgrænsning af de fem cellecyklusfaser. Kombination af disse cellecyklusmarkører med det høje antal parametre, der er mulige med MCM, tillader kombination med mange andre målinger.

Ved hjælp af HL-60-celler og et humant knoglemarvsaspirat er det muligt at vise, hvordan eksperimentelle forhold kan påvirke cellecyklusfordeling og analyse. For det første skal gating-strategien etableres for at demonstrere, hvordan cellecyklusfaserne er afledt. I figur 1 viser vi etableringen af singletporten, som er vigtig for at adskille cellulært affald og dubletter, etablere en enkelt cellepopulation. For cellelinjer er singletporten alt, hvad der er nødvendigt for at gå videre t...

Watch this Scientific Journal Video about Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2Ã¢â‚¬Â²-Deoxyuridine IdU with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform at JoVE.com

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²-Deoxyuridine IdU with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

Denne protokol tilpasser cellecyklusmålinger til brug i en massecytometriplatform. Med multiparameterfunktionerne i massecytometri muliggør direkte måling af jodinkorporering identifikation af celler i S-fase, mens intracellulære cykelmarkører muliggør karakterisering af hver cellecyklustilstand under en række eksperimentelle betingelser.

Anvendelse af pyrimidinanalogen, 5-Iodo-2′-deoxyuridin (IdU) med cellecyklusmarkører til at etablere cellecyklusfaser i en massecytometriplatform

The regulation of cell cycle phase is an important aspect of cellular proliferation and homeostasis. Disruption of the regulatory mechanisms governing the ...

Denne protokol giver os mulighed for at undersøge cellecyklussen på enkeltcelleniveau ved hjælp af massecytometeret, og dette gør det muligt at udføre flere nye forsknings- og kliniske undersøgelser. Den største fordel ved denne teknik er dens enkelhed. IdU tilsættes direkte til cellerne, og der er ikke behov for yderligere behandling eller antistoffer.Vi har brugt denne teknik til at undersøge cellecyklustilstanden hos patienter med akut myeloid leukæmi i stammen og stamcellerummene. Og dette viste, at cellecyklusegenskaberne for disse specifikke celletyper kan korrelere med det kliniske resultat hos patienter med disse sygdomme. Denne teknik kan være nyttig til forståelse af vækstegenskaber hos sjældne kræftceller og forståelse af spredning af immuncelleundergrupper.Før og efter tilsætning af IdU til celleprøverne skal cellerne opretholdes i de vækstbetingelser, der er af interesse. I dette tilfælde fortynder en befugtet 37 grader Celsius inkubator ved 5% CO2 for at mærke cellerne med IdU den koncentrerede IdU-stamopløsning en til 50 i cellernes vækstmedier. Overfør derefter prøverne til en biosikkerhedshætte og tilsæt 10 mikroliter millimolær IdU til hver milliliter celler.Returner cellerne til inkubatoren i 10 til 15 minutter, før prøverne overføres til individuelle koniske rør. Saml cellerne ved centrifugering i 15 ml koniske rør og resuspender pellets i 200 mikroliter PBS pr. Rør. Hvis det er nødvendigt, skal du mærke cellerne med en passende levende / død plet for at markere de døde celler.Efter levende / død plet slukkes cellerne med medier vasket med CSM, før cellerne fikseres med 25 mikroliter 16% paraformaldehyd. Efter en 10 minutters inkubation ved stuetemperatur samles cellerne ved centrifugering. Tilsæt fem til 15 ml CSM og centrifuger igen.Resuspender pellets i 500 mikroliter cellefarvningsmedium suppleret med 10% dimethylsulfoxid. Overfør derefter cellerne til mindre rør for at opbevare dem i negative 80 grader Celsius. For at normalisere for deres cellecyklusanalyse skal du importere filerne til et passende flowcytometrianalyseprogram og oprette et biaksialt plot af begivenhedslængden versus 191 iridium.Cellerne vil danne en tydelig lys iridium høj befolkning. Skift skalaen for hændelseslængde for at få cellerne til at fremstå mere fremtrædende. Opret derefter en singlet-port for at udelukke 50 til 60% af dubletter og snavs, og indstil de resterende og forskudte gaussiske parametre for at fjerne eventuelle resterende dubletter og snavs.For at indstille S-faseporten skal du oprette et biaksialt plot af IdU versus en spredningsmarkør. De S-fase IdU-positive celler vil danne en særskilt population. For G0/G1 og G2/M gating skal portene etableres på et IdU versus Cyclin B1-plot.G0 / G1-fasen vil være Cyclin B1 lav, IdU-negativ, og G2 / M-fasen vil være Cyclin B1 høj, IdU-negativ. For at logge for bestemte celletyper skal du kun plotte S-fasecellerne på grafen Cyclin B1 versus IdU for at hjælpe med at etablere adskillelsen mellem G0/G1-fase- og G2/M-faseceller. Tegn en port omkring Cyclin B1 høj befolkning.I nogle tilfælde kan dette være vanskeligt at skelne, men niveauet af Cyclin B1 på ca. top 5% af S-fasepopulationen er typisk brudpunktet mellem G0/G1- og G2/M-faseportene. De celler, der befinder sig inden for den foregående port, vil være G2 / M-fasepopulationen, mens resten vil være G0 / G1-fasepopulationen. For at etablere G0-fasepopulationen skal du oprette et phosphoryleret retinoblastomprotein versus IdU-plot.G0-fasen vil blive repræsenteret af en fosforyleret retinoblastomprotein lav, IdU-negativ population. Da den aktive cykelpopulation vil demonstrere et højt fosforyleret retinoblastomprotein og IdU-inkorporering, kan G0-faseporten trækkes på denne grænse, da den typisk udtrykker sig ved to forskellige populationer. Hvis G0-porten er vanskelig at definere, skal du gøre S-fasepopulationen til den aktive befolkning og tegne en port, der indeholder de øverste 90 til 100% af den fosforylerede retinoblastomprotein-høje befolkning.Den fosforylerede retinoblastomprotein lav befolkning uden for porten er typisk G0-befolkningen, mens G0 / G1-cellerne med pRb-niveauer, der falder i denne port, er G1-celler. Til M-fase gating oprettes en IdU versus phosphoryleret histon H3 ved aksial plot. M-fasefasen vil blive observeret som den meget lille fraktion af celler inden for den fosforylerede histon H3-population.Cellerne i G2 / M-populationen med lavere niveauer af pHH3 er G2-cellerne. Hvis IdU-inkorporering mislykkedes eller ikke var mulig, skal du definere cyklende og ikke cyklende cellefraktioner ved hjælp af Ki67 og phosphoryleret retinoblastomprotein. Den dobbelt positive population vil repræsentere den aktive cykelbefolkning, der korrelerer med G1-, S-, G2- og M-faserne.Den dobbelte lave befolkning vil repræsentere den ikke-cyklende befolkning, der korrelerer med G0-fasen. Når alle portene er etableret, skal du eksportere de numeriske værdier fra portene. Procentdelene i hver cyklus kan opnås ved at trække de enkelte populationer fra de kombinerede populationer for at generere numeriske værdier for hver enkelt cellecyklusfase til efterfølgende graftegning og statistisk analyse.Etableringen af singletporten er vigtig for at adskille celleaffald og dubletter for at muliggøre isolering af enkeltcellepopulationen. Cellecyklusanalyse af de enkelte celler kan derefter udføres. IdU-mærkning og dermed nedstrøms cellecyklusanalyse kan påvirkes betydeligt af tid og temperatur.For eksempel vil celler, der forbliver for længe i lukkede beholdere eller i transport mellem steder, have reducerede S-fasefraktioner, og det vil ikke være nøjagtigt til cellecyklusanalyse. Celleprøver, der holdes i korte perioder på en time eller mindre, viser stadig en normal cellecyklusfordeling, hvilket indikerer, at en hurtig transport muligvis ikke påvirker analysen negativt. Kryopræserverede celler kan kræve en lang ligevægtsperiode, før cellerne vender tilbage til aktiv cellecyklus, hvilket muligvis stadig ikke afspejler tilstanden før kryopræserveringscellecyklussen.Forskellige celletyper kan også påvirkes forskelligt af vedligeholdelsesforholdene. For eksempel viste T-cellerne i denne humane knoglemarvsprøve en reduktion i celleantal sammenlignet med monoblaster fra den samme prøve. En anden fordel ved massecytometri er evnen til at diskriminere celler i cellecyklusstop, eller som har en unormal cellecyklusfordeling.En stor fordel ved denne teknik er, at den er let kompatibel med andre massecytometrimålinger såsom overfladefænotypning, kromatinstruktur, intracellulær cytokinstimulering, som kan korreleres med cellecyklustilstand. Vi har brugt denne teknik til at studere immuncelleudmattelse, ældning og til at vise, at responsen på kemoterapi hos patienter med akut leukæmi kan korrelere med leukæmicellernes cellecyklusegenskaber.

Research

JoVE Journal

Genetics

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2&prime;-Deoxyuridine (IdU) with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput robotersvejsede Assisted Isolering af temperaturfølsomme Lethal mutanter i<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Opdræt og dobbelt-strenget RNA-medieret Gene Knockdown i Skjul Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning af Copy Number Ændringer Brug Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Under anvendelse af et fluorescerende PCR-kapillær gelelektroforese Teknik til genotype CRISPR / Cas9-medieret Knockout Mutanter i et format med høj kapacitet

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Studie af Cyklusreguleret Gen Expression af To Komplementære Celle Synkronisering Protokoller

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profilering DNA replikation Timing ved hjælp af zebrafisk som en In Vivo modelsystem.

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Kandidat gen test i kliniske kohorteundersøgelser med multipleksede genotypebestemmelse og massespektrometri

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

En kombinatorisk encellede tilgang til at karakterisere de molekylære og Immunophenotypic heterogenitet af menneskelige stamceller og stamfader populationer

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Ved hjælp af in Vitro og i celler form at undersøge lille molekyle induceret Pre-mRNA strukturelle ændringer

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

Brugen af mus mammary tumor celler i en in vitro invasion analyse som et mål for Oncogenic celle adfærd

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...