Name: use of the pyrimidine analog, 5-iodo-2&prime;-deoxyuridine (idu) with cell cycle markers to establish cell cycle phases in a mass cytometry platform
Uploaded: 2021-10-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2Ã¢â‚¬Â²-Deoxyuridine IdU with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform at JoVE.com

लेखक अपने प्रयोगात्मक समर्थन के लिए पलक सेखरी, हुसाम अलखलाइलेह, सियाओची चांग और जस्टिन ल्यबर्गर के प्रयासों को धन्यवाद देना चाहते हैं। यह काम पेलोटोनिया फैलोशिप प्रोग्राम द्वारा समर्थित था। इस सामग्री में व्यक्त की गई कोई भी राय, निष्कर्ष और निष्कर्ष लेखक (ओं) के हैं और जरूरी नहीं कि पेलोटोनिया फैलोशिप प्रोग्राम को प्रतिबिंबित करें।

1. आईडीयू स्टॉक की तैयारी
<ol><li>डीएमएसओ में 5-आयोडो-2'-डीऑक्सीयूरिडाइन (आईडीयू) को 50 एमएम की एकाग्रता में भंग करें। बाँझ फ़िल्टर, 10-50 μL ट्यूबों में एलिकोट करें, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें</li>
	<li>फ्रीजर से आ...

<ol>
	<li>Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+cellular+antigen+detection+by+ICP-MS.">Multiple cellular antigen detection by ICP-MS.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).</li><li>Ornatsky, O. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+cell+antigens+and+intracellular+DNA+by+identification+of+element-containing+labels+and+metallointercalators+using+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry.">Study of cell antigens and intracellular DNA by identification of element-containing labels and metallointercalators using inductively coupled plasma mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 80 (7), 2539-2547 (2008).</li><li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle.">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).</li><li>Raval, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversibility+of+Defective+Hematopoiesis+Caused+by+Telomere+Shortening+in+Telomerase+Knockout+Mice.">Reversibility of Defective Hematopoiesis Caused by Telomere Shortening in Telomerase Knockout Mice.</a> PLoS One. 10 (7), 0131722 (2015).</li><li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Cytometric+Functional+Profiling+of+Acute+Myeloid+Leukemia+Defines+Cell-Cycle+and+Immunophenotypic+Properties+That+Correlate+with+Known+Responses+to+Therapy.">Mass Cytometric Functional Profiling of Acute Myeloid Leukemia Defines Cell-Cycle and Immunophenotypic Properties That Correlate with Known Responses to Therapy.</a> Cancer Discovery. 5 (9), 988-1003 (2015).</li><li>Kimmey, S. C., Borges, L., Baskar, R., Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+analysis+of+tri-molecular+biosynthesis+with+cell+identity+and+function+in+single+cells.">Parallel analysis of tri-molecular biosynthesis with cell identity and function in single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1185 (2019).</li><li>Rabinovitch, P. S., Kubbies, M., Chen, Y. C., Schindler, D., Hoehn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU-Hoechst+flow+cytometry:+a+unique+tool+for+quantitative+cell+cycle+analysis.">BrdU-Hoechst flow cytometry: a unique tool for quantitative cell cycle analysis.</a> Experimental Cell Research. 174 (2), 309-318 (1988).</li><li>Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin+reduces+nonspecific+eosinophil+staining+artifacts+in+mass+cytometry+experiments.">Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments.</a> Cytometry A. 89 (6), 601-607 (2016).</li><li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis.">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e54394 (2017).</li><li>Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+by+Mass+Cytometry.">Immunophenotyping by Mass Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 2032, 31-51 (2019).</li><li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer.">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4398 (2012).</li><li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).</li><li>Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Web-based+analysis+and+publication+of+flow+cytometry+experiments.">Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments.</a> Current Protocols in Cytometry. , 17 (2010).</li><li>Devine, R. D., Sekhri, P., Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+storage+time+and+temperature+on+cell+cycle+analysis+by+mass+cytometry.">Effect of storage time and temperature on cell cycle analysis by mass cytometry.</a> Cytometry A. 93 (11), 1141-1149 (2018).</li><li>Campos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+immunological+markers+on+leukemic+cells+before+and+after+cryopreservation+and+thawing.">Expression of immunological markers on leukemic cells before and after cryopreservation and thawing.</a> Cryobiology. 25 (1), 18-22 (1988).</li><li>Kadic, E., Moniz, R. J., Huo, Y., Chi, A., Kariv, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cryopreservation+on+delineation+of+immune+cell+subpopulations+in+tumor+specimens+as+determinated+by+multiparametric+single+cell+mass+cytometry+analysis.">Effect of cryopreservation on delineation of immune cell subpopulations in tumor specimens as determinated by multiparametric single cell mass cytometry analysis.</a> BMC Immunology. 18 (1), 6 (2017).</li><li>Shabihkhani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+procurement,+storage,+and+quality+assurance+of+frozen+blood+and+tissue+biospecimens+in+pathology,+biorepository,+and+biobank+settings.">The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings.</a> Clinical Biochemistry. 47 (4-5), 258-266 (2014).</li></ol>

यहां प्रस्तुत उदाहरण प्रदर्शित करते हैं कि सेल चक्र वितरण का विश्लेषण करने के लिए एमसीएम प्लेटफॉर्म का उपयोग कैसे करें। यह भी प्रदर्शित किया गया है कि सेल चक्र विश्लेषण प्रयोगात्मक स्थितियों जैसे सम...

मास साइटोमेट्री मास स्पेक्ट्रोस्कोपी के उच्च रिज़ॉल्यूशन और मात्रात्मक प्रकृति का लाभ उठाकर लगभग 40 मापदंडों का पता लगाने में सक्षम बनाता है। फ्लोरोफोर संयुग्मित एंटीबॉडी के बजाय धातु-लेबल एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है जो अधिक संख्या में चैनलों की अनुमति देते हैं और न्यूनतम स्पिलओवर 1,2 का उत्पादन करते हैं। प्रवाह साइटोमेट्री की तुलना में सेल चक्र विश्लेषण के संबंध में एमसीएम के फायदे और नुकसान हैं। एमसीएम का एक प्रमुख लाभ यह है कि बड़ी संख्या में पैरामीटर अत्यधिक विषम नमूनों में बड़ी संख्या में इम्यूनोफेनोटाइपिक रूप से अलग टी-सेल प्रकारों में सेल चक्र स्थिति के एक साथ माप को सक्षम बनाते हैं। एमसीएम का उपयोग मानव अस्थि मज्जा 3 में सामान्य हेमटोपोइजिस और टेलोमेरेज़ की कमीके ट्रांसजेनिक मुराइन मॉडल के दौरान कोशिका चक्र की स्थिति को मापने के लिए सफलतापूर्वक किया गयाहै। तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) में सेल चक्र की स्थिति के विश्लेषण से पता चला है कि सेल चक्र नैदानिक उपचारों के लिए ज्ञात प्रतिक्रियाओं से संबंधित है, कार्यात्मक विशेषताओं में एक इनविवो अंतर्दृष्टि प्रदान करता है जो चिकित्सा चयनको सूचित कर सकता है। मास साइटोमेट्रिक सेल चक्र विश्लेषण का दूसरा लाभ बड़ी संख्या में अन्य कार्यात्मक मार्करों को मापने की क्षमता है जो सेल चक्र स्थिति के साथ सहसंबद्ध हो सकते हैं। हाल के काम में आईडीयू और धातु टैग किए गए एंटीबॉडी के उपयोग के माध्यम से सेल चक्र अवस्था के साथ प्रोटीन और आरएनए संश्लेषण को सहसंबंधित करने में सक्षम किया गयाहै। भेदभाव की निरंतरता में कई आबादी में सेल चक्र की स्थिति को मापने वाला इस तरह का अत्यधिक पैरामीट्रिक विश्लेषण वर्तमान प्रवाह साइटोमेट्री तकनीक के साथ लगभग असंभव होगा। एमसीएम का प्रमुख नुकसान फ्लोरोसेंट फ्लो साइटोमेट्री (जैसे, DAPI, Hoechst, Pyronin Y, आदि) में उपयोग किए जाने वाले तुलनीय डीएनए या आरएनए दाग की कमी है। फ्लोरोसेंट रंजक डीएनए और आरएनए सामग्री के अपेक्षाकृत सटीक माप दे सकते हैं, लेकिन यह परिशुद्धता केवल इन रंगों के फ्लोरोसेंट गुणों में परिवर्तन के कारण संभव है जो न्यूक्लियोटाइड बेस के बीच इंटरकेलेशन पर होते हैं। एमसीएम विश्लेषण इस प्रकार समान परिशुद्धता के साथ डीएनए या आरएनए सामग्री को मापने में असमर्थ है। इसके बजाय, मास साइटोमेट्रिक सेल चक्र विश्लेषण सेल चक्र अवस्था से संबंधित प्रोटीन के माप पर निर्भर करता है जैसे साइक्लिन बी 1, फॉस्फोराइलेटेड रेटिनोब्लास्टोमा प्रोटीन (पीबी), और फॉस्फोराइलेटेड हिस्टोन एच 3 (पीएचएच 3) आईडीयू निगमन से आयोडीन परमाणु के प्रत्यक्ष माप के साथ संयुक्त एस-चरण कोशिकाओं में। ये दो माप दृष्टिकोण सामान्य सेलुलर प्रसार के दौरान अत्यधिक समान परिणाम देते हैं, लेकिन सेल चक्र की प्रगति बाधित होने पर संभावित रूप से अलग हो सकते हैं।
प्रत्येक सेल चक्र चरण में कोशिकाओं की संख्या का मापन सामान्य सेल चक्र विकास के साथ-साथ सेल चक्र व्यवधान को समझने में महत्वपूर्ण है, जो आमतौर पर कैंसर और प्रतिरक्षाविज्ञानी रोगों में देखा जाता है। एमसीएम धातु-टैग किए गए एंटीबॉडी का उपयोग करके बाह्य और इंट्रासेल्युलर कारकों का विश्वसनीय माप प्रदान करता है; हालांकि, एस-चरण का माप सीमित था क्योंकि इरिडियम-आधारित डीएनए इंटरकैलेटर 2 एन और 4 एन डीएनए के बीच अंतर करने में असमर्थ था। सेल चक्र चरणों को परिभाषित करने के लिए, बेहबेहानी ने एक विधि विकसित की जो 127 के द्रव्यमान के साथ आईडीयू का उपयोग करती है, जो द्रव्यमान साइटोमीटर की सीमा के भीतर आती है और एस-चरण3 में कोशिकाओं के प्रत्यक्ष माप की अनुमति देती है। यह प्रत्यक्ष माप द्वितीयक एंटीबॉडी या एसिड या डीएनएस जैसे डीएनए विकृत एजेंटों के उपयोग की आवश्यकता को दरकिनार करता है। इंट्रासेल्युलर साइक्लिंग मार्करों के साथ संयोजन में, यह प्रयोगात्मक मॉडल में सेल चक्र वितरण के उच्च रिज़ॉल्यूशन की अनुमति देता है।
यह प्रोटोकॉल एमसीएम के लिए सामान्य प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल से सेल चक्र माप को अनुकूलित करता है। हमारे तरीके सेल चक्र मापदंडों को शामिल करने के लिए एक सुविधाजनक और सरल तरीका प्रदान करते हैं। इन विट्रो नमूनों के आईडीयू निगमन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर केवल 10 से 15 मिनट की इनक्यूबेशन की आवश्यकता होती है, जो अधिकांश बीआरडीयू स्टेनिंग प्रोटोकॉल की तुलना में कम है जो कई घंटों 3,7 के इनक्यूबेशन बार की सलाह देते हैं। आईडीयू और बीआरडीयू शामिल नमूने को प्रोटिओमिक स्टेबलाइजर का उपयोग करके तय किया जा सकता है और फिर -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में कुछ समय के लिए संग्रहीत किया जा सकता है। यह नमूना गुणवत्ता में कमी के बिना बैच विश्लेषण के लिए बड़ी संख्या में आईडीयू दाग वाले नमूनों को संग्रहीत करने की अनुमति देता है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3059</td>
			<td>Component of CSM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td>Sample centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved-PARP (D214)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>F21-852</td>
			<td>Identification of apoptotic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclin B1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>GNS-1</td>
			<td>G2 Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Cryopreservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQ Four Element Calibration Beads</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201078</td>
			<td>Internal metal standard for CyTOF performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Tube w/ mesh strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td>Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Cell culture growth supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helios</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td>CyTOF System/Platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393</td>
			<td>Staining additive to prevent non-specific staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IdU (5-Iodo-2&#8242;-deoxyuridine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7125</td>
			<td>Incorporates in S-phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki-67</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>SolA15</td>
			<td>Confirmation of G0/G1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxPar Multi Label Kit</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201300</td>
			<td>Metal labeling kit, attaches metals to antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880023</td>
			<td>Mixing samples during staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201192</td>
			<td>Cell identification during CyTOF acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-H2AX (S139)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>JBW301</td>
			<td>Detection of DNA damage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-HH3 (S28)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>HTA28</td>
			<td>M-phase Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Wash solution for cell culture and component of fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Rb (S807/811)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>J112906</td>
			<td>G0/G1 Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteomic Stabilizer</td>
			<td>SmartTube Inc</td>
			<td>PROT1</td>
			<td>Sample fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21870-076</td>
			<td>Cell culture growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC447810250</td>
			<td>Component of CSM/Antibody buffer, biocide</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the pyrimidine analog, 5-iodo-2&prime;-deoxyuridine (idu) with cell cycle markers to establish cell cycle phases in a mass cytometry platform

सेल चक्र चरण का विनियमन सेलुलर प्रसार और होमियोस्टैसिस का एक महत्वपूर्ण पहलू है। कोशिका चक्र को नियंत्रित करने वाले नियामक तंत्र का विघटन कैंसर सहित कई बीमारियों की एक विशेषता है। सेल चक्र के अध्ययन के लिए सेल चक्र प्रगति के प्रत्येक भाग में कोशिकाओं की संख्या को परिभाषित करने के साथ-साथ प्रत्येक सेल चक्र चरण के बीच स्पष्ट रूप से चित्रित करने की क्षमता की आवश्यकता होती है। मास साइटोमेट्री (एमसीएम) का आगमन मौलिक आइसोटोप के प्रत्यक्ष माप के माध्यम से उच्च थ्रूपुट एकल कोशिका विश्लेषण के लिए जबरदस्त क्षमता प्रदान करता है, और एमसीएम द्वारा सेल चक्र स्थिति को मापने के लिए एक विधि का विकास एमसीएम की उपयोगिता को और बढ़ाता है। यहां हम एक ऐसी विधि का वर्णन करते हैं जो सीधे एमसीएम प्रणाली में 5-ब्रोमो-2'-डीऑक्सीयूरिडाइन (बीआरडीयू) के समान 5-आयोडो-2'-डीऑक्सीयूरिडाइन (आईडीयू) को मापता है। इस आईडीयू-आधारित एमसीएम का उपयोग कई फायदे प्रदान करता है। सबसे पहले, आईडीयू को इसके संश्लेषण के दौरान डीएनए में तेजी से शामिल किया जाता है, जिससे एस-चरण में कोशिकाओं के विश्वसनीय माप की अनुमति मिलती है, जिसमें 10-15 मिनट तक ऊष्मायन होता है। दूसरा, आईडीयू को द्वितीयक एंटीबॉडी की आवश्यकता या डीएनए क्षरण की आवश्यकता के बिना मापा जाता है। तीसरा, आईडीयू धुंधला पन को साइक्लिन बी 1, फॉस्फोराइलेटेड रेटिनोब्लास्टोमा प्रोटीन (आरबी), और फॉस्फोराइलेटेड हिस्टोन एच 3 (पीएचएच 3) के माप के साथ आसानी से जोड़ा जा सकता है, जो सामूहिक रूप से पांच सेल चक्र चरणों का स्पष्ट चित्रण प्रदान करता है। एमसीएम के साथ संभव मापदंडों की उच्च संख्या के साथ इन सेल चक्र मार्करों का संयोजन कई अन्य मैट्रिक्स के साथ संयोजन की अनुमति देता है।

एचएल -60 कोशिकाओं और मानव अस्थि मज्जा एस्पिरेट का उपयोग करके यह दिखाना संभव है कि प्रयोगात्मक स्थितियां सेल चक्र वितरण और विश्लेषण को कैसे प्रभावित कर सकती हैं। सबसे पहले, गेटिंग रणनीति को यह प्रदर्शित ...

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Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²-Deoxyuridine IdU with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

यह प्रोटोकॉल मास साइटोमेट्री प्लेटफॉर्म में उपयोग के लिए सेल चक्र माप को अनुकूलित करता है। मास साइटोमेट्री की बहु-पैरामीटर क्षमताओं के साथ, आयोडीन निगमन का प्रत्यक्ष माप एस-चरण में कोशिकाओं की पहचान की अनुमति देता है जबकि इंट्रासेल्युलर साइक्लिंग मार्कर प्रयोगात्मक स्थितियों की एक श्रृंखला में प्रत्येक सेल चक्र अवस्था के लक्षण वर्णन को सक्षम करते हैं।

मास साइटोमेट्री प्लेटफॉर्म में सेल चक्र चरणस्थापित करने के लिए सेल चक्र मार्करों के साथ पाइरिमिडीन एनालॉग, 5-आयोडो-2'-डीऑक्स्यूरिडाइन (आईडीयू) का उपयोग

The regulation of cell cycle phase is an important aspect of cellular proliferation and homeostasis. Disruption of the regulatory mechanisms governing the ...

यह प्रोटोकॉल हमें मास साइटोमीटर का उपयोग करके एकल सेल स्तर पर सेल चक्र की जांच करने की अनुमति देता है, और यह कई नए शोध और नैदानिक अध्ययन करने में सक्षम बनाता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ इसकी सादगी है। आईडीयू को सीधे कोशिकाओं में जोड़ा जाता है और आगे के उपचार या एंटीबॉडी की कोई आवश्यकता नहीं होती है।हमने स्टेम और पूर्वज सेल डिब्बों के भीतर तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया वाले रोगियों में सेल चक्र स्थिति की जांच करने के लिए इस तकनीक का उपयोग किया है। और इससे पता चला कि इन विशिष्ट सेल प्रकारों के सेल चक्र गुण इन बीमारियों वाले रोगियों के नैदानिक परिणाम के साथ सहसंबंधित हो सकते हैं। यह तकनीक दुर्लभ कैंसर कोशिकाओं के विकास गुणों को समझने और प्रतिरक्षा कोशिका उपसमुच्चय के प्रसार को समझने के लिए उपयोगी हो सकती है।सेल नमूनों में आईडीयू जोड़ने से पहले और बाद में, कोशिकाओं को रुचि की विकास स्थितियों में बनाए रखें। इस मामले में, कोशिकाओं को आईडीयू के साथ लेबल करने के लिए 5% सीओ 2 पर एक ह्यूमिडिफाइड 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर, कोशिकाओं के विकास मीडिया में केंद्रित आईडीयू स्टॉक समाधान को एक से 50 तक पतला करता है। फिर नमूनों को एक जैव सुरक्षा हुड में स्थानांतरित करें और प्रत्येक एक मिलीलीटर कोशिकाओं में एक मिलीमोलर आईडीयू के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें।नमूनों को अलग-अलग शंक्वाकार ट्यूबों में स्थानांतरित करने से पहले कोशिकाओं को 10 से 15 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में वापस करें। 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें और प्रति ट्यूब पीबीएस के 200 माइक्रोलीटर में छर्रों को फिर से निलंबित करें। यदि आवश्यक हो, तो मृत कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए कोशिकाओं को एक उपयुक्त जीवित / मृत दाग के साथ लेबल करें।मृत दाग के बाद, 16% पैराफॉर्मलडिहाइड के 25 माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं को ठीक करने से पहले सीएसएम के साथ धोए गए मीडिया के साथ कोशिकाओं को बुझाया। कमरे के तापमान पर 10 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें। पांच से 15 मिलीलीटर सीएसएम और सेंट्रीफ्यूज फिर से जोड़ें।10% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड के साथ पूरक सेल स्टेनिंग माध्यम के 500 माइक्रोलीटर में छर्रों को फिर से निलंबित किया गया। फिर कोशिकाओं को नकारात्मक 80 डिग्री सेल्सियस में स्टोर करने के लिए छोटी ट्यूबों में स्थानांतरित करें। उनके सेल चक्र विश्लेषण के लिए सामान्य करने के लिए, फ़ाइलों को एक उपयुक्त प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में आयात करें और घटना की लंबाई बनाम 191 इरिडियम का एक द्विअक्षीय प्लॉट बनाएं।कोशिकाएं एक अलग उज्ज्वल इरिडियम उच्च आबादी का निर्माण करेंगी। कक्षों को अधिक प्रमुख दिखाने के लिए ईवेंट लंबाई स्केल बदलें. फिर 50 से 60% डबल्स और मलबे को बाहर करने के लिए एक एकल गेट बनाएं और किसी भी शेष डबल्स और मलबे को हटाने के लिए अवशिष्ट और ऑफसेट गॉसियन मापदंडों को सेट करें।एस-चरण गेट सेट करने के लिए, आईडीयू बनाम प्रसार मार्कर का एक द्विअक्षीय प्लॉट बनाएं। एस-चरण आईडीयू पॉजिटिव कोशिकाएं एक अलग आबादी का निर्माण करेंगी। G0/G1, और G2/M गेटिंग के लिए, एक IU बनाम Cycline B1 प्लॉट पर गेट स्थापित करें।जी 0 / जी 1 चरण साइक्लिन बी 1 कम, आईडीयू नकारात्मक होगा, और जी 2 / एम चरण साइक्लिन बी 1 उच्च, आईडीयू नकारात्मक होगा। विशिष्ट सेल प्रकारों के लिए गेट करने के लिए, जी0/जी1 चरण और जी2/एम चरण कोशिकाओं के बीच पृथक्करण स्थापित करने में मदद करने के लिए साइक्लिन बी 1 बनाम आईडीयू ग्राफ पर केवल एस-चरण कोशिकाओं को प्लॉट करें। साइक्लिन बी 1 उच्च आबादी के चारों ओर एक गेट खींचें।कुछ मामलों में, यह समझना मुश्किल हो सकता है लेकिन एस-चरण आबादी के लगभग शीर्ष 5% के साइक्लिन बी 1 का स्तर आमतौर पर जी0 / जी 1 और जी 2 / एम चरण द्वार के बीच ब्रेकपॉइंट है। पिछले गेट के भीतर रहने वाली कोशिकाएं जी 2 / एम चरण की आबादी होंगी, जबकि शेष जी 0 / जी 1 चरण की आबादी होगी। जी 0 चरण की आबादी स्थापित करने के लिए, एक फॉस्फोराइलेटेड रेटिनोब्लास्टोमा प्रोटीन बनाम आईडीयू प्लॉट बनाएं।जी 0 चरण को फॉस्फोराइलेटेड रेटिनोब्लास्टोमा प्रोटीन कम, आईडीयू नकारात्मक आबादी द्वारा दर्शाया जाएगा। चूंकि सक्रिय साइकिल िंग आबादी एक उच्च फॉस्फोराइलेटेड रेटिनोब्लास्टोमा प्रोटीन और आईडीयू निगमन का प्रदर्शन करेगी, जी 0 चरण गेट को इस सीमा पर खींचा जा सकता है क्योंकि यह आमतौर पर दो अलग-अलग आबादी पर व्यक्त होता है। यदि जी 0 गेट को परिभाषित करना मुश्किल है, तो एस-चरण की आबादी को सक्रिय आबादी बनाएं और फॉस्फोराइलेटेड रेटिनोब्लास्टोमा प्रोटीन उच्च आबादी के शीर्ष 90 से 100% को शामिल करते हुए एक गेट खींचें।गेट के बाहर फॉस्फोराइलेटेड रेटिनोब्लास्टोमा प्रोटीन कम आबादी आमतौर पर जी 0 आबादी होती है, जबकि इस गेट में आने वाले पीआरबी स्तर वाले जी 0 / जी 1 कोशिकाएं जी 1 कोशिकाएं होती हैं। एम-फेज गेटिंग के लिए, अक्षीय प्लॉट द्वारा एक आईडीयू बनाम फॉस्फोराइलेटेड हिस्टोन एच 3 बनाएं। एम-चरण चरण को फॉस्फोराइलेटेड हिस्टोन एच 3 आबादी के भीतर कोशिकाओं के बहुत छोटे अंश के रूप में देखा जाएगा।पीएचएच 3 के निम्न स्तर के साथ जी 2 / एम आबादी में कोशिकाएं जी 2 कोशिकाएं हैं। यदि आईडीयू निगमन विफल हो गया या संभव नहीं था, तो केआई 67 और फॉस्फोराइलेटेड रेटिनोब्लास्टोमा प्रोटीन का उपयोग करके साइकिल चलाने और साइकिल चलाने वाले सेल अंशों को परिभाषित न करें। डबल पॉजिटिव आबादी जी 1, एस, जी 2 और एम-चरणों से संबंधित सक्रिय साइकिलिंग आबादी का प्रतिनिधित्व करेगी।दोहरी कम आबादी जी 0 चरण से संबंधित साइकिल चलाने वाली आबादी का प्रतिनिधित्व नहीं करेगी। एक बार सभी गेट स्थापित हो जाने के बाद, गेट से संख्यात्मक मूल्यों का निर्यात करें। प्रत्येक चक्र में प्रतिशत संयुक्त आबादी से एकल आबादी को घटाकर प्राप्त किया जा सकता है ताकि बाद के ग्राफिंग और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए प्रत्येक व्यक्तिगत सेल चक्र चरण के लिए संख्यात्मक मान उत्पन्न किए जा सकें।एकल कोशिका आबादी के अलगाव की अनुमति देने के लिए सेलुलर मलबे और डबल्स को अलग करने के लिए सिंगलेट गेट की स्थापना महत्वपूर्ण है। एकल कोशिकाओं का सेल चक्र विश्लेषण तब किया जा सकता है। आईडीयू लेबलिंग और इस प्रकार डाउनस्ट्रीम सेल चक्र विश्लेषण समय और तापमान से काफी प्रभावित हो सकता है।उदाहरण के लिए, कोशिकाएं जो संलग्न वाहिकाओं में या स्थानों के बीच परिवहन में बहुत लंबे समय तक रहती हैं, उनमें एस-चरण अंश कम हो जाएंगे और यह सेल चक्र विश्लेषण के लिए सटीक नहीं होगा। एक घंटे या उससे कम की छोटी अवधि के लिए आयोजित सेल नमूने अभी भी एक सामान्य सेल चक्र वितरण प्रदर्शित करते हैं, यह दर्शाता है कि एक त्वरित परिवहन विश्लेषण को नकारात्मक रूप से प्रभावित नहीं कर सकता है। क्रायोप्रिजर्व्ड कोशिकाओं को सक्रिय सेल साइकिलिंग में लौटने से पहले एक लंबी संतुलन अवधि की आवश्यकता हो सकती है, जो अभी भी पूर्व-क्रायोप्रिजर्वेशन सेल चक्र स्थिति को प्रतिबिंबित नहीं कर सकती है।विभिन्न सेल प्रकार भी रखरखाव की स्थिति से अलग-अलग प्रभावित हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, इस मानव अस्थि मज्जा नमूने में, टी-कोशिकाओं ने एक ही नमूने से मोनोब्लास्ट की तुलना में सेल संख्या में कमी का प्रदर्शन किया। मास साइटोमेट्री का एक और लाभ सेल चक्र गिरफ्तारी में कोशिकाओं को भेदभाव करने की क्षमता है या जिनके पास असामान्य सेल चक्र वितरण है।इस तकनीक का एक प्रमुख लाभ यह है कि यह अन्य मास साइटोमेट्री माप जैसे सतह फेनोटाइपिंग, क्रोमैटिन संरचना, इंट्रासेल्युलर साइटोकिन उत्तेजित के साथ आसानी से संगत है, जिसे सेल चक्र स्थिति के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है। हमने प्रतिरक्षा कोशिका थकावट, शिथिलता का अध्ययन करने और यह दिखाने के लिए इस तकनीक का उपयोग किया है कि तीव्र ल्यूकेमिया वाले रोगियों में कीमोथेरेपी की प्रतिक्रिया ल्यूकेमिया कोशिकाओं के सेल चक्र गुणों के साथ सहसंबंधित हो सकती है।

Research

JoVE Journal

Genetics

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2&prime;-Deoxyuridine (IdU) with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

उच्च throughput रोबोट-समर्थित में तापमान के प्रति संवेदनशील घातक म्यूटेंट के अलगाव<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

पालन ​​और मिटायें बीटल में डबल असहाय शाही सेना की मध्यस्थता जीन पछाड़ना,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

नकल संख्या बदलाव की जांच सिंगल सेल अनुक्रमण का उपयोग

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

एक उच्च throughput प्रारूप में / Cas9 की मध्यस्थता नॉकआउट म्यूटेंट CRISPR जीनोटाइप के लिए एक फ्लोरोसेंट पीसीआर केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन तकनीक का उपयोग करते हुए

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

दो पूरक सेल तुल्यकालन प्रोटोकॉल द्वारा सेल चक्र-विनियमित जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करना

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

डीएनए प्रतिकृति एक Vivo में मॉडल प्रणाली के रूप में Zebrafish का उपयोग समय की रूपरेखा

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

मल्टीप्लेक्स Genotyping और जनसंचार स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ नैदानिक पलटन अध्ययन में उंमीदवार जीन परीक्षण

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

मानव स्टेम और जनक आबादी के आणविक और Immunophenotypic विविधता की विशेषताएं करने के लिए एक मिश्रित एकल सेल दृष्टिकोण

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

इन विट्रो और में-सेल आकार छोटे अणु प्रेरित पूर्व mRNA संरचनात्मक परिवर्तन की जांच करने के लिए का उपयोग करना

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

एक इन विट्रो आक्रमण परख में माउस मैमरी ट्यूमर कोशिकाओं का उपयोग Oncogenic सेल व्यवहार के एक उपाय के रूप में

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...