Name: use of the pyrimidine analog, 5-iodo-2&prime;-deoxyuridine (idu) with cell cycle markers to establish cell cycle phases in a mass cytometry platform
Uploaded: 2021-10-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2Ã¢â‚¬Â²-Deoxyuridine IdU with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Палака Сехри, Хусама Алхалайле, Сяочи Чанга и Джастина Либергера за их экспериментальную поддержку. Эта работа была поддержана Программой стипендий Pelotonia. Любые мнения, выводы и заключения, выраженные в этом материале, принадлежат автору (авторам) и не обязательно отражают мнения Программы стипендий Pelotonia».

1. Подготовка запасов IdU
<ol><li>Растворить 5-йодо-2'-дезоксиуридин (IdU) в ДМСО до концентрации 50 мМ. Стерильный фильтр аликвотировать в пробирки по 10-50 мкл и хранить при температуре -80 °C</li>
	<li>Достаньте IdU из морозильной камеры и разморозьте при комнатной температуре. Разбавьте IdU в RPMI-1640, чтобы...

<ol>
	<li>Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+cellular+antigen+detection+by+ICP-MS.">Multiple cellular antigen detection by ICP-MS.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).</li><li>Ornatsky, O. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+cell+antigens+and+intracellular+DNA+by+identification+of+element-containing+labels+and+metallointercalators+using+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry.">Study of cell antigens and intracellular DNA by identification of element-containing labels and metallointercalators using inductively coupled plasma mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 80 (7), 2539-2547 (2008).</li><li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle.">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).</li><li>Raval, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversibility+of+Defective+Hematopoiesis+Caused+by+Telomere+Shortening+in+Telomerase+Knockout+Mice.">Reversibility of Defective Hematopoiesis Caused by Telomere Shortening in Telomerase Knockout Mice.</a> PLoS One. 10 (7), 0131722 (2015).</li><li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Cytometric+Functional+Profiling+of+Acute+Myeloid+Leukemia+Defines+Cell-Cycle+and+Immunophenotypic+Properties+That+Correlate+with+Known+Responses+to+Therapy.">Mass Cytometric Functional Profiling of Acute Myeloid Leukemia Defines Cell-Cycle and Immunophenotypic Properties That Correlate with Known Responses to Therapy.</a> Cancer Discovery. 5 (9), 988-1003 (2015).</li><li>Kimmey, S. C., Borges, L., Baskar, R., Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+analysis+of+tri-molecular+biosynthesis+with+cell+identity+and+function+in+single+cells.">Parallel analysis of tri-molecular biosynthesis with cell identity and function in single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1185 (2019).</li><li>Rabinovitch, P. S., Kubbies, M., Chen, Y. C., Schindler, D., Hoehn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU-Hoechst+flow+cytometry:+a+unique+tool+for+quantitative+cell+cycle+analysis.">BrdU-Hoechst flow cytometry: a unique tool for quantitative cell cycle analysis.</a> Experimental Cell Research. 174 (2), 309-318 (1988).</li><li>Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin+reduces+nonspecific+eosinophil+staining+artifacts+in+mass+cytometry+experiments.">Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments.</a> Cytometry A. 89 (6), 601-607 (2016).</li><li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis.">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e54394 (2017).</li><li>Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+by+Mass+Cytometry.">Immunophenotyping by Mass Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 2032, 31-51 (2019).</li><li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer.">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4398 (2012).</li><li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).</li><li>Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Web-based+analysis+and+publication+of+flow+cytometry+experiments.">Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments.</a> Current Protocols in Cytometry. , 17 (2010).</li><li>Devine, R. D., Sekhri, P., Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+storage+time+and+temperature+on+cell+cycle+analysis+by+mass+cytometry.">Effect of storage time and temperature on cell cycle analysis by mass cytometry.</a> Cytometry A. 93 (11), 1141-1149 (2018).</li><li>Campos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+immunological+markers+on+leukemic+cells+before+and+after+cryopreservation+and+thawing.">Expression of immunological markers on leukemic cells before and after cryopreservation and thawing.</a> Cryobiology. 25 (1), 18-22 (1988).</li><li>Kadic, E., Moniz, R. J., Huo, Y., Chi, A., Kariv, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cryopreservation+on+delineation+of+immune+cell+subpopulations+in+tumor+specimens+as+determinated+by+multiparametric+single+cell+mass+cytometry+analysis.">Effect of cryopreservation on delineation of immune cell subpopulations in tumor specimens as determinated by multiparametric single cell mass cytometry analysis.</a> BMC Immunology. 18 (1), 6 (2017).</li><li>Shabihkhani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+procurement,+storage,+and+quality+assurance+of+frozen+blood+and+tissue+biospecimens+in+pathology,+biorepository,+and+biobank+settings.">The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings.</a> Clinical Biochemistry. 47 (4-5), 258-266 (2014).</li></ol>

Представленные здесь примеры демонстрируют, как использовать платформу MCM для анализа распределения клеточного цикла. Также было продемонстрировано, что анализ клеточного цикла чувствителен к экспериментальным условиям, таким как время и температура, что является важным соображение...

Масс-цитометрия позволяет обнаруживать около 40 параметров, используя преимущества высокого разрешения и количественного характера масс-спектроскопии. Антитела, меченные металлами, используются вместо флуорофорных конъюгированных антител, которые допускают большее количество каналов и производят минимальный побочный эффект 1,2. MCM имеет преимущества и недостатки в отношении анализа клеточного цикла по сравнению с проточной цитометрией. Одним из основных преимуществ MCM является то, что большое количество параметров позволяет одновременно измерять состояние клеточного цикла в большом количестве иммунофенотипически различных типов Т-клеток в очень гетерогенных образцах. MCM успешно используется для измерения состояния клеточного цикла при нормальном кроветворении в костном мозгечеловека 3 и трансгенных мышиных моделях дефицита теломеразы4. Анализ состояния клеточного цикла при остром миелоидном лейкозе (ОМЛ) показал, что клеточный цикл коррелирует с известными реакциями на клиническую терапию, обеспечивая понимание in vivo функциональных характеристик, которые могут информировать о выборе терапии5. Вторым преимуществом массового цитометрического анализа клеточного цикла является возможность измерения большого количества других функциональных маркеров, которые могут быть коррелированы с состоянием клеточного цикла. Недавняя работа смогла коррелировать синтез белка и РНК с состоянием клеточного цикла с помощью IdU и меченных металлами антител к BRU и рРНК6. Такой высокопараметрический анализ, измеряющий состояние клеточного цикла в многочисленных популяциях в континууме дифференцировки, был бы практически невозможен с современной технологией проточной цитометрии. Основным недостатком MCM является отсутствие сопоставимых красителей ДНК или РНК, используемых во флуоресцентной проточной цитометрии (например, DAPI, Hoechst, Pyronin Y и т. Д.). Флуоресцентные красители могут давать относительно точные измерения содержания ДНК и РНК, но эта точность возможна только благодаря изменениям флуоресцентных свойств этих красителей, которые происходят при интеркаляции между нуклеотидными основаниями. Таким образом, анализ MCM не может измерить содержание ДНК или РНК с аналогичной точностью. Вместо этого массовый цитометрический анализ клеточного цикла основан на измерениях белков, связанных с состоянием клеточного цикла, таких как циклин B1, фосфорилированный белок ретинобластомы (pRb) и фосфорилированный гистон H3 (pHH3) в сочетании с прямым измерением атома йода от включения IdU в клетки S-фазы. Эти два подхода к измерению дают очень похожие результаты во время нормальной клеточной пролиферации, но потенциально могут быть диссонирующими, когда прогрессирование клеточного цикла нарушается.
Измерение количества клеток в каждой фазе клеточного цикла важно для понимания нормального развития клеточного цикла, а также нарушения клеточного цикла, которое обычно наблюдается при раке и иммунологических заболеваниях. MCM обеспечивает надежное измерение внеклеточных и внутриклеточных факторов с использованием метенных металлом антител; однако измерение S-фазы было ограничено, поскольку интеркалятор ДНК на основе иридия не мог различать 2N и 4N ДНК. Чтобы определить фазы клеточного цикла, Бехбехани разработал метод, в котором используется IdU с массой 127, который попадает в диапазон массового цитометра и позволяет напрямую измерять клетки в S-фазе3. Это прямое измерение обходит необходимость во вторичных антителах или использовании денатурирующих ДНК агентов, таких как кислота или ДНКаза. В сочетании с маркерами внутриклеточного цикла он обеспечивает высокое разрешение распределения клеточного цикла в экспериментальных моделях.
Этот протокол адаптирует измерения клеточного цикла из общих протоколов проточной цитометрии для MCM. Наши методы обеспечивают удобный и простой способ включения параметров клеточного цикла. Для включения образцов IdU in vitro требуется всего от 10 до 15 минут инкубации при 37 ° C, что короче, чем у большинства протоколов окрашивания BrdU, которые рекомендуют время инкубации в несколько часов 3,7. Образцы, включенные в IdU и BrdU, могут быть зафиксированы с помощью протеомного стабилизатора, а затем храниться в течение некоторого времени в морозильной камере с температурой -80 °C. Это позволяет архивировать большое количество образцов, окрашенных IdU, для пакетного анализа без снижения качества образцов.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3059</td>
			<td>Component of CSM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td>Sample centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved-PARP (D214)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>F21-852</td>
			<td>Identification of apoptotic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclin B1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>GNS-1</td>
			<td>G2 Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Cryopreservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQ Four Element Calibration Beads</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201078</td>
			<td>Internal metal standard for CyTOF performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Tube w/ mesh strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td>Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Cell culture growth supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helios</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td>CyTOF System/Platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393</td>
			<td>Staining additive to prevent non-specific staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IdU (5-Iodo-2&#8242;-deoxyuridine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7125</td>
			<td>Incorporates in S-phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki-67</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>SolA15</td>
			<td>Confirmation of G0/G1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxPar Multi Label Kit</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201300</td>
			<td>Metal labeling kit, attaches metals to antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880023</td>
			<td>Mixing samples during staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201192</td>
			<td>Cell identification during CyTOF acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-H2AX (S139)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>JBW301</td>
			<td>Detection of DNA damage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-HH3 (S28)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>HTA28</td>
			<td>M-phase Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Wash solution for cell culture and component of fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Rb (S807/811)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>J112906</td>
			<td>G0/G1 Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteomic Stabilizer</td>
			<td>SmartTube Inc</td>
			<td>PROT1</td>
			<td>Sample fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21870-076</td>
			<td>Cell culture growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC447810250</td>
			<td>Component of CSM/Antibody buffer, biocide</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the pyrimidine analog, 5-iodo-2&prime;-deoxyuridine (idu) with cell cycle markers to establish cell cycle phases in a mass cytometry platform

Регуляция фазы клеточного цикла является важным аспектом клеточной пролиферации и гомеостаза. Нарушение регуляторных механизмов, регулирующих клеточный цикл, является особенностью целого ряда заболеваний, в том числе онкологических. Изучение клеточного цикла требует способности определять количество клеток в каждой части прогрессии клеточного цикла, а также четко разграничивать каждую фазу клеточного цикла. Появление массовой цитометрии (MCM) обеспечивает огромный потенциал для высокопроизводительного анализа отдельных клеток посредством прямых измерений элементарных изотопов, а разработка метода измерения состояния клеточного цикла с помощью MCM еще больше расширяет полезность MCM. Здесь мы описываем метод, который непосредственно измеряет 5-йодо-2'-дезоксиуридин (IdU), аналогичный 5-бром-2'-дезоксиуридину (BrdU), в системе MCM. Использование этого MCM на основе IdU дает несколько преимуществ. Во-первых, IdU быстро включается в ДНК во время ее синтеза, что позволяет надежно измерять клетки в S-фазе с инкубацией всего за 10-15 минут. Во-вторых, IdU измеряется без необходимости вторичных антител или необходимости деградации ДНК. В-третьих, окрашивание IdU можно легко комбинировать с измерением циклина B1, фосфорилированного белка ретинобластомы (pRb) и фосфорилированного гистона H3 (pHH3), что в совокупности обеспечивает четкое разграничение пяти фаз клеточного цикла. Комбинация этих маркеров клеточного цикла с большим количеством параметров, возможных с MCM, позволяет комбинировать их со многими другими показателями.

Используя клетки HL-60 и аспират костного мозга человека, можно показать, как экспериментальные условия могут влиять на распределение и анализ клеточного цикла. Во-первых, необходимо разработать стратегию стробирования, чтобы продемонстрировать, как формируются фазы клеточного цикла. <s...

Watch this Scientific Journal Video about Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2Ã¢â‚¬Â²-Deoxyuridine IdU with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform at JoVE.com

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²-Deoxyuridine IdU with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

Этот протокол адаптирует измерения клеточного цикла для использования в платформе массовой цитометрии. Благодаря многопараметрическим возможностям массовой цитометрии прямое измерение включения йода позволяет идентифицировать клетки в S-фазе, в то время как маркеры внутриклеточного цикла позволяют характеризовать состояние каждого клеточного цикла в различных экспериментальных условиях.

Использование аналога пиримидина, 5-йод-2'-дезоксиуридина (IdU) с маркерами клеточного цикла для установления фаз клеточного цикла на платформе массовой цитометрии

The regulation of cell cycle phase is an important aspect of cellular proliferation and homeostasis. Disruption of the regulatory mechanisms governing the ...

Этот протокол позволяет нам исследовать клеточный цикл на уровне отдельных клеток с помощью массового цитометра, и это позволяет провести несколько новых исследований и клинических исследований. Главным преимуществом этой методики является ее простота. IdU добавляется непосредственно к клеткам, и нет необходимости в дальнейшем лечении или антителах.Мы использовали этот метод для исследования состояния клеточного цикла у пациентов с острым миелоидным лейкозом в отделах стволовых клеток и клеток-предшественников. И это продемонстрировало, что свойства клеточного цикла этих конкретных типов клеток могут коррелировать с клиническим исходом пациентов с этими заболеваниями. Этот метод может быть полезен для понимания ростовых свойств редких раковых клеток и понимания пролиферации подмножеств иммунных клеток.До и после добавления IdU в образцы клеток поддерживайте клетки в интересующих условиях роста. В этом случае увлажненный инкубатор с температурой 37 градусов по Цельсию при 5% CO2 для маркировки клеток IdU, разбавляет концентрированный исходный раствор IdU от одного до 50 в питательной среде клеток. Затем перенесите образцы в колпак биобезопасности и добавьте 10 микролитров одного миллимолярного IdU к каждому миллилитру клеток.Верните клетки в инкубатор на 10-15 минут перед переносом образцов в отдельные конические пробирки. Соберите клетки центрифугированием в конические пробирки объемом 15 миллилитров и ресуспендируйте гранулы в 200 микролитрах PBS на пробирку. При необходимости пометьте клетки соответствующим живым/мертвым окрашиванием, чтобы пометить мертвые клетки.После живого/мертвого окрашивания клетки закаляли средами, промытыми CSM, а затем фиксировали клетки 25 микролитрами 16% параформальдегида. После 10-минутной инкубации при комнатной температуре соберите клетки центрифугированием. Добавьте от пяти до 15 миллилитров CSM и снова центрифугу.Ресуспендируют гранулы в 500 микролитрах среды для окрашивания клеток, дополненной 10% диметилсульфоксидом. Затем переложите клетки в меньшие пробирки, чтобы хранить их при минус 80 градусах Цельсия. Чтобы нормализовать анализ клеточного цикла, импортируйте файлы в соответствующую программу анализа проточной цитометрии и создайте двухосный график длины события по сравнению со 191 иридием.Клетки образуют отчетливую яркую популяцию с высоким содержанием иридия. Измените шкалу длины события, чтобы ячейки выглядели более заметными. Затем создайте синглетный затвор, чтобы исключить от 50 до 60% дублетов и мусора, и установите остаточные и смещенные параметры Гаусса, чтобы удалить все оставшиеся дублеты и обломки.Чтобы установить затвор S-фазы, создайте двухосный график зависимости IdU от маркера пролиферации. IdU-положительные клетки S-фазы образуют отдельную популяцию. Для стробирования G0/G1 и G2/M установите вентили на графике зависимости IdU от циклина B1.Фаза G0 / G1 будет низкой циклином B1, отрицательным IdU, а фаза G2 / M будет высокой циклином B1, отрицательным IdU. Чтобы получить доступ к определенным типам клеток, постройте только ячейки S-фазы на графике циклина B1 и IdU, чтобы помочь установить разделение между фазой G0 / G1 и фазовыми ячейками G2 / M. Нарисуйте ворота вокруг высокой популяции Cyclin B1.В некоторых случаях это может быть трудно различить, но уровень циклина B1, составляющий примерно верхние 5% популяции S-фазы, обычно является точкой разрыва между фазовыми затворами G0/G1 и G2/M. Клетки, находящиеся в пределах предыдущих ворот, будут популяцией фазы G2/M, а остальная часть будет популяцией фазы G0/G1. Чтобы установить популяцию фазы G0, создайте фосфорилированный белок ретинобластомы по сравнению с графиком IdU.Фаза G0 будет представлена фосфорилированным белком ретинобластомы с низким IdU-отрицательным составом. Поскольку активная циклическая популяция продемонстрирует высокий фосфорилированный белок ретинобластомы и инкорпорацию IdU, на этой границе можно нарисовать фазовые ворота G0, поскольку они обычно экспрессируются в двух разных популяциях. Если ворота G0 трудно определить, сделайте популяцию S-фазы активной популяцией и нарисуйте ворота, включающие от 90 до 100% высокой популяции фосфорилированного белка ретинобластомы.Низкая популяция фосфорилированного белка ретинобластомы за пределами ворот обычно представляет собой популяцию G0, в то время как клетки G0 / G1 с уровнями pRb, которые попадают в эти ворота, являются клетками G1. Для стробирования в М-фазе создайте IdU по сравнению с фосфорилированным гистоном H3 с помощью осевого графика. Фаза М-фазы будет наблюдаться как очень малая часть клеток в популяции фосфорилированных гистонов H3.Клетки в популяции G2 / M с более низким уровнем pHH3 являются клетками G2. Если включение IdU не удалось или было невозможно, определите циклические и нециклические клеточные фракции, используя Ki67 и фосфорилированный белок ретинобластомы. Двойная положительная популяция будет представлять активную велосипедную популяцию, коррелирующую с G1, S, G2 и M-фазами.Двойная низкая популяция будет представлять собой невелосипедную популяцию, коррелирующую с фазой G0. После того, как все ворота будут установлены, экспортируйте числовые значения из ворот. Проценты в каждом цикле могут быть достигнуты путем вычитания отдельных популяций из объединенных популяций для получения числовых значений для каждой отдельной фазы клеточного цикла для последующего построения графиков и статистического анализа.Создание синглетных ворот важно для разделения клеточного мусора и дублетов, чтобы обеспечить изоляцию одиночной клеточной популяции. Затем может быть выполнен анализ клеточного цикла отдельных клеток. Маркировка IdU и, следовательно, последующий анализ клеточного цикла могут существенно зависеть от времени и температуры.Например, клетки, которые слишком долго остаются в закрытых сосудах или в транспорте между местами, будут иметь уменьшенные фракции S-фазы, и это не будет точным для анализа клеточного цикла. Образцы клеток, хранящиеся в течение коротких периодов времени в час или меньше, по-прежнему демонстрируют нормальное распределение клеточного цикла, что указывает на то, что быстрая транспортировка не может негативно повлиять на анализ. Криоконсервированные клетки могут потребовать длительного периода равновесия, прежде чем клетки вернутся к активному клеточному циклу, который все еще может не отражать состояние клеточного цикла до криоконсервации.Различные типы клеток также могут по-разному зависеть от условий обслуживания. Например, в этом образце костного мозга человека Т-клетки продемонстрировали снижение количества клеток по сравнению с монобластами из того же образца. Еще одним преимуществом массовой цитометрии является способность различать клетки при остановке клеточного цикла или с аномальным распределением клеточного цикла.Основным преимуществом этого метода является то, что он легко совместим с другими измерениями масс-цитометрии, такими как поверхностное фенотипирование, структура хроматина, стимуляция внутриклеточных цитокинов, которые могут быть коррелированы с состоянием клеточного цикла. Мы использовали этот метод для изучения истощения иммунных клеток, старения и для того, чтобы показать, что реакция на химиотерапию у пациентов с острым лейкозом может коррелировать со свойствами клеточного цикла лейкозных клеток.

Research

JoVE Journal

Genetics

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2&prime;-Deoxyuridine (IdU) with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Высокопроизводительный роботизированная Изоляция термочувствительных Смертельное Мутанты в<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Разведению и двухцепочечную РНК-опосредованный нокдаун гена в Скрыть Beetle,<em&gt; Кожеед пятнистый</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Обнаружение Copy Number Изменений Использование Single Cell Секвенирование

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Использование Флуоресцентный ПЦР-капиллярного электрофореза гель Техника генотипу CRISPR / cas9-опосредованной Нокаут Мутанты в формате высокой пропускной способностью

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Изучение экспрессии генов, регулируемых клеточным циклом, двумя протоколами синхронизации комплементарных ячеек

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Профилирования времени репликации ДНК, используя данио рерио как в естественных условиях модель системы

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Кандидат Джин тестирование в клинической когортных исследований с мультиплексной генотипирования и масс-спектрометрии

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Комбинаторные одноклеточных подход к характеризуют молекулярных и иммунофенотипических неоднородность человеческих стволовых и прогениторных населения

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Использование в пробирке и в клеток форму расследовать малые молекулы индуцированной пре мРНК структурные изменения

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

Использование мыши молочных опухолевых клеток в in vitro Вторжение анализа в качестве меры онкогенной клеточной поведения

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...