Name: apoptosis induction and detection in a primary culture of sea cucumber intestinal cells
Uploaded: 2020-01-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells at JoVE.com

המחברים רוצים להודות לפרופ ' נאנג'לי ז'או מאוניברסיטת ג'ה-ג'יאנג לעצתו הטכנית ולהכנת ציוד המעבדה שלו הזמין לשימוש. עבודה זו הייתה נתמכת כספית על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (הענקת מספרים 41876154, 41606150, ו 41406137) ואת קרנות המחקר הבסיסי עבור אוניברסיטאות מחוזי ג'ה-ג'יאנג ומכוני מחקר [גרנט מספר 2019JZ00007 ].

1. הכנה לתרבות התא בינונית
<ol><li>
הכנת נוזלים קומטומית
	<ol>
<li>
אוסף הנוזלים קואוממית: בתנאים סטריליים, בנתח מלפפון ים בריא (משקל רטוב של 85-105 גרם), לאסוף נוזל קולאומית, ולאחסן אותו בבקבוקון זכוכית סטרילית.</li>
		<li>
הסרת תא קואוממית: צנטריפוגה את הנוזל קולאומית ב 50 mL צנט?...

<ol>
	<li>Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenesis+in+primary+cell+cultures+from+larvae+of+the+abalone,+Haliotis+rufescens.">Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens.</a> Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).</li><li>Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+regeneration+and+biomineralization+in+sea+urchins:+role+of+Notch+signaling+and+presence+of+stem+cell+markers.">Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers.</a> Plos One. 10 (8), 0133860 (2015).</li><li>Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptional+time-course+analysis+of+oral+vs.+aboral+whole-body+regeneration+in+the+Sea+anemone+Nematostella+vectensis.">A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis.</a> Bmc Genomics. 17, 718 (2016).</li><li>Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+immune+response+to+bacterial+LPS+in+the+sea+urchin+Paracentrous+lividus+(Lamarck,+1816).">Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816).</a> Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).</li><li>Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+variation+in+anaerobic+energy+metabolism+reflects+hypoxia+tolerance+across+the+intertidal+and+subtidal+distribution+of+the+Pacific+oyster+(Crassostrea+gigas).">Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas).</a> Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).</li><li>Han, G., Zhang, S., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+metabolism+and+thermal+tolerance:+The+importance+of+opine+pathways+on+survival+of+a+gastropod+after+cardiac+dysfunction.">Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction.</a> Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sea+cucumber+genome+provides+insights+into+morphological+evolution+and+visceral+regeneration.">The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration.</a> PLoS Biology. 15 (10), 2003790 (2017).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iTRAQ+reveals+proteomic+changes+during+intestine+regeneration+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus.">iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).</li><li>Xu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+loss+by+apoptosis+is+involved+in+the+intestinal+degeneration+that+occurs+during+aestivation+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus.">Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).</li><li>Yang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+characteristics+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+(Selenka)+during+aestivation.">Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).</li><li>Xiang, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolytic+regulation+in+aestivation+of+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus:+evidence+from+metabolite+quantification+and+rate-limiting+enzyme+analyses.">Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses.</a> Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).</li><li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+feedback+loop+involving+FREP+and+NF-kappaB+regulates+the+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus.">A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).</li><li>Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+mRNA-miRNA+interaction+analysis+associate+with+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+based+on+transcriptome+database.">Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database.</a> Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).</li><li>Cai, X., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+invertebrate+cell+culture:+a+decade+of+development.">Marine invertebrate cell culture: a decade of development.</a> Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).</li><li>Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Approach+to+Primary+Cell+Culture+for+Octopus+vulgaris+Neurons.">A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons.</a> Frontiers in Physiology. 9, 220 (2018).</li><li>Pinsino, A., Alijagic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+urchin+Paracentrotus+lividus+immune+cells+in+culture:+formulation+of+the+appropriate+harvesting+and+culture+media+and+maintenance+conditions.">Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions.</a> Biology Open. 8 (3), (2019).</li><li>Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+holothurian+tissues+as+a+source+of+cells+for+long-term+cell+cultures.">Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures.</a> Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).</li><li>Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+Molecular+Mechanisms+and+Pathogenicity.">Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity.</a> Excli Journal. 8, 155-181 (2009).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis,+proliferation,+and+morphology+during+vein+graft+remodeling+in+rabbits.">Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits.</a> Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).</li><li>Kasibhatla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+of+suspension+cells+with+hoechst+33258+to+detect+apoptosis.">Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).</li><li>Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+long-term,+high-dose+dexamethasone+administration+on+proliferation+and+apoptosis+in+porcine+hepatocytes.">Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes.</a> Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).</li><li>Rinkevich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cultures+from+marine+invertebrates:+new+insights+for+capturing+endless+stemness.">Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness.</a> Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).</li><li>Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+of+regenerating+holothurian+tissues.">Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+water+temperature+on+the+growth+and+fatty+acid+profiles+of+juvenile+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+(Selenka).">Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka).</a> Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).</li></ol>

מאמצי מחקר נרחבים הקדישו להקמת קווי תאים בעשורים האחרונים, עם זאת, עדיין קשה לבצע התקדמות בתרבות ארוכת טווח של תאים מחסרי חוליות ימיים14,22. דווח כי תאים מתורבתים מליצור מתחדשות רקמות הולותאנית היו קיימא לתקופה ארוכה של זמן ופעילות גבוהה של התפשטות ניתן לזהו?...

התאים המוגמרים בתנאים מלאכותיים, ולא בסביבתם הטבעית, מספקים חומרים ניסיוניים אחידים למחקרים ביולוגיים, במיוחד למינים שאינם יכולים להיות מתורבתים בקלות בסביבת מעבדה. בחשבון של יותר מ -30% מכלל המינים בעלי החיים הימיים,והם מספקיםחומרים ביולוגיים רבים למחקר התחייבות על מנגנוני הרגולציה של תהליכים ביולוגיים ספציפיים, כגון התחדשות2,3, לחץ התגובה4, והסתגלות סביבתית5,6.
מלפפון-ים האפוסטיקוס, הוא אחד מזני הקווצי הנלמדים ביותר הנמצאים במים ממוזגים לאורך החוף הצפוני של האוקיאנוס השקט. הוא ידוע גם כמינים חשובים מבחינה מסחרית ולחקלאות בקנה מידה גדול במזרח אסיה, בעיקר בסין7. שאלות מדעיות רבות לגבי היפנים, כולל מנגנוני הרגולציה שבבסיס התחדשות המעיים לאחר הוצאת המעיים8 וניוון בשנת9, בקרה מטבולית10,11, התגובה החיסונית12,13 תחת תרמי או פתוגניים מדגיש, משכו את תשומת לבם של חוקרים. עם זאת, בהשוואה לבעלי חיים מדגם היטב, מחקר בסיסי, בעיקר במישור הסלולר, מוגבל על-ידי צווארי בקבוק טכניים, כגון חוסר שיטות מתקדמות בתרבות התא.
החוקרים הקדישו מאמץ רב להקמת קווי תאים, אבל הם גם התמודד עם אתגרים רבים ולא קו התאים של כל חסרי חוליות ימיים הוקמה עדיין14. עם זאת, תרבויות התאים הראשוניים של חסרי חוליות ימיים מתקדמים בעשורים האחרונים15,16, והם סיפקו הזדמנות לניסויים ברמה התאית. לדוגמה, האינטסינוס הניתן ליצירה מתוך מקור הפקוניקוס נוצל כמקור תאים לתרביות תאים לטווח ארוך שסיפקו שיטה מעשית לתרבות התא הראשונית של חסרי חוליות ימיים17. פרוטוקול זה משולב ואופטימיזציה חסרי חוליות התרבות התאים מתקרב ופיתח שיטת התרבות הראשית מתאים באופן נרחב עבור מלפפון ים או חסרי חוליות ימיים אחרים.
אפופטוזיס היא תוכנית התאבדות התא הפנימי המופעל על ידי שונים הגירויים אנסוגני ואנדוגניים. אפופטוזיס מתואמת הוא חיוני למערכות ביולוגיות רבות18,19, וזה היה מעורב רגרסיה המעי של מלפפון ים במהלך הזמן הנכון9. כדי לחקור את תהליך האפוטוטיק באורגניזמים של עניין, סדרה של שיטות, כולל כתמים הוקוסט ומיקרוסקופיה, הוקמו והוחלו בהצלחה20. כאן, אנו מתנהל ואפופטוזיס השראה ואיתור בתאי המעי העיקרי תרבותי של מלפפון ים כדי להעריך את השימושיות של תאים ראשוניים במחקרים ביולוגיים של חסרי חוליות ימיים. Dexamethasone, אחד הנפוצים בשימוש גלוקוקורטיקוסטרואידים21, שימש כדי לגרום אפופטוזיס בתאי מעיים מתורבת מלפפון ים, ואות הופסט משמעותי 33258 התגלתה בהצלחה בתאי הכתמים על ידי מיקרוסקופ פלורסנט.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLVV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m filter</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 cm dishes</td>
			<td>ExCell Bio</td>
			<td>CS016-0124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde solution</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80096618</td>
			<td>in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuges</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Allegra X-30R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BeyoClick EdU-488 kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0071S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10005817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Lucky Riptile</td>
			<td>HN-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW00500221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric thermostatic water bath</td>
			<td>senxin17</td>
			<td>DK-S28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80176961</td>
			<td>75%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor(FGF)</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica DMI3000B</td>
			<td>DMI3000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Garamycin</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW14054101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>63005518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst33258 Staining solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW1106168001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin like Growth Factor(IGF)</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10016308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM41300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (100 mg/mL)</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM-21051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW77863031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10020518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td>pH7.2-7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH meter</td>
			<td>Bante</td>
			<td>A120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE</td>
			<td>Seebio</td>
			<td>185791</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

apoptosis induction and detection in a primary culture of sea cucumber intestinal cells

תאים מתורבתים ראשוניים משמשים במגוון דיסציפלינות מדעיות ככלים חשובים במיוחד להערכה פונקציונלית של חומרים ביולוגיים או אפיון של פעילויות ביולוגיות ספציפיות. עם זאת, בשל היעדר התקשורת האוניברסלית הישימה של תרבות התא ופרוטוקולים, תיאר היטב שיטות התרבות תאים עבור אורגניזמים ימיים עדיין מוגבלים. בינתיים, הזיהום הנפוץ ביותר של חיידקים ותכונות פוליטרופי של התאים החסרי חוליות ימיים עוד לעכב את הקמת האסטרטגיה האפקטיבית תרבות התא עבור חסרי חוליות ימיים. כאן, אנו מתארים שיטה קלה לטפל לתאי מעיים culturing מלפפון ים האפוסטיקוס; בנוסף, אנו מספקים דוגמה האינדוקציה ואפופטוזיס מבחנה ואיתור בתאי המעי העיקריים תרבותי. כמו-כן, ניסוי זה מספק פרטים אודות השיטה המתאימה ביותר לאוסף התרבות ולאיסוף התאים. הפרוטוקול המתואר מתאים למגוון של דגימות רקמה בהיקף נרחב מאורגניזמים ימיים, כולל קווקדרפה, מוללוסקה וסרטנים, והוא יכול לספק תאים מספיקים עבור מספר יישומים ניסיוניים בעלי מבחנה. טכניקה זו תאפשר לחוקרים לטפל ביעילות בתרבויות התאים הראשוניים מחסרי חוליות ימיים ולהקל על הערכה פונקציונלית של חומרים ביולוגיים ייעודיים על תאים.

כאן, הקמנו את התרבות הראשית של תאי המעי . איור 1 מראה תאים עגולים בשלבים שונים של culturing. ו-EdU מכתים לספק ראיות ישירות כדי לחשוף את הפעילות ההתרבות של התאים העגולים האלה בשלב מאוחר יותר (איור 2). אנחנו גם קצת להתאים את הפרוטוקול, culturing בלוקים הרקמה הקצוצה במק?...

Watch this Scientific Journal Video about Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells at JoVE.com

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

פרוטוקול זה מספק שיטה קלה לאחיזה לתרבות תאי המעיים ממלפפון המים האפוסטיקוס והיא מתאימה למגוון של דגימות רקמה בהיקף נרחב מאורגניזמים ימיים, כולל קווקדרפה, מולסקה וסרטנים.

ואפופטוזיס השראה ואיתור בתרבות העיקרית של מלפפונים בתאי מעיים ים

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

הפרוטוקול מספק שיטת תרבות תאים ראשית קלה לטיפול ותואמת באופן נרחב עבור חסרי חוליות ימיים. טכניקה זו נותנת לחוקרים דרך לתרבת את התאים חסרי החוליות הימיים במשך זמן רב יחסית. תרבות של תאים צריכה להיות מסופקת עם רקע גנטי עקבי עבור יישומים ניסיוניים ביולוגיים נוספים שונים במחקר ביולוגיה ימית.למחקר החדש בתחום זה, אנו מאמינים כי הפרוטוקול המפושט המצוין צריך להיות הבחירה הטובה לממש. לאחר הרדמה, לנתח ולאסוף את המעיים הפנימיים, ולאחר מכן לפצל את דגימות הרקמה אנכית ולהסיר את התוכן הפנימי. לשטוף את דגימות הרקמה PBS פעמיים לחטא אותם על ידי טבילה בתתבון 75%אתנול במשך לא יותר משתי שניות.ואז לשטוף את דגימות הרקמה PBS שלוש פעמים כדי להסיר את האתנול, ולהעביר כ 100 מיליגרם של דגימת רקמה לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי שני מיליליטר. מוסיפים 1.5 מיליליטר של מדיום תרבות ממוטב מראש לגוש רקמת המעי של מלפפון הים וטחון את הבלוק במספריים כירורגיים מעוקרים עד שהפתרון מעונן. הוסף 400 מיקרוליטרים של 0.25%טריפסין.מערבבים את הפתרון על ידי היפוך ו דגירה אותו במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לסנן את הפתרון באמצעות מסננת תא 100 מיקרון ולאסוף את הסינון בצינור צנטריפוגה מיקרו סטרילי חדש שני מיליליטר. עבור פרוטוקול אופציונלי פשוט, בלוקים רקמות לחתוך במדיה מתורבתת ניתן להעביר ישירות לתוך כלים ולאחר מכן דגירה.צנטריפוגה הצינור ב 1700xG במשך שלוש דקות, להשליך את supernatant, ולאחר מכן להשעות מחדש את גלולה במדיום תרבות עם אנטיביוטיקה, ולשטוף אותו עם מדיום תרבות פעמיים. הגדר מראש את החממה לתרבות התאים, והפעל אותה מראש לפחות 24 שעות עם טמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס ולחות רוויה. לאחר מכן להשעות מחדש את התאים באמצעות 200 microliters של בינוני המצוין, ולהעביר אותם לתוך מנות ארבעה סנטימטרים.תרבו את התאים באינקובטור. לאחר שש שעות, מוציאים אותם מהאינקובטור ומוסיפים שני מיליליטר של מדיום מצוין לתא. כל 12 שעות, תחליף חצי מהמדיום.לאחר חמישה עד שבעה ימים, התאים מתחילים להתחלק. להפחית את ההשפעות השליליות של אנטיביוטיקה על ידי הפחתת הריכוז של אנטיביוטיקה המצוין, פניצילין, סטרפטומיצין, ג'נטמיצין באמצעי התרבות על ידי חצי. כל יומיים עד שלושה ימים, החלף את מדיום תרבות התא.כאשר צפיפות התאים הראשית מגיעה ל- 60%- ביצוע מעבר תאים. ראשית, לשטוף את התאים התרבותיים פעמיים באמצעות PBS בטמפרטורת החדר. הוסיפו 200 מיקרוליטרים של תווי טריפסין של 0.25% לכל מנה, והתסיסו ידנית את הכלים, והבטיחו שכל התחתית מכוסה.השלך את תווי הטרפסין, והדרגר את התאים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של מדיום תרבות טרי על ידי צינורות מחדש השעיית התאים. מעבירים 0.5 מיליליטר של השעיית תאים לצלחת חדשה.מוסיפים 1.5 מיליליטר של מדיום טרי, ומדגירה את התאים ב 18 מעלות צלזיוס. לאחר 12 שעות, לשנות את המדיום, ולצפות בתאים תחת מיקרוסקופ כדי להעריך את התנאים. הכינו שלוש קבוצות ניסוי, כולל בקרה, ושתי קבוצות פתרונות, עם מיקרומולר אחד ו-100 מיקרומולרים דקסימטזון.לאחר הדגירה עם או בלי deximethazone עבור אפס, 24, או 48 שעות, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. לאחר כיבוי האור, הוסיפו 300 מיקרוליטרים של תוסף hoechst 33258 ל-12 בארות, והתסיסו בעדינות את הצלחת כדי לכסות את כל התאים, ולהבטיח את הכתמים שלהם. דגירה ב 18 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.לאחר מכן להסיר את פתרון הכתמים hoechst ולתקן את התאים על ידי הוספת 300 microliters של פתרון ארבעה אחוז paraformaldehyde ב PBS לכל באר. מתסיסים בעדינות במשך 15 דקות. לאחר מכן, לשטוף את התאים הקבועים שלוש פעמים PBS.שמור על PBS לאחר הכביסה האחרונה כדי לשמור על התאים מכוסים. הפעל את חומרת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי, כולל כוח מנורת הכספית, כוח האור הפלואורסצנטי והמחשב. היכנס לחשבון מערכת ההפעלה, הפעל את התוכנה ובדוק את התצורה שלה. מניחים את הצלחת המוכנה על במת המיקרוסקופ.מקם את הדגימה מעל העדשה האובייקטיבית באמצעות בקר הבמה. מצא את התאים המעניינים תחת מיקרוסקופ האור. עברו למיקרוסקופיה פלואורסצנטיה והתאימו את הפרמטרים של העירור וההפצלה לכ-352 ו-461 ננומטר, בהתאמה, לתצפית גרעיני דנ"א.ללכוד את התמונות. במחקר זה, תרבות תאי המעי העיקרי של מלפפון ים הוקמה והתפתה. תאים עגולים בשלבים שונים של culturing מוצגים כאן.הנה תאים המחוברים לתחתית הכלים ביום השלישי, לאחר שנזרעו. הנה התפשטות תאים ביום השביעי. להלן תאים המחוברים לתחתית הכלים לאחר המעבר.ותאים שאיבדו פעילות וגססו אחרי 10 מעברים. EDU המציינת כי הראיה מספקת ראיות ישירות כדי לחשוף את הפעילות השגשוג של תאים עגולים אלה בשלבים מאוחרים יותר. הגירוי עם דקסימטזון מיקרומולרי אחד הגדיל את קצב התאים האפטוטיים במהירות הרבה ביותר, בהשוואה לבקרה ולגירוי 100 המיקרומולרים deximethazone.התאים המתורבתים טופלו עם deximethazone לפרקי זמן שונים, ואחריו hoechst 33258 כתמים לגילוי תאים אפטוטיים. טיפולים בתאים לפני הדגירה הם קריטיים לבקרה ארוכת טווח. זוהי תזכורת לנסות את הפרוטוקול האופציונלי המפושט כאשר התא אינו גדל היטב.Paraformaldehyde רעיל בינוני על ידי מגע בעור או שאיפה, והוא מתועד כמסרטן אנושי כנראה.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

איתור Immunofluorescent של שני אנלוגים Thymidine (CldU ו IdU) ברקמה ראשי

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

אינדוקציה ובדיקה של היפוקסיה בתרבות התא

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

פרוטוקול וידאו של זיהום retroviral ביסודי מעיים Organoid תרבות

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

הערכת סלקטיבי mRNA התרגום בתאי יונקים ידי Polysome פרופיל

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...