Name: use of the pyrimidine analog, 5-iodo-2&prime;-deoxyuridine (idu) with cell cycle markers to establish cell cycle phases in a mass cytometry platform
Uploaded: 2021-10-22T13:00:00
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저자는 실험적 지원에 대해 Palak Sekhri, Hussam Alkhalaileh, Hsiaochi Chang 및 Justin Lyeberger의 노력에 감사드립니다. 이 작업은 Pelotonia Fellowship Program의 지원을 받았습니다. 이 자료에 표현된 모든 의견, 결과 및 결론은 저자의 것이며 반드시 Pelotonia Fellowship Program의 의견을 반영하는 것은 아닙니다."

1. IdU 주식 준비
<ol><li>5-요오도-2'-데옥시유리딘(IdU)을 DMSO에 50mM의 농도로 용해시킨다. 멸균 필터, 10-50 μL 튜브에 분취량, -80 °C에서 보관</li>
	<li>냉동실에서 IdU를 꺼내 실온에서 해동합니다. RPMI-1640에서 IdU를 희석하여 1mM의 최종 농도에서 작업 용액을 만듭니다. 피펫을 위아래로 또는 소용돌이 치며 혼합합니다.<ol><li>일반적으로 농축된 IdU를 세포가 배양되는 배지(예: DMEM, IMDM 등)로 희석하거나 ?...

<ol>
	<li>Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+cellular+antigen+detection+by+ICP-MS.">Multiple cellular antigen detection by ICP-MS.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).</li><li>Ornatsky, O. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+cell+antigens+and+intracellular+DNA+by+identification+of+element-containing+labels+and+metallointercalators+using+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry.">Study of cell antigens and intracellular DNA by identification of element-containing labels and metallointercalators using inductively coupled plasma mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 80 (7), 2539-2547 (2008).</li><li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle.">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).</li><li>Raval, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversibility+of+Defective+Hematopoiesis+Caused+by+Telomere+Shortening+in+Telomerase+Knockout+Mice.">Reversibility of Defective Hematopoiesis Caused by Telomere Shortening in Telomerase Knockout Mice.</a> PLoS One. 10 (7), 0131722 (2015).</li><li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Cytometric+Functional+Profiling+of+Acute+Myeloid+Leukemia+Defines+Cell-Cycle+and+Immunophenotypic+Properties+That+Correlate+with+Known+Responses+to+Therapy.">Mass Cytometric Functional Profiling of Acute Myeloid Leukemia Defines Cell-Cycle and Immunophenotypic Properties That Correlate with Known Responses to Therapy.</a> Cancer Discovery. 5 (9), 988-1003 (2015).</li><li>Kimmey, S. C., Borges, L., Baskar, R., Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+analysis+of+tri-molecular+biosynthesis+with+cell+identity+and+function+in+single+cells.">Parallel analysis of tri-molecular biosynthesis with cell identity and function in single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1185 (2019).</li><li>Rabinovitch, P. S., Kubbies, M., Chen, Y. C., Schindler, D., Hoehn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU-Hoechst+flow+cytometry:+a+unique+tool+for+quantitative+cell+cycle+analysis.">BrdU-Hoechst flow cytometry: a unique tool for quantitative cell cycle analysis.</a> Experimental Cell Research. 174 (2), 309-318 (1988).</li><li>Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin+reduces+nonspecific+eosinophil+staining+artifacts+in+mass+cytometry+experiments.">Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments.</a> Cytometry A. 89 (6), 601-607 (2016).</li><li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis.">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e54394 (2017).</li><li>Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+by+Mass+Cytometry.">Immunophenotyping by Mass Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 2032, 31-51 (2019).</li><li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer.">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4398 (2012).</li><li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).</li><li>Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Web-based+analysis+and+publication+of+flow+cytometry+experiments.">Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments.</a> Current Protocols in Cytometry. , 17 (2010).</li><li>Devine, R. D., Sekhri, P., Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+storage+time+and+temperature+on+cell+cycle+analysis+by+mass+cytometry.">Effect of storage time and temperature on cell cycle analysis by mass cytometry.</a> Cytometry A. 93 (11), 1141-1149 (2018).</li><li>Campos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+immunological+markers+on+leukemic+cells+before+and+after+cryopreservation+and+thawing.">Expression of immunological markers on leukemic cells before and after cryopreservation and thawing.</a> Cryobiology. 25 (1), 18-22 (1988).</li><li>Kadic, E., Moniz, R. J., Huo, Y., Chi, A., Kariv, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cryopreservation+on+delineation+of+immune+cell+subpopulations+in+tumor+specimens+as+determinated+by+multiparametric+single+cell+mass+cytometry+analysis.">Effect of cryopreservation on delineation of immune cell subpopulations in tumor specimens as determinated by multiparametric single cell mass cytometry analysis.</a> BMC Immunology. 18 (1), 6 (2017).</li><li>Shabihkhani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+procurement,+storage,+and+quality+assurance+of+frozen+blood+and+tissue+biospecimens+in+pathology,+biorepository,+and+biobank+settings.">The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings.</a> Clinical Biochemistry. 47 (4-5), 258-266 (2014).</li></ol>

여기에 제시된 예는 MCM 플랫폼을 사용하여 세포 주기 분포를 분석하는 방법을 보여줍니다. 또한 세포 주기 분석은 시간 및 온도와 같은 실험 조건에 민감하다는 것이 입증되었으며, 이는 연구자들이 세포 주기 분석을 위해 MCM을 고려할 때 반드시 고려해야 할 중요한 사항이다14. 한 시간 이하의 짧은 기간 동안 보관된 샘플은 정상 상태와 유사한 IdU 통합을 갖습니다. 장기간(약 2?...

질량 세포 분석은 질량 분광법의 고분해능 및 정량적 특성을 활용하여 약 40개의 파라미터를 검출할 수 있습니다. 더 많은 수의 채널을 허용하고 최소 스필오버(spillover)를 생성하는 형광단 접합 항체 대신 금속 표지 항체가 사용됩니다 1,2. MCM은 유세포 분석과 비교하여 세포 주기 분석과 관련하여 장점과 단점이 있습니다. MCM의 주요 이점 중 하나는 많은 수의 파라미터를 통해 매우 이질적인 샘플에서 많은 수의 면역 표현형으로 구별되는 T 세포 유형에 걸쳐 세포 주기 상태를 동시에 측정할 수 있다는 것입니다. MCM은 텔로머라아제 결핍증의 인간 골수3 및 형질전환 쥐 모델에서 정상적인 조혈 동안 세포 주기 상태를 측정하는 데 성공적으로 사용되었습니다4. 급성 골수성 백혈병(AML)의 세포 주기 상태를 분석한 결과, 세포 주기가 임상 요법에 대한 알려진 반응과 상관관계가 있는 것으로 나타났으며, 이는 치료법 선택에 정보를 제공할 수 있는 기능적 특성에 대한 생체 내 통찰력을 제공한다5. 질량 세포 분석 세포 주기 분석의 두 번째 이점은 세포 주기 상태와 상관관계가 있을 수 있는 많은 다른 기능적 마커를 측정할 수 있다는 것입니다. 최근 연구에서는 IdU 및 BRU 및 rRNA에 대한 금속 태그 항체를 사용하여 단백질 및 RNA 합성을 세포 주기 상태와 연관시킬 수 있었습니다6. 분화 연속체에서 수많은 집단에 걸쳐 세포 주기 상태를 측정하는 이러한 종류의 고도의 매개변수 분석은 현재의 유세포 분석 기술로는 거의 불가능합니다. MCM의 주요 단점은 형광 유세포 분석에 사용되는 것과 유사한 DNA 또는 RNA 염색(예: DAPI, Hoechst, Pyronin Y 등)이 없다는 것입니다. 형광 염료는 DNA 및 RNA 함량을 비교적 정밀하게 측정할 수 있지만, 이러한 정밀도는 뉴클레오티드 염기 사이의 삽입시 발생하는 이러한 염료의 형광 특성의 변화로 인해 가능합니다. 따라서 MCM 분석은 유사한 정밀도로 DNA 또는 RNA 함량을 측정할 수 없습니다. 대신, 질량 세포 분석 세포 주기 분석은 사이클린 B1, 인산화된 망막모세포종 단백질(pRb) 및 인산화된 히스톤 H3(pHH3)와 같은 세포 주기 상태와 관련된 단백질의 측정과 IdU 결합에서 S상 세포로의 요오드 원자의 직접 측정에 의존합니다. 이 두 가지 측정 접근법은 정상적인 세포 증식 동안 매우 유사한 결과를 산출하지만 세포주기 진행이 중단 될 때 잠재적으로 불일치 할 수 있습니다.
각 세포주기 단계에서 세포 수의 측정은 암 및 면역 질환에서 일반적으로 관찰되는 세포주기 파괴뿐만 아니라 정상적인 세포주기 발달을 이해하는 데 중요합니다. MCM은 금속 표지 항체를 사용하여 세포외 및 세포내 인자의 신뢰할 수 있는 측정을 제공합니다. 그러나 이리듐계 DNA 인터칼레이터는 2N과 4N DNA를 구별할 수 없었기 때문에 S상 측정이 제한적이었다. 세포주기 단계를 정의하기 위해 Behbehani는 질량 세포 분석기의 범위에 속하고 S 상3에서 세포를 직접 측정 할 수있는 질량 127의 IdU를 활용하는 방법을 개발했습니다. 이러한 직접 측정은 2차 항체의 필요성이나 산 또는 DNase와 같은 DNA 변성제의 사용을 우회합니다. 세포 내 사이클링 마커와 함께 실험 모델에서 세포주기 분포의 고분해능을 허용합니다.
이 프로토콜은 MCM에 대한 일반적인 유세포 분석 프로토콜의 세포 주기 측정을 조정합니다. 우리의 방법은 세포주기 매개 변수를 포함하는 편리하고 간단한 방법을 제공합니다. 시험관 내 샘플의 IdU 통합은 37°C에서 10-15분의 배양만 필요로 하며, 이는 수 시간의 배양 시간을 권장하는 대부분의 BrdU 염색 프로토콜보다 짧습니다 3,7. IdU 및 BrdU 혼입 샘플은 -80°C 냉동고에 일정 시간 동안 보관한 후 단백질체 안정화제를 사용하여 고정할 수 있습니다. 이를 통해 샘플 품질의 저하 없이 배치 분석을 위해 많은 수의 IdU 염색 샘플을 보관할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3059</td>
			<td>Component of CSM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td>Sample centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved-PARP (D214)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>F21-852</td>
			<td>Identification of apoptotic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclin B1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>GNS-1</td>
			<td>G2 Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Cryopreservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQ Four Element Calibration Beads</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201078</td>
			<td>Internal metal standard for CyTOF performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Tube w/ mesh strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td>Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Cell culture growth supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helios</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td>CyTOF System/Platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393</td>
			<td>Staining additive to prevent non-specific staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IdU (5-Iodo-2&#8242;-deoxyuridine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7125</td>
			<td>Incorporates in S-phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki-67</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>SolA15</td>
			<td>Confirmation of G0/G1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxPar Multi Label Kit</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201300</td>
			<td>Metal labeling kit, attaches metals to antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880023</td>
			<td>Mixing samples during staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201192</td>
			<td>Cell identification during CyTOF acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-H2AX (S139)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>JBW301</td>
			<td>Detection of DNA damage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-HH3 (S28)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>HTA28</td>
			<td>M-phase Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Wash solution for cell culture and component of fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Rb (S807/811)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>J112906</td>
			<td>G0/G1 Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteomic Stabilizer</td>
			<td>SmartTube Inc</td>
			<td>PROT1</td>
			<td>Sample fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21870-076</td>
			<td>Cell culture growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC447810250</td>
			<td>Component of CSM/Antibody buffer, biocide</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the pyrimidine analog, 5-iodo-2&prime;-deoxyuridine (idu) with cell cycle markers to establish cell cycle phases in a mass cytometry platform

세포주기 단계의 조절은 세포 증식 및 항상성의 중요한 측면입니다. 세포주기를 지배하는 조절 메커니즘의 붕괴는 암을 포함한 여러 질병의 특징입니다. 세포주기에 대한 연구는 세포주기 진행의 각 부분에서 세포 수를 정의하고 각 세포주기 단계 사이를 명확하게 묘사하는 능력을 필요로합니다. 질량 세포분석법(MCM)의 출현은 원소 동위원소의 직접 측정을 통해 고처리량 단일 세포 분석에 대한 엄청난 잠재력을 제공하며, MCM에 의한 세포 주기 상태를 측정하는 방법의 개발은 MCM의 유용성을 더욱 확장합니다. 여기에서는 MCM 시스템에서 5-브로모-2'-데옥시유리딘(BrdU)과 유사한 5-요오도-2'-데옥시우리딘(IdU)을 직접 측정하는 방법을 설명합니다. 이 IdU 기반 MCM을 사용하면 몇 가지 이점이 있습니다. 첫째, IdU는 합성 과정에서 DNA에 빠르게 통합되어 10-15분의 짧은 배양으로 S상 세포를 안정적으로 측정할 수 있습니다. 둘째, IdU는 2차 항체나 DNA 분해가 필요 없이 측정됩니다. 셋째, IdU 염색은 사이클린 B1, 인산화된 망막모세포종 단백질(pRb) 및 인산화된 히스톤 H3(pHH3)의 측정과 쉽게 결합될 수 있으며, 이는 5가지 세포 주기 단계를 집합적으로 명확하게 설명합니다. 이러한 세포 주기 마커와 MCM으로 가능한 많은 수의 매개변수의 조합은 수많은 다른 지표와 결합을 가능하게 합니다.

HL-60 세포와 인간 골수 흡인을 활용하여 실험 조건이 세포 주기 분포 및 분석에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 보여줄 수 있습니다. 첫째, 세포주기 단계가 어떻게 도출되는지를 보여주기 위해 게이팅 전략을 수립해야합니다. 그림 1에서 우리는 세포 파편과 이중선을 분리하여 단일 세포 집단을 확립하는 데 중요한 일중항 게이트의 확립을 보여줍니다. 세포주의 경우 일중항 게...

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Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²-Deoxyuridine IdU with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

이 프로토콜은 질량 세포 분석 플랫폼에서 사용하기 위해 세포 주기 측정을 조정합니다. 질량 세포분석의 다중 파라미터 기능을 통해 요오드 결합을 직접 측정하면 S상에서 세포를 식별할 수 있으며 세포 내 사이클링 마커를 통해 다양한 실험 조건에서 각 세포 주기 상태를 특성화할 수 있습니다.

세포 주기 마커와 함께 피리미딘 유사체, 5-요오도-2′-데옥시우리딘(IdU)을 사용하여 질량 세포분석 플랫폼에서 세포 주기 단계 설정

The regulation of cell cycle phase is an important aspect of cellular proliferation and homeostasis. Disruption of the regulatory mechanisms governing the ...

이 프로토콜을 통해 질량 세포계를 사용하여 단일 세포 수준에서 세포 주기를 검사할 수 있으며, 이를 통해 여러 가지 새로운 연구 및 임상 연구를 수행할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 단순성입니다. IdU는 세포에 직접 첨가되며 추가 치료 또는 항체가 필요하지 않습니다.우리는 이 기술을 사용하여 줄기 및 전구 세포 구획 내에서 급성 골수성 백혈병 환자의 세포 주기 상태를 조사했습니다. 그리고 이것은 이러한 특정 세포 유형의 세포주기 특성이 이러한 질병을 가진 환자의 임상 결과와 상관 관계가 있음을 입증했습니다. 이 기술은 희귀 암세포의 성장 특성을 이해하고 면역 세포 하위 집합의 증식을 이해하는 데 유용할 수 있습니다.IdU를 세포 샘플에 첨가하기 전과 후에, 세포를 관심있는 성장 조건으로 유지시킨다. 이때, 섭씨 37도의 가습 배양기에서 세포를 IdU로 표지하기 위해 5%CO2, 농축된 IdU 원액을 1 내지 50으로 희석하여 세포의 성장 배지로 희석한다. 그런 다음 샘플을 생물 안전 후드로 옮기고 세포 1 밀리리터마다 1 밀리몰 IdU 10 마이크로 리터를 추가합니다.샘플을 개별 원추형 튜브로 옮기기 전에 세포를 10-15분 동안 인큐베이터로 되돌립니다. 15 밀리리터 원뿔형 튜브에서 원심분리에 의해 세포를 수집하고, 튜브 당 200 마이크로리터의 PBS에 펠릿을 재현탁시킨다. 필요한 경우 죽은 세포를 표시하기 위해 적절한 살아있는/죽은 얼룩으로 세포에 라벨을 붙입니다.살아있는/죽은 염색 후, 세포를 25마이크로리터의 16% 파라포름알데히드로 고정하기 전에 CSM으로 세척된 배지로 세포를 담금질했습니다. 실온에서 10분간 배양한 후, 원심분리를 통해 세포를 수집한다. 5 내지 15 밀리리터의 CSM을 첨가하고 다시 원심 분리한다.10%디메틸 설폭사이드가 보충된 500마이크로리터의 세포 염색 배지에 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 세포를 더 작은 튜브로 옮겨 섭씨 영하 80도에 보관합니다. 세포 주기 분석을 위해 정규화하려면 파일을 적절한 유세포 분석 소프트웨어 프로그램으로 가져오고 이벤트 길이 대 191 이리듐의 이축 플롯을 만듭니다.세포는 뚜렷한 밝은 이리듐 높은 집단을 형성합니다. 셀이 더 두드러지게 나타나도록 이벤트 길이 배율을 변경합니다. 그런 다음 이중선과 파편의 50-60%를 제외하는 싱글렛 게이트를 만들고 잔차 및 오프셋 가우스 매개변수를 설정하여 남아 있는 이중선과 파편을 제거합니다.S상 게이트를 설정하려면 IdU 대 증식 마커의 이축 플롯을 만듭니다. S상 IdU 양성 세포는 별개의 집단을 형성합니다. G0/G1 및 G2/M 게이팅의 경우 IdU 대 Cyclin B1 플롯에 게이트를 설정합니다.G0/G1 단계는 사이클린 B1 낮음, IdU 음성, G2/M 단계는 사이클린 B1 높음, IdU 음성입니다. 특정 세포 유형을 게이트하려면 G0/G1 상과 G2/M 상 세포 간의 분리를 설정하는 데 도움이 되도록 Cyclin B1 대 IdU 그래프에 S상 세포만 표시합니다. Cyclin B1 인구가 많은 주위에 게이트를 그립니다.어떤 경우에는 식별하기 어려울 수 있지만 S상 모집단의 약 상위 5%의 사이클린 B1 수준은 일반적으로 G0/G1과 G2/M 위상 게이트 사이의 중단점입니다. 이전 게이트 내에 있는 세포는 G2/M 위상 집단이 되고 나머지는 G0/G1 위상 집단이 됩니다. G0기 모집단을 설정하려면 인산화된 망막모세포종 단백질 대 IdU 플롯을 만듭니다.G0 단계는 인산화된 망막모세포종 단백질이 낮고 IdU 음성 집단으로 표시됩니다. 활성 사이클링 집단이 높은 인산화된 망막모세포종 단백질 및 IdU 결합을 입증할 것이기 때문에, G0 위상 게이트는 일반적으로 두 개의 별개의 집단에서 발현되기 때문에 이 경계에서 그릴 수 있습니다. G0 게이트를 정의하기 어려운 경우 S상 모집단을 활성 모집단으로 만들고 인산화된 망막모세포종 단백질 고모집단의 상위 90-100%를 포함하는 게이트를 그립니다.게이트 외부의 인산화된 망막모세포종 단백질 낮은 집단은 일반적으로 G0 집단인 반면, 이 게이트에 속하는 pRb 수준을 갖는 G0/G1 세포는 G1 세포입니다. M상 게이팅의 경우 축 플롯으로 IdU 대 인산화된 히스톤 H3를 생성합니다. M상 단계는 인산화된 히스톤 H3 집단 내에서 세포의 매우 작은 부분으로 관찰됩니다.pHH3 수치가 낮은 G2/M 집단의 세포가 G2 세포입니다. IdU 통합이 실패했거나 불가능한 경우 Ki67 및 인산화된 망막모세포종 단백질을 사용하여 사이클링 및 사이클링이 아닌 세포 분획을 정의합니다. 이중 양성 모집단은 G1, S, G2 및 M-단계와 상관관계가 있는 활성 순환 모집단을 나타냅니다.이중 낮은 인구는 G0 단계와 상관 관계가 있는 순환하지 않는 인구를 나타냅니다. 모든 게이트가 설정되면 게이트에서 숫자 값을 내보냅니다. 각 주기의 백분율은 결합된 모집단에서 단일 모집단을 빼서 후속 그래프 작성 및 통계 분석을 위해 각 개별 세포 주기 단계에 대한 수치를 생성함으로써 달성할 수 있습니다.단일항 게이트의 확립은 단세포 집단의 분리를 허용하기 위해 세포 파편과 이중선을 분리하는 데 중요합니다. 이어서, 단일세포의 세포 주기 분석이 수행될 수 있다. IdU 라벨링 및 이에 따른 다운스트림 세포 주기 분석은 시간과 온도에 의해 크게 영향을 받을 수 있습니다.예를 들어, 밀폐된 용기 또는 위치 간 운송에 너무 오래 남아 있는 세포는 S상 분획이 감소하여 세포 주기 분석에 정확하지 않습니다. 한 시간 이하의 짧은 기간 동안 보관된 세포 샘플은 여전히 정상적인 세포 주기 분포를 보여주며, 이는 빠른 수송이 분석에 부정적인 영향을 미치지 않을 수 있음을 나타냅니다. 냉동보존된 세포는 세포가 활성 세포 사이클링으로 복귀하기 전에 긴 평형 기간을 필요로 할 수 있으며, 이는 여전히 동결보존 전 세포 주기 상태를 반영하지 않을 수 있습니다.다른 세포 유형은 또한 유지 조건에 의해 차별적으로 영향을 받을 수 있습니다. 예를 들어, 이 인간 골수 샘플에서 T 세포는 동일한 샘플의 단모세포에 비해 세포 수의 감소를 입증했습니다. 질량 세포 분석의 또 다른 이점은 세포 주기 정지 또는 비정상적인 세포 주기 분포를 가진 세포를 구별할 수 있다는 것입니다.이 기술의 주요 장점은 표면 표현형, 염색질 구조, 세포내 사이토카인 자극과 같은 다른 질량 세포 분석 측정과 쉽게 호환되며, 이는 세포 주기 상태와 상관될 수 있다는 것입니다. 우리는 이 기술을 사용하여 면역 세포 고갈, 노화를 연구하고 급성 백혈병 환자의 화학 요법에 대한 반응이 백혈병 세포의 세포 주기 특성과 상관관계가 있을 수 있음을 보여주었습니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2&prime;-Deoxyuridine (IdU) with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

온도에 민감한 치명적인 돌연변이의 높은 처리량 로봇 보조 절연에<em&gt; 클라 미도 모나스의 reinhardtii에서</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

연구

유전학

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

CRISPR을 유전자형하기 위해 형광 PCR-모세관 젤 전기 영동 기술을 사용 / 높은 처리량 형식으로 녹아웃 돌연변이를 Cas9 매개

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

두 개의 상보적인 세포 동기화 프로토콜에 의한 세포주기 조절 유전자 발굴 연구

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA 복제 타이밍 Zebrafish Vivo에서 모델 시스템으로 사용 하 여 프로 파일링

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

후보 유전자 다중화 유전형과 질량 분석 임상 코 호트 연구에서 테스트

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

분자 특성 조합 단일 셀 접근 및 인간의 줄기 및 조상 인구 Immunophenotypic이

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

작은 분자 조사를 시험관 및 셀 모양을 사용 하 여 사전 mRNA 구조 변화 유도

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

종양 발생 세포 행동의 척도로 시험관 내 침략 분석에서 마우스 유방 종양 세포의 사용

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...