Name: use of the pyrimidine analog, 5-iodo-2&prime;-deoxyuridine (idu) with cell cycle markers to establish cell cycle phases in a mass cytometry platform
Uploaded: 2021-10-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2Ã¢â‚¬Â²-Deoxyuridine IdU with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke innsatsen til Palak Sekhri, Hussam Alkhalaileh, Hsiaochi Chang og Justin Lyeberger for deres eksperimentelle støtte. Dette arbeidet ble støttet av Pelotonia Fellowship Program. Eventuelle meninger, funn og konklusjoner uttrykt i dette materialet tilhører forfatteren(e) og reflekterer ikke nødvendigvis de fra Pelotonia Fellowship Program.

1. Utarbeidelse av IdU-aksjer
<ol><li>Løs opp 5-jod-2'-deoksyuridin (IdU) i DMSO til en konsentrasjon på 50 mM. Sterilt filter, alikot i 10-50 μL rør, og oppbevares ved -80 °C</li>
	<li>Ta IdU ut av fryseren, og tine ved romtemperatur. Fortynn IdU i RPMI-1640 for å lage en arbeidsløsning ved en endelig konsentrasjon på 1 mM. Pipette opp og ned eller virvel å blande.<ol><li>Vanligvis fortynnes den konsentrerte IdU i mediet der cellene dyrkes (f.eks. DMEM, IMDM, etc.) eller har fortynnet den til PBS for tilsetni...

<ol>
	<li>Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+cellular+antigen+detection+by+ICP-MS.">Multiple cellular antigen detection by ICP-MS.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).</li><li>Ornatsky, O. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+cell+antigens+and+intracellular+DNA+by+identification+of+element-containing+labels+and+metallointercalators+using+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry.">Study of cell antigens and intracellular DNA by identification of element-containing labels and metallointercalators using inductively coupled plasma mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 80 (7), 2539-2547 (2008).</li><li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle.">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).</li><li>Raval, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversibility+of+Defective+Hematopoiesis+Caused+by+Telomere+Shortening+in+Telomerase+Knockout+Mice.">Reversibility of Defective Hematopoiesis Caused by Telomere Shortening in Telomerase Knockout Mice.</a> PLoS One. 10 (7), 0131722 (2015).</li><li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Cytometric+Functional+Profiling+of+Acute+Myeloid+Leukemia+Defines+Cell-Cycle+and+Immunophenotypic+Properties+That+Correlate+with+Known+Responses+to+Therapy.">Mass Cytometric Functional Profiling of Acute Myeloid Leukemia Defines Cell-Cycle and Immunophenotypic Properties That Correlate with Known Responses to Therapy.</a> Cancer Discovery. 5 (9), 988-1003 (2015).</li><li>Kimmey, S. C., Borges, L., Baskar, R., Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+analysis+of+tri-molecular+biosynthesis+with+cell+identity+and+function+in+single+cells.">Parallel analysis of tri-molecular biosynthesis with cell identity and function in single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1185 (2019).</li><li>Rabinovitch, P. S., Kubbies, M., Chen, Y. C., Schindler, D., Hoehn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU-Hoechst+flow+cytometry:+a+unique+tool+for+quantitative+cell+cycle+analysis.">BrdU-Hoechst flow cytometry: a unique tool for quantitative cell cycle analysis.</a> Experimental Cell Research. 174 (2), 309-318 (1988).</li><li>Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin+reduces+nonspecific+eosinophil+staining+artifacts+in+mass+cytometry+experiments.">Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments.</a> Cytometry A. 89 (6), 601-607 (2016).</li><li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis.">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e54394 (2017).</li><li>Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+by+Mass+Cytometry.">Immunophenotyping by Mass Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 2032, 31-51 (2019).</li><li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer.">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4398 (2012).</li><li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).</li><li>Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Web-based+analysis+and+publication+of+flow+cytometry+experiments.">Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments.</a> Current Protocols in Cytometry. , 17 (2010).</li><li>Devine, R. D., Sekhri, P., Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+storage+time+and+temperature+on+cell+cycle+analysis+by+mass+cytometry.">Effect of storage time and temperature on cell cycle analysis by mass cytometry.</a> Cytometry A. 93 (11), 1141-1149 (2018).</li><li>Campos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+immunological+markers+on+leukemic+cells+before+and+after+cryopreservation+and+thawing.">Expression of immunological markers on leukemic cells before and after cryopreservation and thawing.</a> Cryobiology. 25 (1), 18-22 (1988).</li><li>Kadic, E., Moniz, R. J., Huo, Y., Chi, A., Kariv, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cryopreservation+on+delineation+of+immune+cell+subpopulations+in+tumor+specimens+as+determinated+by+multiparametric+single+cell+mass+cytometry+analysis.">Effect of cryopreservation on delineation of immune cell subpopulations in tumor specimens as determinated by multiparametric single cell mass cytometry analysis.</a> BMC Immunology. 18 (1), 6 (2017).</li><li>Shabihkhani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+procurement,+storage,+and+quality+assurance+of+frozen+blood+and+tissue+biospecimens+in+pathology,+biorepository,+and+biobank+settings.">The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings.</a> Clinical Biochemistry. 47 (4-5), 258-266 (2014).</li></ol>

Eksemplene som presenteres her viser hvordan man bruker en MCM-plattform til å analysere cellesyklusfordeling. Det har også blitt påvist at cellesyklusanalyse er følsom for eksperimentelle forhold som tid og temperatur, noe som er en viktig vurdering forskere må ta når de vurderer MCM for deres cellesyklusanalyse14. Prøver som er lagret i en kort periode, ikke lenger enn en time, vil ha IdU-inkorporering som kan sammenlignes med deres normale tilstand. Prøver i et lukket system i lange per...

Massecytometri gjør det mulig å detektere ca. 40 parametere ved å utnytte massespektroskopiens høyoppløselige og kvantitative natur. Metallmerkede antistoffer brukes i stedet for fluoroforkonjugerte antistoffer som tillater et høyere antall kanaler og gir minimal spillover 1,2. MCM har fordeler og ulemper med hensyn til cellesyklusanalyse sammenlignet med flowcytometri. En stor fordel med MCM er at det store antallet parametere muliggjør samtidig måling av cellesyklustilstand over et stort antall immunfenotypisk distinkte T-celletyper i svært heterogene prøver. MCM har blitt brukt til å måle cellesyklustilstanden under normal hematopoiese i humant benmarg3 og transgene murine modeller av telomerasemangel4. Analyse av cellesyklustilstand ved akutt myelogen leukemi (AML) viste at cellesyklus korrelerte med kjente responser på kliniske terapier, noe som gir en in vivo innsikt i funksjonelle egenskaper som kan informere terapivalg5. En annen fordel med massecytometrisk cellesyklusanalyse er evnen til å måle et stort antall andre funksjonelle markører som kan være korrelert med cellesyklustilstand. Nylig arbeid har vært i stand til å korrelere protein- og RNA-syntese med cellesyklustilstand ved bruk av IdU og metallmerkede antistoffer mot BRU og rRNA6. Denne typen svært parametrisk analyse som måler cellesyklustilstand over mange populasjoner i et kontinuum av differensiering, ville være nesten umulig med dagens flowcytometriteknologi. Den største ulempen med MCM er mangelen på sammenlignbare DNA- eller RNA-flekker som de som brukes i fluorescerende flowcytometri (f.eks. DAPI, Hoechst, Pyronin Y, etc.). Fluorescerende fargestoffer kan gi relativt nøyaktige målinger av DNA- og RNA-innhold, men denne presisjonen er bare mulig på grunn av endringene i fluorescerende egenskaper av disse fargestoffene som oppstår ved interkalering mellom nukleotidbaser. MCM-analyse er dermed ikke i stand til å måle DNA- eller RNA-innhold med tilsvarende presisjon. I stedet er massecytometrisk cellesyklusanalyse avhengig av målinger av proteiner relatert til cellesyklustilstand som cyklin B1, fosforylert retinoblastomprotein (pRb) og fosforylert histon H3 (pHH3) kombinert med direkte måling av jodatomet fra IdU-inkorporering i S-faseceller. Disse to målemetodene gir svært like resultater under normal cellulær proliferasjon, men kan potensielt være uoverensstemmende når cellesyklusprogresjonen forstyrres.
Måling av antall celler i hver cellesyklusfase er viktig for å forstå normal cellesyklusutvikling samt cellesyklusforstyrrelser, som ofte observeres ved kreft og immunologiske sykdommer. MCM gir pålitelig måling av ekstracellulære og intracellulære faktorer ved bruk av metallmerkede antistoffer; Måling av S-fasen var imidlertid begrenset da den iridiumbaserte DNA-interkalatoren ikke klarte å skille mellom 2N og 4N DNA. For å definere cellesyklusfaser utviklet Behbehani en metode som benytter IdU med en masse på 127, som faller innenfor massecytometerets område og tillater direkte måling av celler i S-fase3. Denne direkte målingen omgår behovet for sekundære antistoffer eller bruk av DNA-denatureringsmidler som syre eller DNase. I forbindelse med intracellulære syklusmarkører tillater det høy oppløsning av cellesyklusfordeling i eksperimentelle modeller.
Denne protokollen tilpasser cellesyklusmålinger fra vanlige flowcytometriprotokoller for MCM. Våre metoder gir en praktisk og enkel måte å inkludere cellesyklusparametere på. IdU-inkorporering av in vitro-prøver krever bare 10 til 15 minutters inkubasjon ved 37 °C, noe som er kortere enn de fleste BrdU-fargeprotokoller som anbefaler inkubasjonstider på flere timer 3,7. IdU- og BrdU-inkorporerte prøver kan festes ved hjelp av en proteomisk stabilisator og deretter lagres i en fryser på -80 °C. Dette gjør at et stort antall IdU-fargede prøver kan arkiveres for batchanalyse uten reduksjon i prøvekvalitet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3059</td>
			<td>Component of CSM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td>Sample centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved-PARP (D214)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>F21-852</td>
			<td>Identification of apoptotic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclin B1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>GNS-1</td>
			<td>G2 Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Cryopreservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQ Four Element Calibration Beads</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201078</td>
			<td>Internal metal standard for CyTOF performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Tube w/ mesh strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td>Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Cell culture growth supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helios</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td>CyTOF System/Platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393</td>
			<td>Staining additive to prevent non-specific staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IdU (5-Iodo-2&#8242;-deoxyuridine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7125</td>
			<td>Incorporates in S-phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki-67</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>SolA15</td>
			<td>Confirmation of G0/G1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxPar Multi Label Kit</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201300</td>
			<td>Metal labeling kit, attaches metals to antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880023</td>
			<td>Mixing samples during staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201192</td>
			<td>Cell identification during CyTOF acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-H2AX (S139)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>JBW301</td>
			<td>Detection of DNA damage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-HH3 (S28)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>HTA28</td>
			<td>M-phase Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Wash solution for cell culture and component of fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Rb (S807/811)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>J112906</td>
			<td>G0/G1 Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteomic Stabilizer</td>
			<td>SmartTube Inc</td>
			<td>PROT1</td>
			<td>Sample fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21870-076</td>
			<td>Cell culture growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC447810250</td>
			<td>Component of CSM/Antibody buffer, biocide</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the pyrimidine analog, 5-iodo-2&prime;-deoxyuridine (idu) with cell cycle markers to establish cell cycle phases in a mass cytometry platform

Reguleringen av cellesyklusfase er et viktig aspekt ved cellulær proliferasjon og homeostase. Forstyrrelse av reguleringsmekanismene som styrer cellesyklusen er en funksjon av en rekke sykdommer, inkludert kreft. Studier av cellesyklusen nødvendiggjør evnen til å definere antall celler i hver del av cellesyklusprogresjonen, samt å tydelig avgrense mellom hver cellesyklusfase. Fremkomsten av massecytometri (MCM) gir et enormt potensial for enkeltcelleanalyse med høy gjennomstrømning gjennom direkte målinger av elementære isotoper, og utviklingen av en metode for å måle cellesyklustilstanden ved MCM utvider nytten av MCM ytterligere. Her beskriver vi en metode som direkte måler 5-jod-2'-deoksyuridin (IdU), tilsvarende 5-brom-2'-deoksyuridin (BrdU), i et MCM-system. Bruk av denne IdU-baserte MCM-en gir flere fordeler. For det første blir IdU raskt inkorporert i DNA under syntesen, noe som muliggjør pålitelig måling av celler i S-fasen med inkubasjoner så korte som 10-15 minutter. For det andre måles IdU uten behov for sekundære antistoffer eller behov for DNA-nedbrytning. For det tredje kan IdU-farging enkelt kombineres med måling av cyklin B1, fosforylert retinoblastomprotein (pRb) og fosforylert histon H3 (pHH3), som samlet gir klar avgrensning av de fem cellesyklusfasene. Kombinasjon av disse cellesyklusmarkørene med det høye antallet parametere som er mulig med MCM, tillater kombinasjon med mange andre beregninger.

Ved hjelp av HL-60-celler og et humant benmargsaspirat er det mulig å vise hvordan eksperimentelle forhold kan påvirke cellesyklusfordeling og analyse. Først må gating-strategien etableres for å demonstrere hvordan cellesyklusfasene er avledet. I figur 1 viser vi etableringen av singletporten, som er viktig for å separere cellulært rusk og dubletter, og etablere en enkeltcellepopulasjon. For cellelinjer er singletporten alt som trengs for å gå videre til cellesyklusanalyse (<strong ...

Watch this Scientific Journal Video about Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2Ã¢â‚¬Â²-Deoxyuridine IdU with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform at JoVE.com

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²-Deoxyuridine IdU with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

Denne protokollen tilpasser cellesyklusmålinger for bruk i en massecytometriplattform. Med multiparameteregenskapene til massecytometri tillater direkte måling av jodinkorporering identifisering av celler i S-fase mens intracellulære syklusmarkører muliggjør karakterisering av hver cellesyklustilstand under en rekke eksperimentelle forhold.

Bruk av pyrimidinanalog, 5-jod-2'-deoksyuridin (IdU) med cellesyklusmarkører for å etablere cellesyklusfaser i en massecytometriplattform

The regulation of cell cycle phase is an important aspect of cellular proliferation and homeostasis. Disruption of the regulatory mechanisms governing the ...

Denne protokollen tillater oss å undersøke cellesyklusen på enkeltcellenivå ved hjelp av massecytometeret, og dette gjør det mulig å utføre flere nye undersøkelser og kliniske studier. Den største fordelen med denne teknikken er dens enkelhet. IdU tilsettes direkte til cellene, og det er ikke behov for ytterligere behandling eller antistoffer.Vi har brukt denne teknikken til å undersøke cellesyklustilstanden hos pasienter med akutt myelogen leukemi i stam- og stamcellerommene. Og dette viste at cellesyklusegenskapene til disse spesifikke celletyper kan korrelere med det kliniske utfallet av pasienter med disse sykdommene. Denne teknikken kan være nyttig for å forstå vekstegenskapene til sjeldne kreftceller og forstå spredning av immuncelleundergrupper.Før og etter tilsetning av IdU til celleprøvene, oppretthold cellene i vekstbetingelsene av interesse. I dette tilfellet, en fuktet 37 grader Celsius-inkubator ved 5% CO2 for å merke cellene med IdU, fortynn den konsentrerte IdU-stamløsningen en til 50 i vekstmediet til cellene. Overfør deretter prøvene til en biosikkerhetshette og tilsett 10 mikroliter av en millimolar IdU til hver milliliter celler.Returner cellene til inkubatoren i 10 til 15 minutter før du overfører prøvene til individuelle koniske rør. Samle cellene ved sentrifugering i 15 milliliter koniske rør og resuspendere pellets i 200 mikroliter PBS per rør. Merk om nødvendig cellene med en passende levende / død flekk for å markere de døde cellene.Etter levende / død flekk, slukket cellene med media vasket med CSM før du fikserer cellene med 25 mikroliter 16% paraformaldehyd. Etter en 10 minutters inkubasjon ved romtemperatur, samle cellene ved sentrifugering. Tilsett fem til 15 milliliter CSM og sentrifuge igjen.Resuspender pellets i 500 mikroliter cellefargemedium tilsatt 10% dimetylsulfoksid. Overfør deretter cellene til mindre rør for å lagre dem i negative 80 grader Celsius. For å normalisere for cellesyklusanalysen, importer filene til et passende program for flowcytometrianalyse og lag et biaksialt plott av hendelseslengden versus 191 iridium.Cellene vil danne en distinkt lys iridium høy populasjon. Endre skalaen for hendelseslengde for å gjøre cellene mer fremtredende. Deretter oppretter du en singletport for å ekskludere 50 til 60 % av dublettene og ruskene, og angir de gjenværende og forskyvde gaussparametrene for å fjerne eventuelle gjenværende dubletter og rusk.For å angi S-faseporten, opprett et biaksialt plott av IdU kontra en spredningsmarkør. IdU-positive celler i S-fase vil danne en distinkt populasjon. For G0 / G1 og G2 / M gating, etablere portene på en IdU versus Cyclin B1 tomt.G0/G1-fasen vil være syklin B1 lav, IdU-negativ, og G2/M-fasen vil være syklin B1 høy, IdU-negativ. For å gate for bestemte celletyper, plott bare S-fasecellene på Cyclin B1 versus IdU-grafen for å bidra til å etablere separasjonen mellom G0 / G1 fase og G2 / M faseceller. Tegn en port rundt Cyclin B1 høy befolkning.I noen tilfeller kan dette være vanskelig å skjelne, men nivået av syklin B1 på omtrent topp 5% av S-fasepopulasjonen er vanligvis bruddpunktet mellom G0 / G1 og G2 / M-faseportene. Cellene som bor innenfor den forrige porten vil være populasjonen i G2/M-fasen, mens resten vil være populasjonen i G0/G1-fasen. For å etablere G0-fasepopulasjonen, opprett et fosforylert retinoblastomprotein versus IdU-plott.G0-fasen vil bli representert av en fosforylert retinoblastomprotein lav, IdU-negativ populasjon. Siden den aktive syklingspopulasjonen vil demonstrere et høyt fosforylert retinoblastomprotein og IdU-inkorporering, kan G0-faseporten trekkes på denne grensen som den vanligvis uttrykker ved to forskjellige populasjoner. Hvis G0-porten er vanskelig å definere, gjør S-fasepopulasjonen til den aktive populasjonen og tegne en port som inneholder de øverste 90 til 100% av den fosforylerte retinoblastomproteinhøypopulasjonen.Den fosforylerte retinoblastomprotein-lave populasjonen utenfor porten er typisk G0-populasjonen, mens G0 / G1-cellene med pRb-nivåer som faller i denne porten er G1-celler. For M-fase gating, opprett en IdU versus fosforylert histon H3 ved aksial plot. M-fasefasen vil bli observert som den svært lille fraksjonen av celler i den fosforylerte histon-H3-populasjonen.Cellene i G2 / M-populasjonen med lavere nivåer av pHH3 er G2-cellene. Hvis IdU-inkorporering mislyktes eller ikke var mulig, definer sykling og ikke sykling cellefraksjoner ved bruk av Ki67 og fosforylert retinoblastomprotein. Den doble positive populasjonen vil representere den aktive sykkelpopulasjonen som korrelerer med G1-, S-, G2- og M-fasene.Den doble lave populasjonen vil representere den ikke-syklende befolkningen som korrelerer med G0-fasen. Når alle portene er etablert, eksporterer du de numeriske verdiene fra portene. Prosentandelene i hver syklus kan oppnås ved å trekke de enkelte populasjonene fra de kombinerte populasjonene for å generere numeriske verdier for hver enkelt cellesyklusfase for påfølgende grafer og statistisk analyse.Etableringen av singletporten er viktig for å separere cellulært rusk og dubletter for å tillate isolering av enkeltcellepopulasjonen. Cellesyklusanalyse av enkeltcellene kan deretter utføres. IdU-merking og dermed nedstrøms cellesyklusanalyse kan påvirkes betydelig av tid og temperatur.For eksempel vil celler som forblir for lenge i lukkede beholdere eller i transport mellom steder, ha reduserte S-fasefraksjoner, og det vil ikke være nøyaktig for cellesyklusanalyse. Celleprøver holdt i korte perioder på en time eller mindre viser fortsatt en normal cellesyklusfordeling, noe som indikerer at en rask transport kanskje ikke påvirker analysen negativt. Kryopreserverte celler kan kreve en lang likevektsperiode før cellene går tilbake til aktiv cellesyklus, noe som fortsatt ikke kan gjenspeile cellesyklustilstanden før kryopreservering.Ulike celletyper kan også påvirkes ulikt av vedlikeholdsforhold. For eksempel, i denne humane benmargsprøven, viste T-cellene en reduksjon i antall celler sammenlignet med monoblaster fra samme prøve. En annen fordel med massecytometri er evnen til å diskriminere celler i cellesyklusarrest eller som har en unormal cellesyklusfordeling.En stor fordel med denne teknikken er at den er lett kompatibel med andre massecytometrimålinger som overflatefenotyping, kromatinstruktur, intracellulær cytokinstimulering, som kan korreleres med cellesyklustilstand. Vi har brukt denne teknikken til å studere immuncelleutmattelse, aldring, og for å vise at responsen på kjemoterapi hos pasienter med akutt leukemi kan korrelere med cellesyklusegenskapene til leukemicellene.

Research

JoVE Journal

Genetics

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2&prime;-Deoxyuridine (IdU) with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Høy gjennomstrømming robot pasning Isolering av temperaturfølsomme Lethal Mutanter i<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Oppdrett og Double-stranded RNA-mediert Gene knockdown i Hide Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning av Kopier nummer Endringer Bruke enkelt celle Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Ved hjelp av en Fluorescent PCR-kapillar-gelelektroforese teknikken for å genotype CRISPR / Cas9-mediert knockout-mutanter i en high-throughput-format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Studier av celle-regulert genuttrykk av to komplementære cellesynkroniseringsprotokoller

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profilering DNA replikering Timing bruker sebrafisk som en In Vivo modellsystem

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Kandidaten Gene Testing i klinisk Kohortstudier multiplex genotyperingteknologi og massespektrometri

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

En kombinasjon encellede tilnærming som karakteriserer den molekylære og Immunophenotypic heterogenitet menneskelige stammen og stamfar bestander

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Bruke i Vitro og i celle form å undersøke små molekyl indusert Pre-mRNA strukturelle endringer

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

Bruk av mus melke tumor celler i en in vitro Invasion analysen som et mål på kreftfremkallende Cell Behavior

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...