Name: apoptosis induction and detection in a primary culture of sea cucumber intestinal cells
Uploaded: 2020-01-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Prof. Naiming Zhou fra Zhejiang University for hans tekniske rådgivning og for at gøre udstyret i hans laboratorium til rådighed til brug. Dette arbejde blev finansielt støttet af Kinas National Natural Science Foundation (tilskudsnummer 41876154, 41606150 og 41406137) og de grundlæggende forskningsfonde for Zhejiang Provincial universiteter og forskningsinstitutter [Grant Number 2019JZ00007 ].

1. forberedelse af cellekultur medium
<ol><li>
Præparation af coelomic væske
	<ol>
<li>
Coelomic væske samling: Under sterile forhold, dissekere en sund havagurk (våd vægt på 85-105 g), indsamle coelomic væske, og opbevar den i en steril glas kolbe.</li>
		<li>
Coelomic celle fjernelse: Den coelomic væske centrifugeres i 50 mL centrifugeglas ved 1.700 x g i 5 min., og supernatanten overføres til en ny steril glas kolbe. Dernæst indsamle celle-fri coe...

<ol>
	<li>Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenesis+in+primary+cell+cultures+from+larvae+of+the+abalone,+Haliotis+rufescens.">Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens.</a> Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).</li><li>Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+regeneration+and+biomineralization+in+sea+urchins:+role+of+Notch+signaling+and+presence+of+stem+cell+markers.">Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers.</a> Plos One. 10 (8), 0133860 (2015).</li><li>Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptional+time-course+analysis+of+oral+vs.+aboral+whole-body+regeneration+in+the+Sea+anemone+Nematostella+vectensis.">A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis.</a> Bmc Genomics. 17, 718 (2016).</li><li>Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+immune+response+to+bacterial+LPS+in+the+sea+urchin+Paracentrous+lividus+(Lamarck,+1816).">Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816).</a> Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).</li><li>Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+variation+in+anaerobic+energy+metabolism+reflects+hypoxia+tolerance+across+the+intertidal+and+subtidal+distribution+of+the+Pacific+oyster+(Crassostrea+gigas).">Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas).</a> Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).</li><li>Han, G., Zhang, S., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+metabolism+and+thermal+tolerance:+The+importance+of+opine+pathways+on+survival+of+a+gastropod+after+cardiac+dysfunction.">Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction.</a> Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sea+cucumber+genome+provides+insights+into+morphological+evolution+and+visceral+regeneration.">The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration.</a> PLoS Biology. 15 (10), 2003790 (2017).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iTRAQ+reveals+proteomic+changes+during+intestine+regeneration+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus.">iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).</li><li>Xu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+loss+by+apoptosis+is+involved+in+the+intestinal+degeneration+that+occurs+during+aestivation+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus.">Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).</li><li>Yang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+characteristics+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+(Selenka)+during+aestivation.">Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).</li><li>Xiang, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolytic+regulation+in+aestivation+of+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus:+evidence+from+metabolite+quantification+and+rate-limiting+enzyme+analyses.">Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses.</a> Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).</li><li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+feedback+loop+involving+FREP+and+NF-kappaB+regulates+the+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus.">A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).</li><li>Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+mRNA-miRNA+interaction+analysis+associate+with+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+based+on+transcriptome+database.">Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database.</a> Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).</li><li>Cai, X., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+invertebrate+cell+culture:+a+decade+of+development.">Marine invertebrate cell culture: a decade of development.</a> Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).</li><li>Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Approach+to+Primary+Cell+Culture+for+Octopus+vulgaris+Neurons.">A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons.</a> Frontiers in Physiology. 9, 220 (2018).</li><li>Pinsino, A., Alijagic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+urchin+Paracentrotus+lividus+immune+cells+in+culture:+formulation+of+the+appropriate+harvesting+and+culture+media+and+maintenance+conditions.">Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions.</a> Biology Open. 8 (3), (2019).</li><li>Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+holothurian+tissues+as+a+source+of+cells+for+long-term+cell+cultures.">Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures.</a> Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).</li><li>Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+Molecular+Mechanisms+and+Pathogenicity.">Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity.</a> Excli Journal. 8, 155-181 (2009).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis,+proliferation,+and+morphology+during+vein+graft+remodeling+in+rabbits.">Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits.</a> Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).</li><li>Kasibhatla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+of+suspension+cells+with+hoechst+33258+to+detect+apoptosis.">Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).</li><li>Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+long-term,+high-dose+dexamethasone+administration+on+proliferation+and+apoptosis+in+porcine+hepatocytes.">Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes.</a> Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).</li><li>Rinkevich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cultures+from+marine+invertebrates:+new+insights+for+capturing+endless+stemness.">Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness.</a> Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).</li><li>Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+of+regenerating+holothurian+tissues.">Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+water+temperature+on+the+growth+and+fatty+acid+profiles+of+juvenile+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+(Selenka).">Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka).</a> Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).</li></ol>

Omfattende forskningsindsats har været afsat til at etablere cellelinjer i de sidste årtier, men det er stadig vanskeligt at gøre en fremskridt på lang sigt kultur af celler fra marine hvirvelløse dyr14,22. Det er blevet rapporteret, at dyrkede celler fra regenererende holothurian væv var levedygtige i en lang periode, og høj aktivitet af spredning kan påvises i specifikke celler17,23. Men for de ...

Dyrkning af celler under kunstigt kontrollerede forhold, og ikke i deres naturlige miljø, giver ensartede eksperimentelle materialer til biologiske undersøgelser, især for arter, der ikke let kan dyrkes i et laboratoriemiljø. Marine hvirvelløse dyr tegner sig for mere end 30% af alle dyrearter1, og de leverer talrige biologiske materialer til forskning i reguleringsmekanismerne for specifikke biologiske processer, såsom regenerering2,3, stress respons4, og miljøtilpasning5,6.
Havet agurk, Apostichopus japonicus, er en af de mest studerede echinoderm arter, der lever tempererede farvande langs den nordlige Stillehav kyst. Det er velkendt som en kommercielt vigtig art og havdet i stor skala i Østasien, især i Kina7. Talrige videnskabelige spørgsmål vedrørende A. japonicus, herunder de regulerende mekanismer underliggende tarm regenerering efter udtagning8 og degeneration i aestivation9, metaboliske kontrol10,11, og immunrespons12,13 under termiske eller patogene belastninger, har tiltrukket sig opmærksomhed fra forskere. Men sammenlignet med velstuderet model dyr, grundforskning, især på cellulært niveau, er begrænset af tekniske flaskehalse, såsom manglen på avancerede cellekultur metoder.
Forskerne har viet en stor indsats for at etablere cellelinjer, men de har også stået over for mange udfordringer, og ingen cellelinje fra nogen Marine hvirvelløse er blevet etableret endnu14. Imidlertid har primære cellekulturer fra hvirvelløse havdyr fremskreden i de sidste årtier15,16, og de har givet mulighed for eksperimenter på cellulært niveau. For eksempel er den regenererende intesine fra A. japonicus blevet udnyttet som en kilde til celler for langsigtede cellekulturer, som leverede en praktisk metode til primær cellekultur af marine hvirvelløse dyr17. Denne protokol kombineret og optimeret hvirvelløse cellekultur tilgange og udviklet en bredt egnet primær kultur metode til havagurk eller andre marine hvirvelløse dyr.
Apoptose er en iboende celle selvmord program udløst af forskellige eksogene og endogene stimuli. Koordineret apoptose er afgørende for mange biologiske systemer18,19, og det har været impliceret i tarm regression af havagurk under aestivation9. For at undersøge den apoptotiske proces i interesse organismer er der blevet etableret en række metoder, herunder Hoechst-farvning og mikroskopi analyser, og20er blevet anvendt med succes. Her udførte vi apoptose induktion og detektion i primære dyrkede tarmceller af havagurk for at vurdere anvendeligheden af primære celler i biologiske undersøgelser af hvirvelløse havdyr. Dexamethason, en af de almindeligt anvendte syntetiske glukokortikosteroider21, blev brugt til at inducere apoptose i dyrkede tarmceller fra havagurk, og betydelige Hoechst 33258 signal blev med succes påvist i de farvede celler ved fluorescerende mikroskopi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLVV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m filter</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 cm dishes</td>
			<td>ExCell Bio</td>
			<td>CS016-0124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde solution</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80096618</td>
			<td>in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuges</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Allegra X-30R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BeyoClick EdU-488 kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0071S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10005817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Lucky Riptile</td>
			<td>HN-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW00500221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric thermostatic water bath</td>
			<td>senxin17</td>
			<td>DK-S28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80176961</td>
			<td>75%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor(FGF)</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica DMI3000B</td>
			<td>DMI3000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Garamycin</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW14054101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>63005518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst33258 Staining solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW1106168001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin like Growth Factor(IGF)</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10016308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM41300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (100 mg/mL)</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM-21051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW77863031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10020518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td>pH7.2-7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH meter</td>
			<td>Bante</td>
			<td>A120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE</td>
			<td>Seebio</td>
			<td>185791</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

apoptosis induction and detection in a primary culture of sea cucumber intestinal cells

Primær dyrkede celler anvendes i en række videnskabelige discipliner som usædvanligt vigtige værktøjer til funktionel evaluering af biologiske stoffer eller karakterisering af specifikke biologiske aktiviteter. Men på grund af manglen på universelt anvendelig cellekultur medier og protokoller, velbeskrevne cellekultur metoder til marine organismer er stadig begrænset. I mellemtiden hindrer den almindeligt forekommende mikrobielle kontaminering og polytrope egenskaber af marine hvirvelløse celler yderligere etableringen af en effektiv cellekultur strategi for hvirvelløse havdyr. Her beskriver vi en nem at håndtere metode til dyrkning af tarmceller fra havagurk Apostichopus japonicus; Derudover giver vi et eksempel på in vitro apoptose induktion og detektion i primære dyrkede tarmceller. Desuden giver dette eksperiment oplysninger om den relevante dyrkningsmedium og celle indsamlingsmetode. Den beskrevne protokol er kompatibel med en række bredt tilgængelige vævsprøver fra marine organismer, herunder ECHINODERMATA, Mollusca, og krebsdyr, og det kan give tilstrækkelige celler til flere in vitro eksperimentelle applikationer. Denne teknik vil gøre det muligt for forskerne effektivt at manipulere primær cellekulturer fra hvirvelløse havdyr og at lette den funktionelle evaluering af målrettede biologiske materialer på celler.

Her etablerede vi primær tarm cellekultur af A. japonicus og urerne cellerne. Figur 1 viser runde celler i forskellige stadier af dyrkning. Og EdU-farvnings analyserne giver direkte dokumentation for at afsløre den proliferativ aktivitet af disse runde celler i senere fase (figur 2). Vi har også lidt justeret protokollen, dyrkning af hakket væv blokke i stedet for filtrerede celler; Desuden kunne en spindel celletype dyrkes med succes. Denne cellety...

Watch this Scientific Journal Video about Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells at JoVE.com

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Denne protokol giver en nem at håndtere metode til kultur tarmcellerne fra havet agurk Apostichopus japonicus og er kompatibel med en række bredt tilgængelige vævsprøver fra marine organismer, herunder ECHINODERMATA, Mollusca, og krebsdyr.

Apoptose induktion og detektion i en primær kultur af Havagurk Tarmceller

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Protokollen giver en let at håndtere og bredt kompatibel primær cellekultur metode til marine hvirvelløse dyr. Denne teknik giver forskerne en måde at dyrke de marine hvirvelløse celler i forholdsvis lang tid. En cellekultur bør være forsynet med en ensartet genetisk baggrund for forskellige yderligere biologiske forsøgsformål inden for havbiologiforskning.Til den nye forskning på dette område mener vi, at den angivne forenklede protokol bør være det gode valg at udøve. Efter bedøvelse, dissekere og indsamle den forreste tarme, derefter afsnit vævsprøverne lodret og fjerne det indre indhold. Vævsprøverne i PBS vaskes to gange, og desinficer dem ved nedsænkning i en 75% ethanolopløsning i højst to sekunder.Derefter vaskes vævsprøverne i PBS tre gange for at fjerne ethanolen, og overfør ca. 100 mg vævsprøve i et to milliliter sterilt mikrocentrifugerør. Tilsæt 1,5 milliliter foroptimeret kulturmedium til havets agurkinalvævsblok, og hakke blokken med steriliseret kirurgisk saks, indtil opløsningen er uklar. Tilføj 400 mikroliter på 0,25% trypsin.Opløsningen blandes ved inversion, og den inkuberes i fem minutter ved stuetemperatur. Derefter filtreres opløsningen ved hjælp af en 100 mikrocelles si, og filtratet opsamres i et nyt sterilt mikrocentrifugerør med to milliliter. For valgfri forenklet protokol, væv blokke skåret i dyrkede medier kan overføres direkte til retter og efterfølgende inkuberet.Centrifuge røret ved 1700xG i tre minutter, kassér supernatanten, derefter re-suspendere pellet i kultur medium med antibiotika, og vask det med kultur medium to gange. Forudindstillet inkubatoren til cellekultur, og kør det på forhånd i mindst 24 timer med en temperatur på 18 grader Celsius og mættet luftfugtighed. Derefter re-suspendere cellerne ved hjælp af 200 mikroliter af det angivne medium, og overføre dem til fire centimeter retter.Kultur cellerne i en kuvøse. Efter seks timer, tage dem ud af rugemaskinen og tilsæt to milliliter af indiceret medium til cellen dyrkning retter. Hver 12 timer, skift halvdelen af mediet.Efter fem til syv dage begynder cellerne at dele sig. Reducere de negative virkninger af antibiotika ved at reducere koncentrationen af indicerede antibiotika, penicillin, streptomycin, og gentamicin i kulturmediet til det halve. Hver anden til tredje dag skal du udskifte cellekulturmediet.Når den primære celletæthed når 60 %, udføres cellepasning. Først vaskes de dyrkede celler to gange ved hjælp af PBS ved stuetemperatur. Tilsæt 200 mikroliter på 0,25% trypsin opløsning til hver skål, og manuelt agitere retterne, sikre hele bunden er dækket.Kassér trypsinopløsningen, og inkuber cellerne i fem minutter ved stuetemperatur. Vask cellerne med en milliliter frisk kulturmedium ved at pipettere og re-suspendere cellerne. Overfør 0,5 milliliter cellesuspension til en ny skål.Tilsæt 1,5 milliliter frisk medium, og inkuber cellerne ved 18 grader Celsius. Efter 12 timer, ændre mediet, og observere cellerne under et mikroskop for at vurdere betingelserne. Forbered tre eksperimentelle grupper, herunder en kontrol, og to grupper af løsninger, med en mikromolar og 100 mikromolar deximethazon.Efter inkubation med eller uden deximethazon i nul, 24 eller 48 timer vaskes cellerne tre gange med PBS. Efter at lyset er slukket, tilsættes 300 mikroliter hoechst 33258 opløsning pr. brønd til en 12 brøndplade, og forsigtigt omrøre pladen for at dække alle celler, hvilket sikrer deres farvning. Inkubere ved 18 grader Celsius i 30 minutter.Fjern derefter hoechst farvningsopløsningen og fastgør cellerne ved at tilføje 300 mikroliter af fire procent paraformaldehydopløsning i PBS til hver brønd. Ryst forsigtigt i 15 minutter. Derefter vaskes de faste celler tre gange i PBS.Hold PBS efter den sidste vask for at holde cellerne dækket. Tænd for fluorescerende mikroskop hardware, herunder kviksølvlampe magt, fluorescerende lys magt, og pc'en. Log på operativsystemet konto, starte softwaren, og kontrollere dens konfiguration. Anst samme klargjorte plade på mikroskopstadiet.Placer prøven over objektivets objektiv ved hjælp af scenecontrolleren. Find de celler af interesse under lyset mikroskop. Skift til fluorescerende mikroskopi og juster parametrene for excitation og emission til henholdsvis ca. 352 og 461 nanometer til henholdsvis nuklei-DNA-observation.Tag billederne. I denne undersøgelse, primære tarmcellekultur af havet agurk blev etableret og passage. Runde celler i forskellige stadier af dyrkning er vist her.Her er celler fastgjort til bunden af retter på den tredje dag, efter at være seedet. Her er cellespredning på den syvende dag. Her er celler fastgjort til bunden af retterne efter aflevering.Og celler, der mistede aktivitet og var ved at dø efter 10 passager. EDU med angivelse af analyser giver direkte dokumentation for at afsløre disse runde cellers spredningsaktivitet i senere faser. Stimuleringen med en mikromolardeximethazon øgede den apoptotiske cellehastighed hurtigst muligt sammenlignet med kontrollen og 100 mikromolardeximethazonstimulationen.De dyrkede celler blev behandlet med deximethazon i forskellige tidsperioder, efterfulgt af hoechst 33258 farvning for apoptotisk celledetektering. Cellebehandlinger før inkubering er afgørende for langsigtet kontrol. Det er en påmindelse om at prøve den valgfrie forenklede protokol, når cellen ikke vokser godt.Paraformaldehyd er moderat giftigt ved hudkontakt eller indånding, og det er dokumenteret som et sandsynligvis kræftfremkaldende stof hos mennesker.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering og Primær kultur Rotte levercellerne

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion og analyse af Epithelial til Mesenchymale Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolering og dyrkning af Mouse Primære Pancreas acinarceller

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

En video-protokollen af ​​retroviral infektion i Primary Intestinal organoide Kultur

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Vurdering af selektiv mRNA Translation i pattedyrceller polysom ​​Profilering

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering og primær kultur af muse aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Et grafisk brugergrænseflade til softwareassisteret sporing af proteinkoncentration i dynamiske cellulære protrusioner

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...