Name: use of the pyrimidine analog, 5-iodo-2&prime;-deoxyuridine (idu) with cell cycle markers to establish cell cycle phases in a mass cytometry platform
Uploaded: 2021-10-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2Ã¢â‚¬Â²-Deoxyuridine IdU with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform at JoVE.com

De auteurs willen de inspanningen van Palak Sekhri, Hussam Alkhalaileh, Hsiaochi Chang en Justin Lyeberger bedanken voor hun experimentele steun. Dit werk werd ondersteund door het Pelotonia Fellowship Program. Alle meningen, bevindingen en conclusies die in dit materiaal worden uitgedrukt, zijn die van de auteur (s) en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs die van het Pelotonia Fellowship-programma. "

1. Voorbereiding van IdU-voorraden
<ol><li>Los 5-jood-2'-deoxyuridine (IdU) op in DMSO tot een concentratie van 50 mM. Steriel filter, aliquot in buizen van 10-50 μL en bewaren bij -80 °C</li>
	<li>Haal IdU uit de vriezer en ontdooi bij kamertemperatuur. Verdun IdU in RPMI-1640 om een werkoplossing te maken bij een eindconcentratie van 1 mM. Pipetteer op en neer of vortex om te mengen.<ol><li>Verdun doorgaans de geconcentreerde IdU in de media waarin de cellen worden gekweekt (bijv. DMEM, IMDM, enz.) of verdund tot P...

<ol>
	<li>Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+cellular+antigen+detection+by+ICP-MS.">Multiple cellular antigen detection by ICP-MS.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).</li><li>Ornatsky, O. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+cell+antigens+and+intracellular+DNA+by+identification+of+element-containing+labels+and+metallointercalators+using+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry.">Study of cell antigens and intracellular DNA by identification of element-containing labels and metallointercalators using inductively coupled plasma mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 80 (7), 2539-2547 (2008).</li><li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle.">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).</li><li>Raval, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversibility+of+Defective+Hematopoiesis+Caused+by+Telomere+Shortening+in+Telomerase+Knockout+Mice.">Reversibility of Defective Hematopoiesis Caused by Telomere Shortening in Telomerase Knockout Mice.</a> PLoS One. 10 (7), 0131722 (2015).</li><li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Cytometric+Functional+Profiling+of+Acute+Myeloid+Leukemia+Defines+Cell-Cycle+and+Immunophenotypic+Properties+That+Correlate+with+Known+Responses+to+Therapy.">Mass Cytometric Functional Profiling of Acute Myeloid Leukemia Defines Cell-Cycle and Immunophenotypic Properties That Correlate with Known Responses to Therapy.</a> Cancer Discovery. 5 (9), 988-1003 (2015).</li><li>Kimmey, S. C., Borges, L., Baskar, R., Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+analysis+of+tri-molecular+biosynthesis+with+cell+identity+and+function+in+single+cells.">Parallel analysis of tri-molecular biosynthesis with cell identity and function in single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1185 (2019).</li><li>Rabinovitch, P. S., Kubbies, M., Chen, Y. C., Schindler, D., Hoehn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU-Hoechst+flow+cytometry:+a+unique+tool+for+quantitative+cell+cycle+analysis.">BrdU-Hoechst flow cytometry: a unique tool for quantitative cell cycle analysis.</a> Experimental Cell Research. 174 (2), 309-318 (1988).</li><li>Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin+reduces+nonspecific+eosinophil+staining+artifacts+in+mass+cytometry+experiments.">Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments.</a> Cytometry A. 89 (6), 601-607 (2016).</li><li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis.">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e54394 (2017).</li><li>Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+by+Mass+Cytometry.">Immunophenotyping by Mass Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 2032, 31-51 (2019).</li><li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer.">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4398 (2012).</li><li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).</li><li>Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Web-based+analysis+and+publication+of+flow+cytometry+experiments.">Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments.</a> Current Protocols in Cytometry. , 17 (2010).</li><li>Devine, R. D., Sekhri, P., Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+storage+time+and+temperature+on+cell+cycle+analysis+by+mass+cytometry.">Effect of storage time and temperature on cell cycle analysis by mass cytometry.</a> Cytometry A. 93 (11), 1141-1149 (2018).</li><li>Campos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+immunological+markers+on+leukemic+cells+before+and+after+cryopreservation+and+thawing.">Expression of immunological markers on leukemic cells before and after cryopreservation and thawing.</a> Cryobiology. 25 (1), 18-22 (1988).</li><li>Kadic, E., Moniz, R. J., Huo, Y., Chi, A., Kariv, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cryopreservation+on+delineation+of+immune+cell+subpopulations+in+tumor+specimens+as+determinated+by+multiparametric+single+cell+mass+cytometry+analysis.">Effect of cryopreservation on delineation of immune cell subpopulations in tumor specimens as determinated by multiparametric single cell mass cytometry analysis.</a> BMC Immunology. 18 (1), 6 (2017).</li><li>Shabihkhani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+procurement,+storage,+and+quality+assurance+of+frozen+blood+and+tissue+biospecimens+in+pathology,+biorepository,+and+biobank+settings.">The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings.</a> Clinical Biochemistry. 47 (4-5), 258-266 (2014).</li></ol>

De hier gepresenteerde voorbeelden laten zien hoe u een MCM-platform kunt gebruiken om de distributie van de celcyclus te analyseren. Het is ook aangetoond dat celcyclusanalyse gevoelig is voor experimentele omstandigheden zoals tijd en temperatuur, wat een belangrijke overweging is die onderzoekers moeten nemen bij het overwegen van MCM voor hun celcyclusanalyse14. Monsters die gedurende een korte periode in opslag worden achtergelaten, niet langer dan een uur, hebben een IdU-opname die vergelijk...

Massacytometrie maakt detectie van ongeveer 40 parameters mogelijk door gebruik te maken van de hoge resolutie en kwantitatieve aard van massaspectroscopie. Metaalgelabelde antilichamen worden gebruikt in plaats van fluorofoor geconjugeerde antilichamen die een groter aantal kanalen mogelijk maken en minimale spillover produceren 1,2. MCM heeft voor- en nadelen met betrekking tot celcyclusanalyse in vergelijking met flowcytometrie. Een groot voordeel van MCM is dat het grote aantal parameters de gelijktijdige meting van de celcyclustoestand mogelijk maakt over een groot aantal immunofenotypisch verschillende T-celtypen in zeer heterogene monsters. MCM is met succes gebruikt om de celcyclustoestand te meten tijdens normale hematopoëse in humaan beenmerg3 en transgene muizenmodellen van telomerasedeficiëntie4. Analyse van de celcyclustoestand bij acute myeloïde leukemie (AML) toonde aan dat de celcyclus correleerde met bekende reacties op klinische therapieën, wat een in vivo inzicht gaf in functionele kenmerken die therapieselecties kunnen informeren5. Een tweede voordeel van massacytometrische celcyclusanalyse is de mogelijkheid om een groot aantal andere functionele markers te meten die kunnen worden gecorreleerd met de celcyclustoestand. Recent werk is in staat geweest om eiwit- en RNA-synthese te correleren met de celcyclustoestand door het gebruik van IdU en metaalgelabelde antilichamen tegen BRU en rRNA6. Dit soort zeer parametrische analyse die de celcyclustoestand meet over talrijke populaties in een continuüm van differentiatie zou bijna onmogelijk zijn met de huidige flowcytometrietechnologie. Het grote nadeel van MCM is het ontbreken van vergelijkbare DNA- of RNA-vlekken als die worden gebruikt in fluorescerende flowcytometrie (bijv. DAPI, Hoechst, Pyronine Y, enz.). Fluorescerende kleurstoffen kunnen relatief nauwkeurige metingen van DNA- en RNA-gehalte geven, maar deze precisie is alleen mogelijk vanwege de veranderingen in de fluorescerende eigenschappen van deze kleurstoffen die optreden bij intercalatie tussen nucleotidebasen. MCM-analyse is dus niet in staat om DNA- of RNA-inhoud met vergelijkbare precisie te meten. In plaats daarvan is massacytometrische celcyclusanalyse gebaseerd op metingen van eiwitten die verband houden met de celcyclustoestand, zoals cycline B1, gefosforyleerd retinoblastoomeiwit (pRb) en gefosforyleerd histon H3 (pHH3) in combinatie met directe meting van het jodiumatoom van IdU-opname in S-fasecellen. Deze twee meetbenaderingen leveren zeer vergelijkbare resultaten op tijdens normale cellulaire proliferatie, maar kunnen mogelijk dissonant zijn wanneer de progressie van de celcyclus wordt verstoord.
Meting van het aantal cellen in elke celcyclusfase is belangrijk voor het begrijpen van de normale ontwikkeling van de celcyclus en de verstoring van de celcyclus, die vaak wordt waargenomen bij kankers en immunologische ziekten. MCM biedt betrouwbare meting van extracellulaire en intracellulaire factoren met behulp van metaalgelabelde antilichamen; de meting van de S-fase was echter beperkt omdat de op iridium gebaseerde DNA-intercalator geen onderscheid kon maken tussen 2N- en 4N-DNA. Om celcyclusfasen te definiëren, ontwikkelde Behbehani een methode die IdU gebruikt met een massa van 127, die binnen het bereik van de massacytometer valt en directe meting van cellen in S-fase3 mogelijk maakt. Deze directe meting omzeilt de noodzaak van secundaire antilichamen of het gebruik van DNA-denatureringsmiddelen zoals zuur of DNase. In combinatie met intracellulaire cyclusmarkers maakt het een hoge resolutie van celcyclusverdeling in experimentele modellen mogelijk.
Dit protocol past celcyclusmetingen aan van gangbare flowcytometrieprotocollen voor MCM. Onze methoden bieden een handige en eenvoudige manier om celcyclusparameters op te nemen. IdU-opname van in vitro monsters vereist slechts 10 tot 15 minuten incubatie bij 37 °C, wat korter is dan de meeste BrdU-kleuringsprotocollen die incubatietijden van enkele uren aanbevelen 3,7. IdU- en BrdU-geïncorporeerde monsters kunnen worden gefixeerd met behulp van een proteomische stabilisator en vervolgens enige tijd worden bewaard in een vriezer van -80 °C. Hierdoor kunnen grote aantallen IdU-gekleurde monsters worden gearchiveerd voor batchanalyse zonder dat de monsterkwaliteit wordt verminderd.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3059</td>
			<td>Component of CSM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td>Sample centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved-PARP (D214)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>F21-852</td>
			<td>Identification of apoptotic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclin B1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>GNS-1</td>
			<td>G2 Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Cryopreservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQ Four Element Calibration Beads</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201078</td>
			<td>Internal metal standard for CyTOF performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Tube w/ mesh strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td>Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Cell culture growth supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helios</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td>CyTOF System/Platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393</td>
			<td>Staining additive to prevent non-specific staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IdU (5-Iodo-2&#8242;-deoxyuridine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7125</td>
			<td>Incorporates in S-phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki-67</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>SolA15</td>
			<td>Confirmation of G0/G1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxPar Multi Label Kit</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201300</td>
			<td>Metal labeling kit, attaches metals to antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880023</td>
			<td>Mixing samples during staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201192</td>
			<td>Cell identification during CyTOF acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-H2AX (S139)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>JBW301</td>
			<td>Detection of DNA damage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-HH3 (S28)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>HTA28</td>
			<td>M-phase Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Wash solution for cell culture and component of fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Rb (S807/811)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>J112906</td>
			<td>G0/G1 Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteomic Stabilizer</td>
			<td>SmartTube Inc</td>
			<td>PROT1</td>
			<td>Sample fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21870-076</td>
			<td>Cell culture growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC447810250</td>
			<td>Component of CSM/Antibody buffer, biocide</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the pyrimidine analog, 5-iodo-2&prime;-deoxyuridine (idu) with cell cycle markers to establish cell cycle phases in a mass cytometry platform

De regulatie van de celcyclusfase is een belangrijk aspect van cellulaire proliferatie en homeostase. Verstoring van de regulerende mechanismen die de celcyclus regelen, is een kenmerk van een aantal ziekten, waaronder kanker. Studie van de celcyclus vereist het vermogen om het aantal cellen in elk deel van de celcyclusprogressie te definiëren en om duidelijk af te bakenen tussen elke celcyclusfase. De komst van massacytometrie (MCM) biedt een enorm potentieel voor single cell-analyse met hoge doorvoer door directe metingen van elementaire isotopen, en de ontwikkeling van een methode om de celcyclustoestand door MCM te meten, breidt het nut van MCM verder uit. Hier beschrijven we een methode die direct 5-jood-2′-deoxyuridine (IdU) meet, vergelijkbaar met 5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU), in een MCM-systeem. Het gebruik van deze op IdU gebaseerde MCM biedt verschillende voordelen. Ten eerste wordt IdU snel opgenomen in DNA tijdens de synthese, waardoor betrouwbare metingen van cellen in de S-fase mogelijk zijn met incubaties zo kort als 10-15 minuten. Ten tweede wordt IdU gemeten zonder de noodzaak van secundaire antilichamen of de noodzaak van DNA-afbraak. Ten derde kan IdU-kleuring gemakkelijk worden gecombineerd met meting van cycline B1, gefosforyleerd retinoblastoomeiwit (pRb) en gefosforyleerd histon H3 (pHH3), dat gezamenlijk een duidelijke afbakening van de vijf celcyclusfasen biedt. De combinatie van deze celcyclusmarkers met het grote aantal parameters dat mogelijk is met MCM maakt combinatie met tal van andere statistieken mogelijk.

Met behulp van HL-60-cellen en een menselijk beenmergaspiraat is het mogelijk om te laten zien hoe experimentele omstandigheden de distributie en analyse van de celcyclus kunnen beïnvloeden. Ten eerste moet de gating-strategie worden vastgesteld om aan te tonen hoe de celcyclusfasen worden afgeleid. In figuur 1 tonen we de oprichting van de singletpoort, die belangrijk is bij het scheiden van cellulair puin en doubletten, waardoor een enkele celpopulatie ontstaat. Voor cellijnen is de singl...

Watch this Scientific Journal Video about Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2Ã¢â‚¬Â²-Deoxyuridine IdU with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform at JoVE.com

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²-Deoxyuridine IdU with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

Dit protocol past celcyclusmetingen aan voor gebruik in een massacytometrieplatform. Met de multiparametermogelijkheden van massacytometrie maakt directe meting van jodiumopname identificatie van cellen in S-fase mogelijk, terwijl intracellulaire cyclusmarkers karakterisering van elke celcyclustoestand in een reeks experimentele omstandigheden mogelijk maken.

Gebruik van de pyrimidine analoge, 5-jood-2′-deoxyuridine (IdU) met celcyclusmarkers om celcyclusfasen vast te stellen in een massacytometrieplatform

The regulation of cell cycle phase is an important aspect of cellular proliferation and homeostasis. Disruption of the regulatory mechanisms governing the ...

Dit protocol stelt ons in staat om de celcyclus op het niveau van één cel te onderzoeken met behulp van de massacytometer, en dit maakt het mogelijk om verschillende nieuwe onderzoeken en klinische studies uit te voeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de eenvoud. IdU wordt direct aan de cellen toegevoegd en er is geen verdere behandeling of antilichamen nodig.We hebben deze techniek gebruikt om de celcyclustoestand te onderzoeken bij patiënten met acute myeloïde leukemie in de stam- en voorlopercelcompartimenten. En dit toonde aan dat de celcycluseigenschappen van deze specifieke celtypen kunnen correleren met de klinische uitkomst van patiënten met deze ziekten. Deze techniek kan nuttig zijn voor het begrijpen van groei-eigenschappen van zeldzame kankercellen en het begrijpen van de proliferatie van immuuncelsubsets.Voor en na het toevoegen van IdU aan de celmonsters, houdt u de cellen in de groeiomstandigheden van belang. In dit geval, een bevochtigde 37 graden Celsius incubator bij 5% CO2 om de cellen te labelen met IdU, verdun de geconcentreerde IdU-stamoplossing één tot 50 in de groeimedia van de cellen. Breng vervolgens de monsters over in een bioveiligheidskap en voeg 10 microliter van één millimolar IdU toe aan elke milliliter cellen.Breng de cellen gedurende 10 tot 15 minuten terug naar de incubator voordat u de monsters overbrengt naar afzonderlijke conische buizen. Verzamel de cellen door centrifugeren in conische buizen van 15 milliliter en resuspensie van de pellets in 200 microliter PBS per buis. Label indien nodig de cellen met een geschikte levende / dode kleuring om de dode cellen te markeren.Na levende / dode kleur, doofde de cellen met media gewassen met CSM voordat de cellen werden gefixeerd met 25 microliter 16% paraformaldehyde. Na een incubatie van 10 minuten bij kamertemperatuur verzamelt u de cellen door centrifugeren. Voeg vijf tot 15 milliliter CSM toe en centrifugeer opnieuw.Resuspendeer de pellets in 500 microliter celkleuringsmedium aangevuld met 10% dimethylsulfoxide. Breng de cellen vervolgens over in kleinere buisjes om ze op te slaan in negatieve 80 graden Celsius. Om de voor hun celcyclusanalyse te normaliseren, importeert u de bestanden in een geschikt softwareprogramma voor flowcytometrie-analyse en maakt u een biaxiale plot van de gebeurtenislengte versus 191 iridium.De cellen zullen een duidelijke heldere iridium hoge populatie vormen. Wijzig de lengteschaal van de gebeurtenis om de cellen prominenter weer te geven. Maak vervolgens een singletpoort om 50 tot 60% van de doubletten en puin uit te sluiten en stel de resterende en offset Gaussische parameters in om eventuele resterende doubletten en puin te verwijderen.Om de S-fase gate in te stellen, maakt u een biaxiale plot van IdU versus een proliferatiemarker. De S-fase IdU-positieve cellen zullen een aparte populatie vormen. Voor G0/G1 en G2/M gating zet je de poorten op een IdU versus Cyclin B1 plot.De G0/G1-fase is cycline B1 laag, IdU negatief en de G2/M-fase is cycline B1 hoog, IdU negatief. Om voor specifieke celtypen te gaan, plot u alleen de S-fasecellen op de Cycline B1 versus IdU-grafiek om de scheiding tussen G0/G1-fase en G2/M-fasecellen vast te stellen. Teken een poort rond de Cyclin B1 hoge populatie.In sommige gevallen kan dit moeilijk te onderscheiden zijn, maar het niveau van cycline B1 van ongeveer de top 5% van de S-fase populatie is meestal het breekpunt tussen de G0 / G1 en G2 / M fase poorten. De cellen die zich binnen de vorige poort bevinden, zullen de G2 / M-fasepopulatie zijn, terwijl de rest de G0 / G1-fasepopulatie zal zijn. Om de G0-fasepopulatie vast te stellen, maakt u een gefosforyleerd retinoblastoomeiwit versus IdU-plot.De G0-fase zal worden vertegenwoordigd door een gefosforyleerd retinoblastoomeiwit met een laag, IdU-negatieve populatie. Aangezien de actieve fietsende populatie een hoog gefosforyleerd retinoblastoomeiwit en IdU-opname zal vertonen, kan de G0-fasepoort op deze grens worden getrokken, omdat deze zich meestal uitdrukt bij twee verschillende populaties. Als de G0-poort moeilijk te definiëren is, maak dan van de S-fase populatie de actieve populatie en teken een poort met de top 90 tot 100% van de gefosforyleerde retinoblastoom eiwit hoge populatie.De gefosforyleerde retinoblastoomeiwit lage populatie buiten de poort is meestal de G0-populatie, terwijl de G0 / G1-cellen met pRb-niveaus die in deze poort vallen G1-cellen zijn. Voor M-fase gating, maak een IdU versus gefosforyleerde histon H3 door axiale plot. De M-fase fase zal worden waargenomen als de zeer kleine fractie van cellen binnen de gefosforyleerde histon H3-populatie.De cellen in de G2/M-populatie met lagere niveaus van pHH3 zijn de G2-cellen. Als IdU-opname mislukte of niet mogelijk was, definieer dan de cyclische en niet-fietsende celfracties met behulp van Ki67 en gefosforyleerd retinoblastoomeiwit. De dubbel positieve populatie vertegenwoordigt de actieve fietspopulatie die correleert met de G1-, S-, G2- en M-fasen.De dubbele lage populatie zal de niet-fietsende populatie vertegenwoordigen die correleert met de G0-fase. Zodra alle poorten zijn ingesteld, exporteert u de numerieke waarden van de poorten. De percentages in elke cyclus kunnen worden bereikt door de afzonderlijke populaties af te trekken van de gecombineerde populaties om numerieke waarden voor elke individuele celcyclusfase te genereren voor latere grafieken en statistische analyse.De oprichting van de singletpoort is belangrijk voor het scheiden van het cellulaire puin en doubletten om isolatie van de eencellige populatie mogelijk te maken. Vervolgens kan celcyclusanalyse van de afzonderlijke cellen worden uitgevoerd. IdU-etikettering en dus downstream celcyclusanalyse kunnen aanzienlijk worden beïnvloed door tijd en temperatuur.Cellen die bijvoorbeeld te lang in gesloten vaten of in transport tussen locaties blijven, zullen verminderde S-fasefracties hebben en dat zal niet nauwkeurig zijn voor celcyclusanalyse. Celmonsters die gedurende korte perioden van een uur of minder worden vastgehouden, vertonen nog steeds een normale celcyclusverdeling, wat aangeeft dat een snel transport de analyse mogelijk niet negatief beïnvloedt. Gecryopreserveerde cellen kunnen een lange evenwichtsperiode vereisen voordat de cellen terugkeren naar actieve celcycli, wat mogelijk nog steeds niet de toestand van de pre-cryopreservatiecelcyclus weerspiegelt.Verschillende celtypen kunnen ook differentieel worden beïnvloed door onderhoudsomstandigheden. In dit menselijke beenmergmonster vertoonden de T-cellen bijvoorbeeld een vermindering van het aantal cellen in vergelijking met monoblasten uit hetzelfde monster. Een ander voordeel van massacytometrie is het vermogen om cellen te onderscheiden in celcyclusstilstand of die een abnormale celcyclusverdeling hebben.Een groot voordeel van deze techniek is dat het gemakkelijk compatibel is met andere massacytometriemetingen zoals oppervlaktefenotypering, chromatinestructuur, intracellulair cytokinestimmeren, wat kan worden gecorreleerd met de celcyclustoestand. We hebben deze techniek gebruikt om uitputting van immuuncellen en senescentie te bestuderen en om aan te tonen dat de respons op chemotherapie bij patiënten met acute leukemie kan correleren met de celcycluseigenschappen van de leukemiecellen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2&prime;-Deoxyuridine (IdU) with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-throughput Robotisch Assisted Isolatie van temperatuurgevoelige Lethal Mutants in<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Grootbrengen en Double-stranded RNA-gemedieerde gen knock-down in het verbergen Kever,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detectie van Copy Number Wijzigingen met behulp van Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Gebruikmaking van een fluorescentie PCR-capillaire gelelektroforese techniek voor CRISPR Genotype / Cas9-gemedieerde knockout mutanten in een High-throughput Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Het bestuderen van celcyclusreguleerde genuitdrukking door twee complementaire celsynchronisatieprotocollen

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profilering van DNA replicatie Timing met behulp van de zebravis als een modelsysteem In Vivo

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Kandidaat-gen in klinische cohortstudies met Multiplexed genotypering en massaspectrometrie testen

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Een combinatorische eencellige aanpak te karakteriseren de moleculaire en Immunophenotypic heterogeniteit van menselijke stamcellen en voorlopercellen populaties

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Met behulp van In Vitro en In cel vorm te onderzoeken klein molecuul veroorzaakte structurele veranderingen van de Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

Het gebruik van muizen-borstkanker tumor cellen in een in vitro invasie assay als een maat voor oncogene Celgedrag

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...