Name: use of the pyrimidine analog, 5-iodo-2&prime;-deoxyuridine (idu) with cell cycle markers to establish cell cycle phases in a mass cytometry platform
Uploaded: 2021-10-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2Ã¢â‚¬Â²-Deoxyuridine IdU with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform at JoVE.com

Författarna vill tacka Palak Sekhri, Hussam Alkhalaileh, Hsiaochi Chang och Justin Lyeberger för deras experimentella stöd. Detta arbete stöddes av Pelotonia Fellowship Program. Alla åsikter, resultat och slutsatser som uttrycks i detta material är författarnas och återspeglar inte nödvändigtvis Pelotonia Fellowship-programmet.

1. Beredning av lager av IdU
<ol><li>Lös 5-jod-2'-deoxiuridin (IdU) i DMSO till en koncentration av 50 mM. Sterilfiltrera, alikvot i 10–50 μl rör och förvara vid -80 °C</li>
	<li>Ta ut IdU ur frysen och tina i rumstemperatur. Späd IdU i RPMI-1640 för att göra en arbetslösning vid en slutlig koncentration av 1 mM. Pipettera upp och ner eller virvel att blanda.<ol><li>Späd vanligtvis ut den koncentrerade IdU i det medium där cellerna odlas (t.ex. DMEM, IMDM, etc.) eller låt det spädas till PBS för tillsat...

<ol>
	<li>Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+cellular+antigen+detection+by+ICP-MS.">Multiple cellular antigen detection by ICP-MS.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).</li><li>Ornatsky, O. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+cell+antigens+and+intracellular+DNA+by+identification+of+element-containing+labels+and+metallointercalators+using+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry.">Study of cell antigens and intracellular DNA by identification of element-containing labels and metallointercalators using inductively coupled plasma mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 80 (7), 2539-2547 (2008).</li><li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle.">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).</li><li>Raval, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversibility+of+Defective+Hematopoiesis+Caused+by+Telomere+Shortening+in+Telomerase+Knockout+Mice.">Reversibility of Defective Hematopoiesis Caused by Telomere Shortening in Telomerase Knockout Mice.</a> PLoS One. 10 (7), 0131722 (2015).</li><li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Cytometric+Functional+Profiling+of+Acute+Myeloid+Leukemia+Defines+Cell-Cycle+and+Immunophenotypic+Properties+That+Correlate+with+Known+Responses+to+Therapy.">Mass Cytometric Functional Profiling of Acute Myeloid Leukemia Defines Cell-Cycle and Immunophenotypic Properties That Correlate with Known Responses to Therapy.</a> Cancer Discovery. 5 (9), 988-1003 (2015).</li><li>Kimmey, S. C., Borges, L., Baskar, R., Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+analysis+of+tri-molecular+biosynthesis+with+cell+identity+and+function+in+single+cells.">Parallel analysis of tri-molecular biosynthesis with cell identity and function in single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1185 (2019).</li><li>Rabinovitch, P. S., Kubbies, M., Chen, Y. C., Schindler, D., Hoehn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU-Hoechst+flow+cytometry:+a+unique+tool+for+quantitative+cell+cycle+analysis.">BrdU-Hoechst flow cytometry: a unique tool for quantitative cell cycle analysis.</a> Experimental Cell Research. 174 (2), 309-318 (1988).</li><li>Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin+reduces+nonspecific+eosinophil+staining+artifacts+in+mass+cytometry+experiments.">Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments.</a> Cytometry A. 89 (6), 601-607 (2016).</li><li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis.">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e54394 (2017).</li><li>Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+by+Mass+Cytometry.">Immunophenotyping by Mass Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 2032, 31-51 (2019).</li><li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer.">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4398 (2012).</li><li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).</li><li>Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Web-based+analysis+and+publication+of+flow+cytometry+experiments.">Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments.</a> Current Protocols in Cytometry. , 17 (2010).</li><li>Devine, R. D., Sekhri, P., Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+storage+time+and+temperature+on+cell+cycle+analysis+by+mass+cytometry.">Effect of storage time and temperature on cell cycle analysis by mass cytometry.</a> Cytometry A. 93 (11), 1141-1149 (2018).</li><li>Campos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+immunological+markers+on+leukemic+cells+before+and+after+cryopreservation+and+thawing.">Expression of immunological markers on leukemic cells before and after cryopreservation and thawing.</a> Cryobiology. 25 (1), 18-22 (1988).</li><li>Kadic, E., Moniz, R. J., Huo, Y., Chi, A., Kariv, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cryopreservation+on+delineation+of+immune+cell+subpopulations+in+tumor+specimens+as+determinated+by+multiparametric+single+cell+mass+cytometry+analysis.">Effect of cryopreservation on delineation of immune cell subpopulations in tumor specimens as determinated by multiparametric single cell mass cytometry analysis.</a> BMC Immunology. 18 (1), 6 (2017).</li><li>Shabihkhani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+procurement,+storage,+and+quality+assurance+of+frozen+blood+and+tissue+biospecimens+in+pathology,+biorepository,+and+biobank+settings.">The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings.</a> Clinical Biochemistry. 47 (4-5), 258-266 (2014).</li></ol>

Exemplen som presenteras här visar hur man använder en MCM-plattform för att analysera cellcykelfördelning. Det har också visats att cellcykelanalys är känslig för experimentella förhållanden som tid och temperatur, vilket är ett viktigt övervägande som forskare måste ta när de överväger MCM för sin cellcykelanalys14. Prover som lämnas i lager under en kort tidsperiod, inte längre än en timme, kommer att ha IdU-införlivande som är jämförbar med deras normala tillstånd. Pr...

Masscytometri möjliggör detektion av cirka 40 parametrar genom att dra nytta av masspektroskopins höga upplösning och kvantitativa natur. Metallmärkta antikroppar används istället för fluoroforkonjugerade antikroppar som möjliggör ett högre antal kanaler och ger minimal spillover 1,2. MCM har fördelar och nackdelar när det gäller cellcykelanalys jämfört med flödescytometri. En stor fördel med MCM är att det stora antalet parametrar möjliggör samtidig mätning av cellcykeltillstånd över ett stort antal immunofenotypiskt distinkta T-celltyper i mycket heterogena prover. MCM har framgångsrikt använts för att mäta cellcykelns tillstånd under normal hematopoes i human benmärg3 och transgena murina modeller av telomerasbrist4. Analys av cellcykeltillstånd vid akut myeloisk leukemi (AML) visade att cellcykeln korrelerade med kända svar på kliniska terapier, vilket gav en in vivo-insikt i funktionella egenskaper som kan informera terapival5. En andra fördel med masscytometrisk cellcykelanalys är möjligheten att mäta ett stort antal andra funktionella markörer som kan korreleras med cellcykeltillstånd. Nyligen arbete har kunnat korrelera protein- och RNA-syntes med cellcykeltillstånd genom användning av IdU och metallmärkta antikroppar mot BRU och rRNA6. Denna typ av mycket parametrisk analys som mäter cellcykeltillstånd över många populationer i ett kontinuum av differentiering skulle vara nästan omöjligt med nuvarande flödescytometriteknik. Den största nackdelen med MCM är bristen på jämförbara DNA- eller RNA-fläckar som de som används i fluorescerande flödescytometri (t.ex. DAPI, Hoechst, Pyronin Y, etc.). Fluorescerande färgämnen kan ge relativt exakta mätningar av DNA- och RNA-innehåll, men denna precision är endast möjlig på grund av förändringarna i de fluorescerande egenskaperna hos dessa färgämnen som uppstår vid interkalering mellan nukleotidbaser. MCM-analys kan därför inte mäta DNA- eller RNA-innehåll med liknande precision. Istället bygger masscytometrisk cellcykelanalys på mätningar av proteiner relaterade till cellcykeltillstånd såsom cyklin B1, fosforylerat retinoblastomprotein (pRb) och fosforylerad histon H3 (pHH3) kombinerat med direkt mätning av jodatomen från IdU-inkorporering i S-fasceller. Dessa två mätmetoder ger mycket liknande resultat under normal cellulär proliferation, men kan potentiellt vara diskordanta när cellcykelprogressionen störs.
Mätning av antalet celler i varje cellcykelfas är viktigt för att förstå normal cellcykelutveckling samt cellcykelstörningar, vilket vanligtvis observeras vid cancer och immunologiska sjukdomar. MCM ger tillförlitlig mätning av extracellulära och intracellulära faktorer med användning av metallmärkta antikroppar; mätningen av S-fasen var dock begränsad eftersom den iridiumbaserade DNA-interkalatorn inte kunde skilja mellan 2N och 4N DNA. För att definiera cellcykelfaser utvecklade Behbehani en metod som använder IdU med en massa på 127, vilket faller inom masscytometerns intervall och möjliggör direkt mätning av celler i S-fas3. Denna direkta mätning kringgår behovet av sekundära antikroppar eller användning av DNA-denatureringsmedel såsom syra eller DNas. I kombination med intracellulära cykelmarkörer möjliggör det hög upplösning av cellcykelfördelning i experimentella modeller.
Detta protokoll anpassar cellcykelmätningar från vanliga flödescytometriprotokoll för MCM. Våra metoder ger ett bekvämt och enkelt sätt att inkludera cellcykelparametrar. IdU-inblandning av in vitro-prover kräver endast 10 till 15 minuters inkubation vid 37 °C, vilket är kortare än de flesta BrdU-färgningsprotokoll som rekommenderar inkubationstider på flera timmar 3,7. IdU- och BrdU-införlivade prover kan fixeras med hjälp av en proteomisk stabilisator och sedan lagras under en tid i en frys på -80 °C. Detta gör att ett stort antal IdU-färgade prover kan arkiveras för batchanalys utan att provkvaliteten försämras.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3059</td>
			<td>Component of CSM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td>Sample centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved-PARP (D214)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>F21-852</td>
			<td>Identification of apoptotic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclin B1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>GNS-1</td>
			<td>G2 Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Cryopreservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQ Four Element Calibration Beads</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201078</td>
			<td>Internal metal standard for CyTOF performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Tube w/ mesh strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td>Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Cell culture growth supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helios</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td>CyTOF System/Platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393</td>
			<td>Staining additive to prevent non-specific staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IdU (5-Iodo-2&#8242;-deoxyuridine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7125</td>
			<td>Incorporates in S-phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki-67</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>SolA15</td>
			<td>Confirmation of G0/G1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxPar Multi Label Kit</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201300</td>
			<td>Metal labeling kit, attaches metals to antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880023</td>
			<td>Mixing samples during staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201192</td>
			<td>Cell identification during CyTOF acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-H2AX (S139)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>JBW301</td>
			<td>Detection of DNA damage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-HH3 (S28)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>HTA28</td>
			<td>M-phase Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Wash solution for cell culture and component of fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Rb (S807/811)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>J112906</td>
			<td>G0/G1 Resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteomic Stabilizer</td>
			<td>SmartTube Inc</td>
			<td>PROT1</td>
			<td>Sample fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21870-076</td>
			<td>Cell culture growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC447810250</td>
			<td>Component of CSM/Antibody buffer, biocide</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the pyrimidine analog, 5-iodo-2&prime;-deoxyuridine (idu) with cell cycle markers to establish cell cycle phases in a mass cytometry platform

Regleringen av cellcykelfasen är en viktig aspekt av cellulär proliferation och homeostas. Störning av de regleringsmekanismer som styr cellcykeln är en egenskap hos ett antal sjukdomar, inklusive cancer. Studier av cellcykeln kräver förmågan att definiera antalet celler i varje del av cellcykelprogressionen samt att tydligt avgränsa mellan varje cellcykelfas. Tillkomsten av masscytometri (MCM) ger enorm potential för encellsanalys med hög genomströmning genom direkta mätningar av elementära isotoper, och utvecklingen av en metod för att mäta cellcykeltillståndet med MCM utökar ytterligare användbarheten av MCM. Här beskriver vi en metod som direkt mäter 5-jod-2′-deoxiuridin (IdU), liknande 5-brom-2'-deoxiuridin (BrdU), i ett MCM-system. Användning av denna IdU-baserade MCM ger flera fördelar. Först införlivas IdU snabbt i DNA under syntesen, vilket möjliggör tillförlitlig mätning av celler i S-fasen med inkubationer så korta som 10-15 minuter. För det andra mäts IdU utan behov av sekundära antikroppar eller behov av DNA-nedbrytning. För det tredje kan IdU-färgning enkelt kombineras med mätning av cyklin B1, fosforylerat retinoblastomprotein (pRb) och fosforylerad histon H3 (pHH3), vilket tillsammans ger tydlig avgränsning av de fem cellcykelfaserna. Kombination av dessa cellcykelmarkörer med det stora antalet parametrar som är möjliga med MCM möjliggör kombination med många andra mätvärden.

Med hjälp av HL-60-celler och ett humant benmärgsaspirat är det möjligt att visa hur experimentella förhållanden kan påverka cellcykelfördelning och analys. Först måste grindstrategin upprättas för att visa hur cellcykelfaserna härleds. I figur 1 visar vi etableringen av singletgrinden, vilket är viktigt för att separera cellulärt skräp och dubbletter, vilket skapar en enda cellpopulation. För cellinjer är singlettgrinden allt som behövs för att gå vidare till cellcykel...

Watch this Scientific Journal Video about Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2Ã¢â‚¬Â²-Deoxyuridine IdU with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform at JoVE.com

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²-Deoxyuridine IdU with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

Detta protokoll anpassar cellcykelmätningar för användning i en masscytometriplattform. Med multiparameterfunktionerna för masscytometri möjliggör direkt mätning av jodinkorporering identifiering av celler i S-fas medan intracellulära cykelmarkörer möjliggör karakterisering av varje cellcykeltillstånd under en rad experimentella förhållanden.

Användning av pyrimidinanalogen, 5-jod-2′-deoxiuridin (IdU) med cellcykelmarkörer för att upprätta cellcykelfaser i en masscytometriplattform

The regulation of cell cycle phase is an important aspect of cellular proliferation and homeostasis. Disruption of the regulatory mechanisms governing the ...

Detta protokoll gör det möjligt för oss att undersöka cellcykeln på encellsnivå med hjälp av masscytometern, och detta möjliggör flera nya forsknings- och kliniska studier. Den största fördelen med denna teknik är dess enkelhet. IdU tillsätts direkt till cellerna och det finns inget behov av ytterligare behandling eller antikroppar.Vi har använt denna teknik för att undersöka cellcykeltillståndet hos patienter med akut myeloisk leukemi inom stam- och stamcellsfacken. Och detta visade att cellcykelegenskaperna hos dessa specifika celltyper kan korrelera med det kliniska resultatet hos patienter med dessa sjukdomar. Denna teknik kan vara användbar för att förstå tillväxtegenskaper hos sällsynta cancerceller och förstå spridningen av immuncellsundergrupper.Före och efter tillsats av IdU till cellproverna, behåll cellerna i de tillväxtförhållanden som är av intresse. I detta fall spädde en fuktad 37 grader Celsius-inkubator vid 5% CO2 för att märka cellerna med IdU, den koncentrerade IdU-stamlösningen en till 50 i cellernas tillväxtmedium. Överför sedan proverna till en biosäkerhetshuv och tillsätt 10 mikroliter en millimolär IdU till varje milliliter celler.Sätt tillbaka cellerna i inkubatorn i 10 till 15 minuter innan proverna överförs till enskilda koniska rör. Samla cellerna genom centrifugering i 15 ml koniska rör och återsuspendera pellets i 200 mikroliter PBS per rör. Om det behövs, märk cellerna med en lämplig levande / död fläck för att markera de döda cellerna.Efter levande / död fläck, släckte cellerna med media tvättade med CSM innan cellerna fixerades med 25 mikroliter 16% paraformaldehyd. Efter en 10 minuters inkubation vid rumstemperatur, samla cellerna genom centrifugering. Tillsätt fem till 15 ml CSM och centrifugera igen.Återsuspendera pelletsen i 500 mikroliter cellfärgningsmedium kompletterat med 10% dimetylsulfoxid. Överför sedan cellerna till mindre rör för att lagra dem i negativa 80 grader Celsius. För att normalisera för deras cellcykelanalys, importera filerna till ett lämpligt program för flödescytometrianalys och skapa en biaxiell plot av händelselängden kontra 191 iridium.Cellerna kommer att bilda en distinkt ljus iridium hög befolkning. Ändra händelselängdskalan så att cellerna blir mer framträdande. Skapa sedan en singlettgrind för att utesluta 50 till 60% av dubbletter och skräp och ställ in resterande och förskjutna Gauss-parametrar för att ta bort eventuella återstående dubbletter och skräp.För att ställa in S-fasporten, skapa en biaxiell plot av IdU kontra en spridningsmarkör. De S-fas IdU-positiva cellerna kommer att bilda en distinkt population. För G0/G1 och G2/M-grind etablerar du grindarna på ett IdU kontra Cyclin B1-diagram.G0/G1-fasen kommer att vara Cyclin B1 låg, IdU negativ, och G2/M-fasen kommer att vara Cyclin B1 hög, IdU negativ. För att grinda för specifika celltyper, plotta endast S-fascellerna på Cyclin B1 kontra IdU-grafen för att fastställa separationen mellan G0 / G1-fas och G2 / M-fasceller. Rita en grind runt Cyclin B1 hög befolkning.I vissa fall kan detta vara svårt att urskilja, men nivån av cyklin B1 på ungefär topp 5% av S-faspopulationen är vanligtvis brytpunkten mellan G0 / G1 och G2 / M-fasportarna. Cellerna som bor inom den tidigare grinden kommer att vara G2 / M-faspopulationen, medan resten kommer att vara G0 / G1-faspopulationen. För att fastställa G0-faspopulationen, skapa ett fosforylerat retinoblastomprotein kontra IdU-plot.G0-fasen kommer att representeras av en fosforylerad retinoblastomproteinlåg, IdU-negativ population. Eftersom den aktiva cykelpopulationen kommer att visa ett högt fosforylerat retinoblastomprotein och IdU-inkorporering, kan G0-fasporten dras på denna gräns eftersom den vanligtvis uttrycker sig vid två distinkta populationer. Om G0-grinden är svår att definiera, gör S-faspopulationen till den aktiva befolkningen och dra en grind som innehåller de översta 90 till 100% av den fosforylerade retinoblastomproteinets höga befolkning.Den fosforylerade retinoblastomproteinets låga population utanför grinden är typiskt G0-populationen, medan G0 / G1-cellerna med pRb-nivåer som faller i denna grind är G1-celler. För M-fasgrind, skapa en IdU kontra fosforylerad histon H3 genom axiell plot. M-fasfasen kommer att observeras som den mycket lilla fraktionen av celler inom den fosforylerade histon H3-populationen.Cellerna i G2/M-populationen med lägre nivåer av pHH3 är G2-cellerna. Om IdU-inkorporering misslyckades eller inte var möjlig, definiera cykel- och inte cykelcellfraktionerna med Ki67 och fosforylerat retinoblastomprotein. Den dubbla positiva populationen kommer att representera den aktiva cykelpopulationen som korrelerar med G1-, S-, G2- och M-faserna.Den dubbla låga befolkningen kommer att representera den icke-cyklande befolkningen som korrelerar med G0-fasen. När alla grindar har upprättats exporterar du de numeriska värdena från grindarna. Procentandelarna i varje cykel kan uppnås genom att subtrahera de enskilda populationerna från de kombinerade populationerna för att generera numeriska värden för varje enskild cellcykelfas för efterföljande grafering och statistisk analys.Etableringen av singlettgrinden är viktig för att separera cellulärt skräp och dubbletter för att möjliggöra isolering av encellspopulationen. Cellcykelanalys av de enskilda cellerna kan sedan utföras. IdU-märkning och därmed nedströms cellcykelanalys kan påverkas avsevärt av tid och temperatur.Till exempel kommer celler som förblir för länge i slutna kärl eller i transport mellan platser att ha reducerade S-fasfraktioner och det kommer inte att vara korrekt för cellcykelanalys. Cellprover som hålls under korta perioder på en timme eller mindre visar fortfarande en normal cellcykelfördelning, vilket indikerar att en snabb transport inte kan påverka analysen negativt. Kryokonserverade celler kan kräva en lång jämviktsperiod innan cellerna återgår till aktiv cellcykling, vilket kanske fortfarande inte återspeglar cellcykeltillståndet före kryokonservering.Olika celltyper kan också påverkas olika av underhållsförhållandena. Till exempel, i detta humana benmärgsprov, visade T-cellerna en minskning av cellantalet jämfört med monoblaster från samma prov. En annan fördel med masscytometri är förmågan att diskriminera celler i cellcykelstopp eller som har en onormal cellcykelfördelning.En stor fördel med denna teknik är att den lätt är kompatibel med andra masscytometrimätningar såsom ytfenotypning, kromatinstruktur, intracellulär cytokinstimulering, som kan korreleras med cellcykeltillstånd. Vi har använt denna teknik för att studera immuncellsutmattning, åldrande och för att visa att svaret på kemoterapi hos patienter med akut leukemi kan korrelera med cellcykelegenskaperna hos leukemicellerna.

Research

JoVE Journal

Genetics

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2&prime;-Deoxyuridine (IdU) with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Hög genomströmning Robotsvetsad Assisted Isolering av temperaturkänslig dödliga mutanter i<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Uppfödning och dubbelsträngade RNA-medierad Gene Knockdown i Hide Beetle,<em&gt; Rävänger</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detektion av Copy Number Ändringar Använda Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Med hjälp av en fluorescerande PCR-kapillärgelelektrofores Technique att genotypa CRISPR / Cas9-medierad Knockout mutanter i en hög kapacitet Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Studierande cellcykelreglerade genuttryck av två komplementära cellsynkroniseringsprotokoll

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profilering DNA Replication Timing med zebrafiskar som ett In Vivo -modellsystem

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Kandidat Gene tester i klinisk kohortstudier med multiplexade genotypning och masspektrometri

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

En kombinatorisk Single-cell strategi att karaktärisera molekylära och Immunophenotypic heterogenitet av mänskliga stamceller och stamceller populationer

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Använda i Vitro och i cell form att undersöka småmolekylära inducerad Pre-mRNA strukturella förändringar

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

Användningen av mus mammary tumörceller i en in vitro-invasion analys som ett mått på onkogena cell beteende

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...