Name: use of the pyrimidine analog, 5-iodo-2&prime;-deoxyuridine (idu) with cell cycle markers to establish cell cycle phases in a mass cytometry platform
Uploaded: 2021-10-22T13:00:00
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Os autores gostariam de agradecer os esforços de Palak Sekhri, Hussam Alkhalaileh, Hsiaochi Chang e Justin Lyeberger por seu apoio experimental. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Bolsas Pelotonia. Quaisquer opiniões, descobertas e conclusões expressas neste material são do(s) autor(es) e não refletem necessariamente as do Programa de Bolsas Pelotonia."

1. Preparação das existências de IdU
<ol><li>Dissolver 5-iodo-2'-desoxiuridina (IdU) em DMSO até uma concentração de 50 mM. Filtro estéril, alíquota em tubos de 10-50 μL e conservar a -80 °C</li>
	<li>Retire o IdU do congelador e descongele à temperatura ambiente. Diluir IdU em RPMI-1640 para fazer uma solução de trabalho a uma concentração final de 1 mM. Pipetar para cima e para baixo ou vórtice para misturar.<ol><li>Normalmente, diluir o IdU concentrado no meio em que as células estão sendo cultivad...

<ol>
	<li>Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+cellular+antigen+detection+by+ICP-MS.">Multiple cellular antigen detection by ICP-MS.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).</li><li>Ornatsky, O. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+cell+antigens+and+intracellular+DNA+by+identification+of+element-containing+labels+and+metallointercalators+using+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry.">Study of cell antigens and intracellular DNA by identification of element-containing labels and metallointercalators using inductively coupled plasma mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 80 (7), 2539-2547 (2008).</li><li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle.">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).</li><li>Raval, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversibility+of+Defective+Hematopoiesis+Caused+by+Telomere+Shortening+in+Telomerase+Knockout+Mice.">Reversibility of Defective Hematopoiesis Caused by Telomere Shortening in Telomerase Knockout Mice.</a> PLoS One. 10 (7), 0131722 (2015).</li><li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Cytometric+Functional+Profiling+of+Acute+Myeloid+Leukemia+Defines+Cell-Cycle+and+Immunophenotypic+Properties+That+Correlate+with+Known+Responses+to+Therapy.">Mass Cytometric Functional Profiling of Acute Myeloid Leukemia Defines Cell-Cycle and Immunophenotypic Properties That Correlate with Known Responses to Therapy.</a> Cancer Discovery. 5 (9), 988-1003 (2015).</li><li>Kimmey, S. C., Borges, L., Baskar, R., Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+analysis+of+tri-molecular+biosynthesis+with+cell+identity+and+function+in+single+cells.">Parallel analysis of tri-molecular biosynthesis with cell identity and function in single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1185 (2019).</li><li>Rabinovitch, P. S., Kubbies, M., Chen, Y. C., Schindler, D., Hoehn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU-Hoechst+flow+cytometry:+a+unique+tool+for+quantitative+cell+cycle+analysis.">BrdU-Hoechst flow cytometry: a unique tool for quantitative cell cycle analysis.</a> Experimental Cell Research. 174 (2), 309-318 (1988).</li><li>Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin+reduces+nonspecific+eosinophil+staining+artifacts+in+mass+cytometry+experiments.">Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments.</a> Cytometry A. 89 (6), 601-607 (2016).</li><li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis.">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e54394 (2017).</li><li>Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+by+Mass+Cytometry.">Immunophenotyping by Mass Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 2032, 31-51 (2019).</li><li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer.">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4398 (2012).</li><li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).</li><li>Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Web-based+analysis+and+publication+of+flow+cytometry+experiments.">Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments.</a> Current Protocols in Cytometry. , 17 (2010).</li><li>Devine, R. D., Sekhri, P., Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+storage+time+and+temperature+on+cell+cycle+analysis+by+mass+cytometry.">Effect of storage time and temperature on cell cycle analysis by mass cytometry.</a> Cytometry A. 93 (11), 1141-1149 (2018).</li><li>Campos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+immunological+markers+on+leukemic+cells+before+and+after+cryopreservation+and+thawing.">Expression of immunological markers on leukemic cells before and after cryopreservation and thawing.</a> Cryobiology. 25 (1), 18-22 (1988).</li><li>Kadic, E., Moniz, R. J., Huo, Y., Chi, A., Kariv, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cryopreservation+on+delineation+of+immune+cell+subpopulations+in+tumor+specimens+as+determinated+by+multiparametric+single+cell+mass+cytometry+analysis.">Effect of cryopreservation on delineation of immune cell subpopulations in tumor specimens as determinated by multiparametric single cell mass cytometry analysis.</a> BMC Immunology. 18 (1), 6 (2017).</li><li>Shabihkhani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+procurement,+storage,+and+quality+assurance+of+frozen+blood+and+tissue+biospecimens+in+pathology,+biorepository,+and+biobank+settings.">The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings.</a> Clinical Biochemistry. 47 (4-5), 258-266 (2014).</li></ol>

Os exemplos aqui apresentados demonstram como usar uma plataforma MCM para analisar a distribuição do ciclo celular. Também foi demonstrado que a análise do ciclo celular é sensível a condições experimentais como tempo e temperatura, o que é uma consideração importante que os pesquisadores devem ter ao considerar a MCM para sua análise do ciclo celular14. As amostras deixadas em armazenamento por um curto período de tempo, não superior a uma hora, terão incorporação de IdU compar?...

A citometria de massa permite a detecção de aproximadamente 40 parâmetros, aproveitando a alta resolução e a natureza quantitativa da espectroscopia de massas. Anticorpos marcados com metais são usados em vez de anticorpos conjugados com fluoróforos que permitem um maior número de canais e produzem mínimo spillover 1,2. A MCM apresenta vantagens e desvantagens em relação à análise do ciclo celular em comparação à citometria de fluxo. Uma grande vantagem da MCM é que o grande número de parâmetros permite a medição simultânea do estado do ciclo celular em um grande número de tipos de células T imunofenotipicamente distintos em amostras altamente heterogêneas. A MCM tem sido usada com sucesso para medir o estado do ciclo celular durante a hematopoese normal na medula óssea humana3 e modelos murinos transgênicos de deficiência de telomerase4. A análise do estado do ciclo celular na leucemia mieloide aguda (LMA) mostrou que o ciclo celular correlacionou-se com respostas conhecidas a terapias clínicas, fornecendo uma visão in vivo das características funcionais que podem informar as seleções terapêuticas5. Uma segunda vantagem da análise do ciclo celular por citometria de massa é a capacidade de medir um grande número de outros marcadores funcionais que podem ser correlacionados com o estado do ciclo celular. Trabalhos recentes têm sido capazes de correlacionar a síntese de proteínas e RNA com o estado do ciclo celular através do uso de anticorpos marcados com IdU e metal para BRU e rRNA6. Esse tipo de análise altamente paramétrica medindo o estado do ciclo celular em várias populações em um continuum de diferenciação seria quase impossível com a tecnologia atual de citometria de fluxo. A principal desvantagem da MCM é a falta de colorações de DNA ou RNA comparáveis às usadas em citometria de fluxo fluorescente (por exemplo, DAPI, Hoechst, Pyronin Y, etc.). Corantes fluorescentes podem fornecer medidas relativamente precisas do conteúdo de DNA e RNA, mas essa precisão só é possível devido às mudanças nas propriedades fluorescentes desses corantes que ocorrem na intercalação entre bases nucleotídicas. A análise de MCM é, portanto, incapaz de medir o conteúdo de DNA ou RNA com precisão semelhante. Em vez disso, a análise do ciclo celular por citometria de massa baseia-se em medições de proteínas relacionadas ao estado do ciclo celular, como ciclina B1, proteína de retinoblastoma fosforilado (pRb) e histona H3 fosforilada (pHH3) combinadas com a medição direta do átomo de iodo da incorporação de IdU em células de fase S. Essas duas abordagens de medição produzem resultados altamente semelhantes durante a proliferação celular normal, mas podem ser potencialmente discordantes quando a progressão do ciclo celular é interrompida.
A medição do número de células em cada fase do ciclo celular é importante para entender o desenvolvimento normal do ciclo celular, bem como a interrupção do ciclo celular, que é comumente observada em cânceres e doenças imunológicas. MCM fornece medição confiável de fatores extracelulares e intracelulares usando anticorpos marcados com metal; no entanto, a medição da fase S foi limitada, pois o intercalador de DNA baseado em irídio foi incapaz de diferenciar entre DNA 2N e 4N. Para definir as fases do ciclo celular, Behbehani desenvolveu um método que utiliza IdU com massa de 127, que se enquadra na faixa do citômetro de massa e permite a medição direta de células na fase S3. Essa medição direta contorna a necessidade de anticorpos secundários ou o uso de agentes desnaturantes do DNA, como ácido ou DNase. Em conjunto com marcadores de ciclagem intracelular, permite alta resolução da distribuição do ciclo celular em modelos experimentais.
Este protocolo adapta medidas do ciclo celular de protocolos comuns de citometria de fluxo para MCM. Nossos métodos fornecem uma maneira conveniente e simples de incluir parâmetros do ciclo celular. A incorporação de amostras in vitro por IdU requer apenas 10 a 15 minutos de incubação a 37 °C, o que é mais curto do que a maioria dos protocolos de coloração de BrdU, que recomendam tempos de incubação de várias horas 3,7. As amostras incorporadas de IdU e BrdU podem ser fixadas usando um estabilizador proteômico e, em seguida, armazenadas por algum tempo em um freezer de -80 °C. Isso permite que um grande número de amostras coradas com IdU seja arquivado para análise em lote sem redução na qualidade da amostra.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3059</td>
			<td>Component of CSM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td>Sample centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved-PARP (D214)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>F21-852</td>
			<td>Identification of apoptotic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclin B1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>GNS-1</td>
			<td>G2 Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Cryopreservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQ Four Element Calibration Beads</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201078</td>
			<td>Internal metal standard for CyTOF performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Tube w/ mesh strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td>Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Cell culture growth supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helios</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td>CyTOF System/Platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393</td>
			<td>Staining additive to prevent non-specific staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IdU (5-Iodo-2&#8242;-deoxyuridine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7125</td>
			<td>Incorporates in S-phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki-67</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>SolA15</td>
			<td>Confirmation of G0/G1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxPar Multi Label Kit</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201300</td>
			<td>Metal labeling kit, attaches metals to antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880023</td>
			<td>Mixing samples during staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201192</td>
			<td>Cell identification during CyTOF acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-H2AX (S139)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>JBW301</td>
			<td>Detection of DNA damage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-HH3 (S28)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>HTA28</td>
			<td>M-phase Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Wash solution for cell culture and component of fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Rb (S807/811)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>J112906</td>
			<td>G0/G1 Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteomic Stabilizer</td>
			<td>SmartTube Inc</td>
			<td>PROT1</td>
			<td>Sample fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21870-076</td>
			<td>Cell culture growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC447810250</td>
			<td>Component of CSM/Antibody buffer, biocide</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the pyrimidine analog, 5-iodo-2&prime;-deoxyuridine (idu) with cell cycle markers to establish cell cycle phases in a mass cytometry platform

A regulação da fase do ciclo celular é um aspecto importante da proliferação celular e da homeostase. A interrupção dos mecanismos regulatórios que regem o ciclo celular é uma característica de uma série de doenças, incluindo o câncer. O estudo do ciclo celular requer a capacidade de definir o número de células em cada porção da progressão do ciclo celular, bem como delinear claramente entre cada fase do ciclo celular. O advento da citometria de massa (MCM) fornece um enorme potencial para análise de célula única de alto rendimento através de medições diretas de isótopos elementares, e o desenvolvimento de um método para medir o estado do ciclo celular por MCM amplia ainda mais a utilidade da MCM. Descrevemos aqui um método que mede diretamente a 5-iodo-2′-desoxiuridina (IdU), semelhante à 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU), em um sistema MCM. O uso desse MCM baseado em IdU oferece várias vantagens. Primeiro, o IdU é rapidamente incorporado ao DNA durante sua síntese, permitindo a medição confiável de células na fase S com incubações tão curtas quanto 10-15 minutos. Em segundo lugar, o IdU é medido sem a necessidade de anticorpos secundários ou a necessidade de degradação do DNA. Terceiro, a coloração de IdU pode ser facilmente combinada com a medição de ciclina B1, proteína fosforilada de retinoblastoma (pRb) e histona fosforilada H3 (pHH3), que coletivamente fornece delineamento claro das cinco fases do ciclo celular. A combinação desses marcadores de ciclo celular com o alto número de parâmetros possíveis com a MCM permite a combinação com inúmeras outras métricas.

Utilizando células HL-60 e um aspirado de medula óssea humana é possível mostrar como as condições experimentais podem afetar a distribuição e análise do ciclo celular. Primeiro, a estratégia de gating deve ser estabelecida para demonstrar como as fases do ciclo celular são derivadas. Na Figura 1 mostramos o estabelecimento da porta singlete, que é importante na separação de restos celulares e duplos, estabelecendo uma população de células únicas. Para linhagens celulares, ...

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Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²-Deoxyuridine IdU with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

Este protocolo adapta medidas do ciclo celular para uso em uma plataforma de citometria de massa. Com as capacidades multiparamétricas da citometria de massa, a medição direta da incorporação de iodo permite a identificação de células em fase S, enquanto marcadores de ciclagem intracelular permitem a caracterização de cada estado do ciclo celular em uma variedade de condições experimentais.

Uso do Análogo da Pirimidina 5-Iodo-2′-Desoxiuridina (IdU) com Marcadores do Ciclo Celular para Estabelecer Fases do Ciclo Celular em uma Plataforma de Citometria de Massa

The regulation of cell cycle phase is an important aspect of cellular proliferation and homeostasis. Disruption of the regulatory mechanisms governing the ...

Este protocolo nos permite examinar o ciclo celular em nível de célula única usando o citômetro de massa, e isso permite que várias pesquisas e estudos clínicos novos sejam realizados. A principal vantagem desta técnica é a sua simplicidade. IdU é adicionado diretamente às células e não há necessidade de tratamento adicional ou anticorpos.Usamos essa técnica para investigar o estado do ciclo celular em pacientes com leucemia mieloide aguda dentro dos compartimentos das células-tronco e progenitoras. E isso demonstrou que as propriedades do ciclo celular desses tipos celulares específicos podem se correlacionar com o desfecho clínico de pacientes com essas doenças. Esta técnica pode ser útil para compreender as propriedades de crescimento de células cancerosas raras e compreender a proliferação de subgrupos de células imunes.Antes e depois de adicionar IdU às amostras celulares, manter as células nas condições de crescimento de interesse. Neste caso, uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius a 5% de CO2 para marcar as células com IdU, dilui a solução estoque de IdU concentrada de um a 50 no meio de crescimento das células. Em seguida, transfira as amostras para uma coifa de biossegurança e adicione 10 microlitros de IdU milimolar a cada mililitro de células.Retornar as células à incubadora por 10 a 15 minutos antes de transferir as amostras para tubos cônicos individuais. Coletar as células por centrifugação em tubos cônicos de 15 mililitros e ressuspender os pellets em 200 microlitros de PBS por tubo. Se necessário, rotule as células com uma coloração viva/morta apropriada para marcar as células mortas.Após coloração viva/morta, as células foram extintas com meio lavado com MSC antes de fixar as células com 25 microlitros de paraformaldeído a 16%. Após 10 minutos de incubação à temperatura ambiente, coletar as células por centrifugação. Adicione de cinco a 15 mililitros de CSM e centrífuga novamente.Ressuspender os pellets em 500 microlitros de meio corante celular suplementado com 10% de dimetilsulfóxido. Em seguida, transfira as células para tubos menores para armazená-las em 80 graus Celsius negativos. Para normalizar a análise do ciclo celular, importe os arquivos para um programa de software de análise de citometria de fluxo apropriado e crie um gráfico biaxial do comprimento do evento versus 191 irídio.As células formarão uma população distinta de irídio brilhante alto. Altere a escala de comprimento do evento para que as células pareçam mais proeminentes. Em seguida, crie um portão singlet para excluir 50 a 60% dos duplos e detritos e defina os parâmetros gaussianos residuais e deslocados para remover quaisquer duplos e detritos restantes.Para definir a porta da fase S, crie um gráfico biaxial de IdU versus um marcador de proliferação. As células IdU positivas em fase S formarão uma população distinta. Para G0/G1 e G2/M, estabeleça os portões em um gráfico IdU versus Cyclin B1.A fase G0/G1 será Ciclina B1 baixa, IdU negativa, e a fase G2/M será Ciclina B1 alta, IdU negativa. Para atender a tipos de células específicos, plote apenas as células de fase S no gráfico de ciclina B1 versus IdU para ajudar a estabelecer a separação entre as células de fase G0/G1 e as células de fase G2/M. Desenhe um portão em torno da alta população da ciclina B1.Em alguns casos, isso pode ser difícil de discernir, mas o nível de ciclina B1 de aproximadamente 5% da população da fase S é tipicamente o ponto de interrupção entre as portas de fase G0/G1 e G2/M. As células residentes dentro do portão anterior serão a população da fase G2/M, enquanto o restante será a população da fase G0/G1. Para estabelecer a população da fase G0, crie uma proteína de retinoblastoma fosforilada versus gráfico de IdU.A fase G0 será representada por uma população de baixa proteína de retinoblastoma fosforilada, IdU negativa. Como a população cicladora ativa demonstrará uma alta incorporação de proteína de retinoblastoma fosforilada e IdU, a porta de fase G0 pode ser desenhada neste limite, pois tipicamente se expressa em duas populações distintas. Se o portão G0 for difícil de definir, faça da população da fase S a população ativa e desenhe um portão incorporando os 90 a 100% superiores da proteína de retinoblastoma fosforilado alta população.A baixa população da proteína fosforilada do retinoblastoma fora do portão é tipicamente a população G0, enquanto as células G0/G1 com níveis de pRb que caem nesse portão são células G1. Para gating de fase M, crie um IdU versus histona fosforilada H3 por gráfico axial. A fase M será observada como a fração muito pequena de células dentro da população de histona H3 fosforilada.As células da população G2/M com menores níveis de pHH3 são as células G2. Se a incorporação de IdU falhou ou não foi possível, defina a ciclagem e não ciclagem das frações celulares usando Ki67 e proteína retinoblastoma fosforilada. A população duplamente positiva representará a população ciclável ativa correlacionando-se com as fases G1, S, G2 e M.A dupla população baixa representará a população não ciclável correlacionando-se com a fase G0. Uma vez que todos os portões tenham sido estabelecidos, exporte os valores numéricos dos portões. As porcentagens em cada ciclo podem ser obtidas subtraindo-se as populações individuais das populações combinadas para gerar valores numéricos para cada fase do ciclo celular individual para posterior análise gráfica e estatística.O estabelecimento da porta singlete é importante para separar os debris celulares e duplos para permitir o isolamento da população unicelular. A análise do ciclo celular das células individuais pode então ser realizada. A marcação de IdU e, portanto, a análise do ciclo celular a jusante podem ser significativamente afetadas pelo tempo e temperatura.Por exemplo, células que permanecem muito tempo em vasos fechados ou em transporte entre locais terão frações de fase S reduzidas e isso não será preciso para a análise do ciclo celular. Amostras celulares mantidas por curtos períodos de uma hora ou menos ainda demonstram uma distribuição normal do ciclo celular, indicando que um transporte rápido pode não impactar negativamente a análise. As células criopreservadas podem requerer um longo período de equilíbrio antes que as células retornem à ciclagem celular ativa, o que ainda pode não refletir o estado do ciclo celular pré-criopreservação.Diferentes tipos celulares também podem ser afetados diferencialmente pelas condições de manutenção. Por exemplo, nesta amostra de medula óssea humana, as células T demonstraram uma redução no número de células em comparação com os monoblastos da mesma amostra. Outro benefício da citometria de massa é a capacidade de discriminar células em parada do ciclo celular ou que têm uma distribuição anormal do ciclo celular.Uma grande vantagem desta técnica é que é facilmente compatível com outras medidas de citometria de massa, como fenotipagem de superfície, estrutura da cromatina, estimulado de citocinas intracelulares, que podem ser correlacionadas com o estado do ciclo celular. Usamos essa técnica para estudar a exaustão das células imunes, a senescência e mostrar que a resposta à quimioterapia em pacientes com leucemia aguda pode se correlacionar com as propriedades do ciclo celular das células leucêmicas.

Research

JoVE Journal

Genetics

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2&prime;-Deoxyuridine (IdU) with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Alto Throughput Robotically Isolamento Assistida da temperatura sensível Lethal Mutantes em<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Genética

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Criação e Double-stranded mediada por RNA silenciamento de genes na Esconder Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detecção de Copy Number Alterações Usando Sequencing única célula

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Usando uma técnica de PCR fluorescente-capilar Electroforese em Gel de genótipo CRISPR / cas9 mediada KO mutantes em um formato de elevado rendimento

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Estudo da Expressão de Genes Reguladores do Ciclo Celular por dois Protocolos Complementares de Sincronização Celular

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Sincronismo de replicação de DNA usando Zebrafish como um sistema modelo In Vivo de criação de perfil

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Gene candidato teste em estudos de coorte clínica com genotipagem multiplexada e espectrometria de massa

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Uma combinatória célula única abordagem para caracterizar o Molecular e imunofenotípica heterogeneidade de tronco humano e populações de Progenitor

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Usando em forma de Vitro e na célula para investigar a pequena molécula induzida por alterações estruturais Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

O uso de células tumorais do rato mamário em um ensaio de invasão in vitro como medida de comportamento de células oncogênicas

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...