Name: use of the pyrimidine analog, 5-iodo-2&prime;-deoxyuridine (idu) with cell cycle markers to establish cell cycle phases in a mass cytometry platform
Uploaded: 2021-10-22T13:00:00
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Die Autoren danken den Bemühungen von Palak Sekhri, Hussam Alkhalaileh, Hsiaochi Chang und Justin Lyeberger für ihre experimentelle Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch das Pelotonia Fellowship Program unterstützt. Alle Meinungen, Erkenntnisse und Schlussfolgerungen, die in diesem Material zum Ausdruck gebracht werden, sind die des Autors/der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die des Pelotonia-Stipendienprogramms wider."

1. Aufbereitung von IdU-Beständen
<ol><li>5-Iod-2'-Desoxyuridin (IdU) in DMSO bis zu einer Konzentration von 50 mM lösen. Sterilfilter, aliquot in 10-50 μL Röhrchen und bei -80 °C lagern</li>
	<li>IdU aus dem Gefrierschrank nehmen und bei Raumtemperatur auftauen. IdU in RPMI-1640 verdünnen, um eine funktionierende Lösung mit einer Endkonzentration von 1 mM herzustellen. Pipettieren Sie auf und ab oder wirbeln Sie zum Mischen.<ol><li>In der Regel wird das konzentrierte IdU in das Medium verdünnt, in dem die Zell...

<ol>
	<li>Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+cellular+antigen+detection+by+ICP-MS.">Multiple cellular antigen detection by ICP-MS.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).</li><li>Ornatsky, O. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+cell+antigens+and+intracellular+DNA+by+identification+of+element-containing+labels+and+metallointercalators+using+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry.">Study of cell antigens and intracellular DNA by identification of element-containing labels and metallointercalators using inductively coupled plasma mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 80 (7), 2539-2547 (2008).</li><li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle.">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).</li><li>Raval, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversibility+of+Defective+Hematopoiesis+Caused+by+Telomere+Shortening+in+Telomerase+Knockout+Mice.">Reversibility of Defective Hematopoiesis Caused by Telomere Shortening in Telomerase Knockout Mice.</a> PLoS One. 10 (7), 0131722 (2015).</li><li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Cytometric+Functional+Profiling+of+Acute+Myeloid+Leukemia+Defines+Cell-Cycle+and+Immunophenotypic+Properties+That+Correlate+with+Known+Responses+to+Therapy.">Mass Cytometric Functional Profiling of Acute Myeloid Leukemia Defines Cell-Cycle and Immunophenotypic Properties That Correlate with Known Responses to Therapy.</a> Cancer Discovery. 5 (9), 988-1003 (2015).</li><li>Kimmey, S. C., Borges, L., Baskar, R., Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+analysis+of+tri-molecular+biosynthesis+with+cell+identity+and+function+in+single+cells.">Parallel analysis of tri-molecular biosynthesis with cell identity and function in single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1185 (2019).</li><li>Rabinovitch, P. S., Kubbies, M., Chen, Y. C., Schindler, D., Hoehn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU-Hoechst+flow+cytometry:+a+unique+tool+for+quantitative+cell+cycle+analysis.">BrdU-Hoechst flow cytometry: a unique tool for quantitative cell cycle analysis.</a> Experimental Cell Research. 174 (2), 309-318 (1988).</li><li>Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin+reduces+nonspecific+eosinophil+staining+artifacts+in+mass+cytometry+experiments.">Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments.</a> Cytometry A. 89 (6), 601-607 (2016).</li><li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis.">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e54394 (2017).</li><li>Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+by+Mass+Cytometry.">Immunophenotyping by Mass Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 2032, 31-51 (2019).</li><li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer.">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4398 (2012).</li><li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).</li><li>Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Web-based+analysis+and+publication+of+flow+cytometry+experiments.">Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments.</a> Current Protocols in Cytometry. , 17 (2010).</li><li>Devine, R. D., Sekhri, P., Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+storage+time+and+temperature+on+cell+cycle+analysis+by+mass+cytometry.">Effect of storage time and temperature on cell cycle analysis by mass cytometry.</a> Cytometry A. 93 (11), 1141-1149 (2018).</li><li>Campos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+immunological+markers+on+leukemic+cells+before+and+after+cryopreservation+and+thawing.">Expression of immunological markers on leukemic cells before and after cryopreservation and thawing.</a> Cryobiology. 25 (1), 18-22 (1988).</li><li>Kadic, E., Moniz, R. J., Huo, Y., Chi, A., Kariv, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cryopreservation+on+delineation+of+immune+cell+subpopulations+in+tumor+specimens+as+determinated+by+multiparametric+single+cell+mass+cytometry+analysis.">Effect of cryopreservation on delineation of immune cell subpopulations in tumor specimens as determinated by multiparametric single cell mass cytometry analysis.</a> BMC Immunology. 18 (1), 6 (2017).</li><li>Shabihkhani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+procurement,+storage,+and+quality+assurance+of+frozen+blood+and+tissue+biospecimens+in+pathology,+biorepository,+and+biobank+settings.">The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings.</a> Clinical Biochemistry. 47 (4-5), 258-266 (2014).</li></ol>

Die hier vorgestellten Beispiele zeigen, wie eine MCM-Plattform zur Analyse der Zellzyklusverteilung eingesetzt werden kann. Es hat sich auch gezeigt, dass die Zellzyklusanalyse empfindlich auf experimentelle Bedingungen wie Zeit und Temperatur reagiert, was eine wichtige Überlegung ist, die Forscher berücksichtigen müssen, wenn sie MCM für ihre Zellzyklusanalyse in Betracht ziehen14. Proben, die für einen kurzen Zeitraum, nicht länger als eine Stunde, gelagert werden, weisen eine IdU-Einarb...

Die Massenzytometrie ermöglicht die Detektion von ca. 40 Parametern, indem sie die hohe Auflösung und quantitative Natur der Massenspektroskopie nutzt. Anstelle von Fluorophor-konjugierten Antikörpern werden metallmarkierte Antikörper verwendet, die eine höhere Anzahl von Kanälen ermöglichen und einen minimalen Spillovererzeugen 1,2. MCM hat Vor- und Nachteile in Bezug auf die Zellzyklusanalyse im Vergleich zur Durchflusszytometrie. Ein großer Vorteil von MCM besteht darin, dass die große Anzahl von Parametern die gleichzeitige Messung des Zellzykluszustands über eine große Anzahl immunphänotypisch unterschiedlicher T-Zelltypen in sehr heterogenen Proben ermöglicht. MCM wurde erfolgreich eingesetzt, um den Zellzykluszustand während der normalen Hämatopoese im menschlichen Knochenmark3 und transgenen Mausmodellen des Telomerasemangels4 zu messen. Die Analyse des Zellzykluszustands bei akuter myeloischer Leukämie (AML) zeigte, dass der Zellzyklus mit bekannten Reaktionen auf klinische Therapien korrelierte, was einen In-vivo-Einblick in funktionelle Merkmale lieferte, die die Therapieauswahl beeinflussen können5. Ein zweiter Vorteil der zytometrischen Massenanalyse des Zellzyklus ist die Möglichkeit, eine große Anzahl anderer funktioneller Marker zu messen, die mit dem Zellzykluszustand korreliert werden können. Neuere Arbeiten konnten die Protein- und RNA-Synthese mit dem Zellzykluszustand korrelieren, indem IdU und metallmarkierte Antikörper gegen BRU und rRNA6 verwendet wurden. Diese Art von hochparametrischer Analyse, die den Zellzykluszustand über zahlreiche Populationen hinweg in einem Kontinuum der Differenzierung misst, wäre mit der derzeitigen Durchflusszytometrie-Technologie nahezu unmöglich. Der größte Nachteil von MCM ist das Fehlen vergleichbarer DNA- oder RNA-Färbungen, wie sie in der Fluoreszenz-Durchflusszytometrie verwendet werden (z. B. DAPI, Hoechst, Pyronin Y usw.). Fluoreszenzfarbstoffe können relativ genaue Messungen des DNA- und RNA-Gehalts liefern, aber diese Präzision ist nur aufgrund der Änderungen der Fluoreszenzeigenschaften dieser Farbstoffe möglich, die bei der Interkalation zwischen Nukleotidbasen auftreten. Die MCM-Analyse ist daher nicht in der Lage, den DNA- oder RNA-Gehalt mit ähnlicher Präzision zu messen. Stattdessen stützt sich die zytometrische Massenzellzyklusanalyse auf Messungen von Proteinen, die mit dem Zellzykluszustand in Verbindung stehen, wie z. B. Cyclin B1, phosphoryliertes Retinoblastomprotein (pRb) und phosphoryliertes Histon H3 (pHH3) in Kombination mit der direkten Messung des Jodatoms aus dem Einbau von IdU in S-Phase-Zellen. Diese beiden Messansätze liefern während der normalen Zellproliferation sehr ähnliche Ergebnisse, können aber möglicherweise diskordant sein, wenn der Zellzyklus gestört ist.
Die Messung der Anzahl der Zellen in jeder Zellzyklusphase ist wichtig, um die normale Entwicklung des Zellzyklus sowie die Unterbrechung des Zellzyklus, die häufig bei Krebs und immunologischen Erkrankungen beobachtet wird, zu verstehen. MCM ermöglicht eine zuverlässige Messung von extrazellulären und intrazellulären Faktoren mit metallmarkierten Antikörpern. Die Messung der S-Phase war jedoch eingeschränkt, da der Iridium-basierte DNA-Interkalator nicht in der Lage war, zwischen 2N- und 4N-DNA zu unterscheiden. Um Zellzyklusphasen zu definieren, entwickelte Behbehani eine Methode, die IdU mit einer Masse von 127 verwendet, die in den Bereich des Massenzytometers fällt und eine direkte Messung von Zellen in S-Phase3 ermöglicht. Durch diese direkte Messung entfällt die Notwendigkeit von Sekundärantikörpern oder der Einsatz von DNA-Vergällungsmitteln wie Säure oder DNase. In Verbindung mit intrazellulären Zyklusmarkern ermöglicht es eine hohe Auflösung der Zellzyklusverteilung in experimentellen Modellen.
Dieses Protokoll adaptiert Zellzyklusmessungen von gängigen Durchflusszytometrieprotokollen für MCM. Unsere Methoden bieten eine bequeme und einfache Möglichkeit, Zellzyklusparameter einzubeziehen. Die Inkorporation von In-vitro-Proben erfordert nur 10 bis 15 Minuten Inkubationszeit bei 37 °C, was kürzer ist als bei den meisten BrdU-Färbeprotokollen, die Inkubationszeiten von mehreren Stunden empfehlen 3,7. IdU- und BrdU-inkorporierte Proben können mit einem proteomischen Stabilisator fixiert und dann für einige Zeit in einem -80 °C Gefrierschrank gelagert werden. Auf diese Weise kann eine große Anzahl von IdU-gefärbten Proben für die Chargenanalyse archiviert werden, ohne dass die Probenqualität beeinträchtigt wird.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3059</td>
			<td>Component of CSM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td>Sample centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved-PARP (D214)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>F21-852</td>
			<td>Identification of apoptotic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclin B1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>GNS-1</td>
			<td>G2 Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Cryopreservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQ Four Element Calibration Beads</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201078</td>
			<td>Internal metal standard for CyTOF performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Tube w/ mesh strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td>Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Cell culture growth supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helios</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td>CyTOF System/Platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393</td>
			<td>Staining additive to prevent non-specific staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IdU (5-Iodo-2&#8242;-deoxyuridine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7125</td>
			<td>Incorporates in S-phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki-67</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>SolA15</td>
			<td>Confirmation of G0/G1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxPar Multi Label Kit</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201300</td>
			<td>Metal labeling kit, attaches metals to antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880023</td>
			<td>Mixing samples during staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201192</td>
			<td>Cell identification during CyTOF acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-H2AX (S139)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>JBW301</td>
			<td>Detection of DNA damage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-HH3 (S28)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>HTA28</td>
			<td>M-phase Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Wash solution for cell culture and component of fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Rb (S807/811)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>J112906</td>
			<td>G0/G1 Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteomic Stabilizer</td>
			<td>SmartTube Inc</td>
			<td>PROT1</td>
			<td>Sample fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21870-076</td>
			<td>Cell culture growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC447810250</td>
			<td>Component of CSM/Antibody buffer, biocide</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the pyrimidine analog, 5-iodo-2&prime;-deoxyuridine (idu) with cell cycle markers to establish cell cycle phases in a mass cytometry platform

Die Regulation der Zellzyklusphase ist ein wichtiger Aspekt der Zellproliferation und Homöostase. Die Störung der Regulationsmechanismen, die den Zellzyklus steuern, ist ein Merkmal einer Reihe von Krankheiten, darunter auch Krebs. Die Untersuchung des Zellzyklus erfordert die Fähigkeit, die Anzahl der Zellen in jedem Teil des Zellzyklusverlaufs zu definieren und die einzelnen Zellzyklusphasen klar abzugrenzen. Das Aufkommen der Massenzytometrie (MCM) bietet ein enormes Potenzial für die Einzelzellanalyse mit hohem Durchsatz durch direkte Messungen von Elementisotopen, und die Entwicklung einer Methode zur Messung des Zellzykluszustands mittels MCM erweitert den Nutzen von MCM weiter. Hier beschreiben wir eine Methode, die 5-Iod-2′-Desoxyuridin (IdU), ähnlich wie 5-Brom-2'-Desoxyuridin (BrdU), in einem MCM-System direkt misst. Der Einsatz dieses IdU-basierten MCM bietet mehrere Vorteile. Erstens wird IdU während seiner Synthese schnell in die DNA eingebaut, was eine zuverlässige Messung von Zellen in der S-Phase mit Inkubationszeiten von nur 10-15 Minuten ermöglicht. Zweitens wird IdU gemessen, ohne dass sekundäre Antikörper oder DNA-Abbau erforderlich sind. Drittens kann die IdU-Färbung leicht mit der Messung von Cyclin B1, phosphoryliertem Retinoblastomprotein (pRb) und phosphoryliertem Histon H3 (pHH3) kombiniert werden, was zusammen eine klare Abgrenzung der fünf Zellzyklusphasen ermöglicht. Die Kombination dieser Zellzyklusmarker mit der hohen Anzahl von Parametern, die mit MCM möglich sind, ermöglicht die Kombination mit zahlreichen anderen Metriken.

Mit Hilfe von HL-60-Zellen und einem humanen Knochenmarkaspirat kann gezeigt werden, wie experimentelle Bedingungen die Zellzyklusverteilung und -analyse beeinflussen können. Zunächst muss die Gating-Strategie festgelegt werden, um zu zeigen, wie die Zellzyklusphasen abgeleitet werden. In Abbildung 1 zeigen wir die Etablierung des Singulett-Gates, das für die Trennung von Zelltrümmern und Dubletten wichtig ist, wodurch eine Einzelzellpopulation entsteht. Für Zelllinien genügt das Singu...

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Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²-Deoxyuridine IdU with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

Dieses Protokoll passt Zellzyklusmessungen für den Einsatz in einer Massenzytometrie-Plattform an. Mit den Multiparameter-Fähigkeiten der Massenzytometrie ermöglicht die direkte Messung des Jodeinbaus die Identifizierung von Zellen in der S-Phase, während intrazelluläre Zyklusmarker die Charakterisierung jedes Zellzykluszustands unter einer Reihe von experimentellen Bedingungen ermöglichen.

Verwendung des Pyrimidin-Analogons 5-Iod-2′-Desoxyuridin (IdU) mit Zellzyklusmarkern zur Etablierung von Zellzyklusphasen in einer Massenzytometrie-Plattform

The regulation of cell cycle phase is an important aspect of cellular proliferation and homeostasis. Disruption of the regulatory mechanisms governing the ...

Dieses Protokoll ermöglicht es uns, den Zellzyklus auf Einzelzellebene mit dem Massenzytometer zu untersuchen, was die Durchführung mehrerer neuartiger Forschungs- und klinischer Studien ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Einfachheit. IdU wird direkt in die Zellen gegeben und es sind keine weiteren Behandlungen oder Antikörper erforderlich.Wir haben diese Technik verwendet, um den Zellzykluszustand bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie innerhalb der Stamm- und Vorläuferzellkompartimente zu untersuchen. Und dies zeigte, dass die Zellzykluseigenschaften dieser spezifischen Zelltypen mit dem klinischen Ergebnis von Patienten mit diesen Krankheiten korrelieren können. Diese Technik kann nützlich sein, um die Wachstumseigenschaften seltener Krebszellen zu verstehen und die Proliferation von Immunzelluntergruppen zu verstehen.Halten Sie die Zellen vor und nach der Zugabe von IdU zu den Zellproben in den gewünschten Wachstumsbedingungen. In diesem Fall wird ein befeuchteter 37 Grad Celsius Inkubator bei 5%CO2 zur Markierung der Zellen mit IdU die konzentrierte IdU-Stammlösung eins zu 50 in die Wachstumsmedien der Zellen verdünnt. Anschließend werden die Proben in eine Biosicherheitshaube überführt und auf jeden Milliliter Zellen 10 Mikroliter eines millimolaren IdU gegeben.Bringen Sie die Zellen für 10 bis 15 Minuten in den Inkubator zurück, bevor Sie die Proben in einzelne konische Röhrchen überführen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation in konischen 15-Milliliter-Röhrchen und resuspendieren Sie die Pellets in 200 Mikrolitern PBS pro Röhrchen. Beschriften Sie die Zellen bei Bedarf mit einer geeigneten lebenden/toten Färbung, um die toten Zellen zu markieren.Nach der Lebend-/Totfärbung wurden die Zellen mit mit CSM gewaschenem Medium abgeschreckt, bevor die Zellen mit 25 Mikrolitern 16%igem Paraformaldehyd fixiert wurden. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur werden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt. Fügen Sie fünf bis 15 Milliliter CSM hinzu und zentrifugieren Sie erneut.Resuspendieren Sie die Pellets in 500 Mikrolitern Zellfärbemedium, das mit 10 % Dimethylsulfoxid angereichert ist. Anschließend werden die Zellen in kleinere Röhrchen überführt, um sie bei minus 80 Grad Celsius zu lagern. Um die für ihre Zellzyklusanalyse zu normalisieren, importieren Sie die Dateien in ein geeignetes Durchflusszytometrie-Analyseprogramm und erstellen Sie ein biaxiales Diagramm der Ereignislänge im Vergleich zu 191 Iridium.Die Zellen bilden eine ausgeprägte, helle Iridium-Population. Ändern Sie die Längenskala des Ereignisses, damit die Zellen hervorgehoben werden. Erstellen Sie dann ein Singulett-Gatter, um 50 bis 60 % der Dubletten und Trümmer auszuschließen, und legen Sie die Residuen- und Offset-Gauß-Parameter fest, um alle verbleibenden Dubletten und Rückstände zu entfernen.Um das S-Phasen-Gatter festzulegen, erstellen Sie ein biaxiales Diagramm von IdU im Vergleich zu einem Proliferationsmarker. Die S-Phase IdU-positiven Zellen bilden eine eigene Population. Legen Sie für G0/G1- und G2/M-Gating die Gates in einem IdU- und Cyclin B1-Diagramm fest.Die G0/G1-Phase ist Cyclin B1-niedrig, IdU-negativ, und die G2/M-Phase ist Cyclin B1-hoch, IdU-negativ. Um bestimmte Zelltypen zu ermitteln, zeichnen Sie nur die S-Phasen-Zellen im Cyclin B1- und IdU-Diagramm auf, um die Trennung zwischen G0/G1-Phasen- und G2/M-Phasenzellen zu ermitteln. Zeichne ein Tor um die hohe Population von Cyclin B1.In einigen Fällen kann dies schwer zu erkennen sein, aber der Cyclin-B1-Spiegel von etwa den oberen 5 % der S-Phasen-Population ist typischerweise der Bruchpunkt zwischen den G0/G1- und G2/M-Phasengattern. Die Zellen, die sich innerhalb des vorherigen Tors befinden, sind die G2/M-Phasenpopulation, während der Rest die G0/G1-Phasenpopulation ist. Um die G0-Phasenpopulation zu bestimmen, erstellen Sie ein phosphoryliertes Retinoblastom-Protein im Vergleich zum IdU-Diagramm.Die G0-Phase wird durch eine phosphorylierte Retinoblastom-Protein-niedrige, IdU-negative Population repräsentiert. Da die aktiv zyklische Population ein hochphosphoryliertes Retinoblastom-Protein und eine IdU-Inkorporation aufweist, kann das G0-Phasengatter an dieser Grenze gezeichnet werden, da es typischerweise in zwei verschiedenen Populationen exprimiert wird. Wenn das G0-Gate schwer zu definieren ist, machen Sie die S-Phasen-Population zur aktiven Population und zeichnen Sie ein Gate, das die obersten 90 bis 100 % der phosphorylierten Retinoblastom-Protein-High-Population enthält.Die phosphorylierte Retinoblastom-Protein-Low-Population außerhalb des Gate-Bereichs ist typischerweise die G0-Population, während die G0/G1-Zellen mit pRb-Spiegeln, die in dieses Gate fallen, G1-Zellen sind. Für das M-Phasen-Gating wird ein IdU versus phosphoryliertes Histon H3 durch axiales Diagramm erstellt. Die M-Phasenphase wird als der sehr kleine Anteil der Zellen innerhalb der phosphorylierten Histon-H3-Population betrachtet.Die Zellen in der G2/M-Population mit niedrigeren pHH3-Spiegeln sind die G2-Zellen. Wenn die IdU-Inkorporation fehlgeschlagen ist oder nicht möglich war, definieren Sie die zyklischen und nicht zyklischen Zellfraktionen unter Verwendung von Ki67 und phosphoryliertem Retinoblastomprotein. Die doppelt positive Population repräsentiert die aktiv radelnde Population, die mit den Phasen G1, S, G2 und M korreliert.Die doppelt niedrige Population repräsentiert die nicht radelnde Population, die mit der G0-Phase korreliert. Wenn alle Gatter eingerichtet sind, exportieren Sie die numerischen Werte aus den Gattern. Die Prozentsätze in jedem Zyklus können erreicht werden, indem die einzelnen Populationen von den kombinierten Populationen subtrahiert werden, um numerische Werte für jede einzelne Zellzyklusphase für die anschließende grafische Darstellung und statistische Analyse zu generieren.Die Etablierung des Singulett-Gatters ist wichtig für die Trennung der zellulären Trümmer und Dubletten, um die Isolierung der Einzelzellpopulation zu ermöglichen. Anschließend kann eine Zellzyklusanalyse der einzelnen Zellen durchgeführt werden. Die IdU-Markierung und damit die nachgelagerte Zellzyklusanalyse kann erheblich von Zeit und Temperatur beeinflusst werden.Zum Beispiel haben Zellen, die zu lange in geschlossenen Gefäßen oder beim Transport zwischen den Orten verbleiben, reduzierte S-Phasen-Anteile, was für die Zellzyklusanalyse nicht genau ist. Zellproben, die für kurze Zeiträume von einer Stunde oder weniger aufbewahrt werden, zeigen immer noch eine normale Zellzyklusverteilung, was darauf hindeutet, dass ein schneller Transport die Analyse möglicherweise nicht negativ beeinflusst. Kryokonservierte Zellen benötigen möglicherweise eine lange Äquilibrierungsphase, bevor die Zellen in den aktiven Zellzyklus zurückkehren, was möglicherweise immer noch nicht den Zustand des Zellzyklus vor der Kryokonservierung widerspiegelt.Verschiedene Zelltypen können auch durch die Aufrechterhaltungsbedingungen unterschiedlich beeinflusst werden. In dieser menschlichen Knochenmarkprobe zeigten die T-Zellen beispielsweise eine Verringerung der Zellzahl im Vergleich zu Monoblasten aus derselben Probe. Ein weiterer Vorteil der Massenzytometrie ist die Fähigkeit, Zellen zu unterscheiden, die sich im Zellzyklusarrest befinden oder eine abnormale Zellzyklusverteilung aufweisen.Ein großer Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie leicht mit anderen Massenzytometriemessungen kompatibel ist, wie z. B. Oberflächenphänotypisierung, Chromatinstruktur, intrazellulärer Zytokinstimulation, die mit dem Zellzykluszustand korreliert werden können. Wir haben diese Technik verwendet, um die Erschöpfung und Seneszenz von Immunzellen zu untersuchen und zu zeigen, dass das Ansprechen auf eine Chemotherapie bei Patienten mit akuter Leukämie mit den Zellzykluseigenschaften der Leukämiezellen korrelieren kann.

Research

JoVE Journal

Genetics

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2&prime;-Deoxyuridine (IdU) with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

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Hochdurchsatz-robotically Assisted Isolation von temperaturempfindlichen Lethal Mutants in<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Forschung

Genetik

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Zucht- und RNA-vermittelte Gene Knockdown in der ausblenden Doppelstrang-Käfer,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Mit Hilfe eines Fluoreszenz-PCR-Kapillar-Gel-Elektrophorese-Technik CRISPR zum Genotyp / Cas9 vermittelte Knock-out Mutanten in einem Hochdurchsatz-Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Das Studium der Zellzyklus-regulierten Genexpression durch zwei komplementäre Zellsynchronisationsprotokolle

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA-Replikation Timing mit Zebrafisch als ein In Vivo Modell-System-Profiling

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Kandidaten-Gen Tests in klinischen Kohortenstudien mit gemultiplexten Genotypisierung und Massenspektrometrie

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Eine kombinatorische einzellige Ansatz zur molekularen Charakterisierung und Immunophenotypic Heterogenität der menschlichen Stammzellen und Vorläuferzellen Populationen

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Mit In-vitro- und In der Zelle Form zu untersuchen, kleines Molekül induzierte Pre-mRNA Strukturveränderungen

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

Die Verwendung von Maus-Mammary-Tumorzellen in einem In-Vitro-Invasions-Assay als Maß für das onkogene Zellverhalten

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...