Name: apoptosis induction and detection in a primary culture of sea cucumber intestinal cells
Uploaded: 2020-01-21T14:00:00
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著者たちは浙江大学のナイミング周教授の技術アドバイスと研究室の設備の利用に感謝したいと思います。この研究は、中国国立自然科学財団(補助金番号41876154、41606150、41406137)と浙江省の大学・研究機関のための基礎研究基金[補助金番号2019JZ00007]によって財政的に支えられた].

1. 細胞培養培地調製
<ol><li>
コロミック流体製剤
	<ol>
<li>
コロミック流体コレクション:滅菌条件下で、健康なナマコ(85〜105gの湿式重量)を解剖し、コエロミック液を採取し、滅菌ガラスフラスコに貯蔵する。</li>
		<li>
コロミック細胞除去:5分間1,700 x gで50 mL遠心管内のコロミック流体を遠心分離し、新しい滅菌ガラスフラスコに上清を移します。?...

<ol>
	<li>Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenesis+in+primary+cell+cultures+from+larvae+of+the+abalone,+Haliotis+rufescens.">Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens.</a> Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).</li><li>Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+regeneration+and+biomineralization+in+sea+urchins:+role+of+Notch+signaling+and+presence+of+stem+cell+markers.">Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers.</a> Plos One. 10 (8), 0133860 (2015).</li><li>Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptional+time-course+analysis+of+oral+vs.+aboral+whole-body+regeneration+in+the+Sea+anemone+Nematostella+vectensis.">A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis.</a> Bmc Genomics. 17, 718 (2016).</li><li>Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+immune+response+to+bacterial+LPS+in+the+sea+urchin+Paracentrous+lividus+(Lamarck,+1816).">Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816).</a> Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).</li><li>Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+variation+in+anaerobic+energy+metabolism+reflects+hypoxia+tolerance+across+the+intertidal+and+subtidal+distribution+of+the+Pacific+oyster+(Crassostrea+gigas).">Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas).</a> Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).</li><li>Han, G., Zhang, S., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+metabolism+and+thermal+tolerance:+The+importance+of+opine+pathways+on+survival+of+a+gastropod+after+cardiac+dysfunction.">Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction.</a> Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sea+cucumber+genome+provides+insights+into+morphological+evolution+and+visceral+regeneration.">The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration.</a> PLoS Biology. 15 (10), 2003790 (2017).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iTRAQ+reveals+proteomic+changes+during+intestine+regeneration+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus.">iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).</li><li>Xu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+loss+by+apoptosis+is+involved+in+the+intestinal+degeneration+that+occurs+during+aestivation+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus.">Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).</li><li>Yang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+characteristics+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+(Selenka)+during+aestivation.">Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).</li><li>Xiang, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolytic+regulation+in+aestivation+of+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus:+evidence+from+metabolite+quantification+and+rate-limiting+enzyme+analyses.">Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses.</a> Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).</li><li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+feedback+loop+involving+FREP+and+NF-kappaB+regulates+the+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus.">A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).</li><li>Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+mRNA-miRNA+interaction+analysis+associate+with+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+based+on+transcriptome+database.">Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database.</a> Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).</li><li>Cai, X., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+invertebrate+cell+culture:+a+decade+of+development.">Marine invertebrate cell culture: a decade of development.</a> Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).</li><li>Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Approach+to+Primary+Cell+Culture+for+Octopus+vulgaris+Neurons.">A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons.</a> Frontiers in Physiology. 9, 220 (2018).</li><li>Pinsino, A., Alijagic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+urchin+Paracentrotus+lividus+immune+cells+in+culture:+formulation+of+the+appropriate+harvesting+and+culture+media+and+maintenance+conditions.">Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions.</a> Biology Open. 8 (3), (2019).</li><li>Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+holothurian+tissues+as+a+source+of+cells+for+long-term+cell+cultures.">Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures.</a> Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).</li><li>Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+Molecular+Mechanisms+and+Pathogenicity.">Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity.</a> Excli Journal. 8, 155-181 (2009).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis,+proliferation,+and+morphology+during+vein+graft+remodeling+in+rabbits.">Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits.</a> Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).</li><li>Kasibhatla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+of+suspension+cells+with+hoechst+33258+to+detect+apoptosis.">Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).</li><li>Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+long-term,+high-dose+dexamethasone+administration+on+proliferation+and+apoptosis+in+porcine+hepatocytes.">Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes.</a> Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).</li><li>Rinkevich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cultures+from+marine+invertebrates:+new+insights+for+capturing+endless+stemness.">Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness.</a> Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).</li><li>Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+of+regenerating+holothurian+tissues.">Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+water+temperature+on+the+growth+and+fatty+acid+profiles+of+juvenile+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+(Selenka).">Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka).</a> Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).</li></ol>

過去数十年にわたり、細胞株の確立に向けた広範な研究努力が行われてきましたが、海洋無脊椎動物14、22からの細胞の長期培養の進展はまだ困難です。ホロチュリアン組織の再生から培養した細胞は長期間生存し、増殖の高い活性が特定の細胞17、23で検出できることが報告されている。しかしながら、?...

人工的に制御された条件下で細胞を培養し、自然環境ではなく、特に実験室環境で容易に培養できない種に対して、生物学的研究のための均一な実験材料を提供します。海洋無脊椎動物は全動物種1の30%以上を占め、再生2、3、ストレス応答4、環境適応5、6などの特定の生物学的プロセスの調節機構に関する研究を行うための多数の生物学的材料を提供する。
ナマコ、アポストコモスジャポニクスは、北太平洋沿岸の温帯水域に生息する最も研究されたエキノデルム種の一つです。東アジア、特に中国7では、商業的に重要な種として知られており、大規模にマリカルチャーされています。A.ジャポニクスに関する多くの科学的な質問は、死後8後の腸の再生の基礎となる調節機構および失神9の変性、代謝制御10、11、および免疫応答12、13熱ストレスまたは病原性ストレス下で、研究者の注目を集めている。しかしながら、よく研究されたモデル動物と比較して、基礎研究、特に細胞レベルに関する研究は、高度な細胞培養方法の欠如などの技術的なボトルネックによって制限される。
研究者は細胞株の確立に多くの努力を捧げてきたが、彼らはまた、多くの課題に直面しており、海洋無脊椎動物からの細胞株はまだ14を確立していない。しかし、海洋無脊椎動物からの一次細胞培養は、過去数十年で進歩した15、16、そして彼らは細胞レベルで実験する機会を提供している。例えば、A.ジャポニクスからの再生インテシンは、海洋無脊椎動物17の一次細胞培養のための実用的な方法を提供した長期細胞培養のための細胞源として利用されている。このプロトコルは、無脊椎動物細胞培養アプローチを組み合わせ、最適化し、ナマコまたは他の海洋無脊椎動物に広く適した一次培養方法を開発した。
アポトーシスは、様々な内因性および内因性刺激によって引き起こされる本質的な細胞自殺プログラムである。協調アポトーシスは、多くの生物学的システム18、19にとって極めて重要であり、そして、それは、アスティベーション9の間にナマコの腸の退行に関与している。目的の生物におけるアポトーシス過程を調べるために、Hoechst染色および顕微鏡アッセイを含む一連の方法が確立され、20を正常に適用した。ここでは、ナマコの一次培養腸細胞におけるアポトーシス誘導と検出を行い、海洋無脊椎動物の生物学的研究における一次細胞の使いやすさを評価した。一般的に使用される合成グルココルチコステロイド21の一つであるデキサメタゾンは、ナマコから培養腸細胞にアポトーシスを誘導するために使用され、有意なHoechst 33258シグナルは蛍光顕微鏡により染色細胞内で検出に成功した。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLVV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m filter</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 cm dishes</td>
			<td>ExCell Bio</td>
			<td>CS016-0124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde solution</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80096618</td>
			<td>in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuges</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Allegra X-30R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BeyoClick EdU-488 kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0071S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10005817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Lucky Riptile</td>
			<td>HN-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW00500221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric thermostatic water bath</td>
			<td>senxin17</td>
			<td>DK-S28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80176961</td>
			<td>75%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor(FGF)</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica DMI3000B</td>
			<td>DMI3000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Garamycin</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW14054101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>63005518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst33258 Staining solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW1106168001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin like Growth Factor(IGF)</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10016308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM41300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (100 mg/mL)</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM-21051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW77863031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10020518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td>pH7.2-7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH meter</td>
			<td>Bante</td>
			<td>A120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE</td>
			<td>Seebio</td>
			<td>185791</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

apoptosis induction and detection in a primary culture of sea cucumber intestinal cells

一次培養細胞は、生物物質の機能評価や特定の生物学的活動の特徴付けのための非常に重要なツールとして、様々な科学的分野で使用されています。しかしながら、普遍的に適用可能な細胞培養培地およびプロトコルの欠如のために、海洋生物に対する細胞培養方法は依然として限定的である。一方、海洋無脊椎動物細胞の一般的に起こっている微生物汚染および多発性特性は、海洋無脊椎動物に対する効果的な細胞培養戦略の確立をさらに妨げる。ここでは、ナマコアポジコプスヤポニクスから腸細胞を培養するための扱いやすい方法について説明します。さらに、一次培養腸細胞におけるインビトロアポトーシス誘導および検出の例を提供する。また、本実験では、適切な培養培地及び細胞採取方法について詳細を提供する。記載されたプロトコルは、エキノデルマタ、モルスカ、および甲殻類を含む海洋生物から広く利用可能な様々な組織サンプルと互換性があり、複数のin vitro実験用途に十分な細胞を提供することができる。この技術により、研究者は海洋無脊椎動物からの一次細胞培養物を効率的に操作し、細胞上の標的生物学的物質の機能的評価を容易にすることが可能になる。

ここでは、A.ジャポニクスの原発性腸細胞培養を確立し、細胞を通過させた。図1は、培養の異なる段階における丸い細胞を示す。そして、EdU染色アッセイは、後の段階でこれらの丸細胞の増殖活性を明らかにする直接的な証拠を提供する(図2)。我々はまた、濾過細胞の代わりに細分化された組織ブロックを培養し、プロトコルをわずかに調?...

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Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

このプロトコルは、ナマコアポスピコプスジャポニクスから腸細胞を培養するための扱いやすい方法を提供し、エキノデルマ、モルスカ、甲殻類を含む海洋生物から広く利用可能な様々な組織サンプルと互換性があります。

ナマコ腸細胞の一次培養におけるアポトーシス誘導と検出

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

このプロトコルは、海洋無脊椎動物に対して扱いやすく、広く適合する一次細胞培養法を提供します。この技術は、研究者に海洋無脊椎動物細胞を比較的長い時間培養する方法を与える。細胞の培養は、海洋生物学研究における異なるさらなる生物学的実験アプリケーションのための一貫した遺伝的背景を提供されるべきである。この分野の新しい研究では、示された簡略化されたプロトコルが行使する良い選択であるべきだと考えています。麻酔後、前腸を解剖して収集し、組織サンプルを垂直に切り離し、内部内容物を除去する。PBSで組織サンプルを2回洗浄し、75%エタノール溶液に2秒以内に浸漬して消毒します。次いで、組織サンプルをPBSで3回洗浄してエタノールを除去し、約100ミリグラムの組織サンプルを2ミリリットルの無菌マイクロ遠心チューブに移した。ナマコの腸組織ブロックに1.5ミリリットルの事前に最適化された培養培地を加え、溶液が曇るまで滅菌された外科用ハサミでブロックをミンチします。0.25%トリプシンの400マイクロリットルを追加します。溶液を反転で混ぜ、室温で5分間インキュベートします。次に、100ミクロンの細胞ストレーナーを使用して溶液を濾過し、新しい滅菌2ミリリットルマイクロ遠心チューブに濾液を収集します。任意の簡易プロトコルのために、培養された媒体で切断されたティッシュブロックは、直接皿に移され、その後インキュベートすることができる。チューブを1700xGで3分間遠心し、上清を捨て、次いで抗生物質でペレットを培地中に再中断し、培養培地で2回洗浄する。細胞培養用インキュベーターをあらかじめ設定し、最低24時間、摂氏18度と飽和湿度で予め実行します。その後、示された培地の200マイクロリットルを使用して細胞を再中断し、4センチメートルの皿に移します。培養器で細胞を培養する。6時間後、それらをインキュベーターから取り出し、示された培地の2ミリリットルを細胞培養皿に加えます。12時間ごとに、培地の半分を変更します。5~7日後、細胞は分裂し始める。示された抗生物質、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびゲンタマイシンの濃度を培地中で半分に減らすことによって、抗生物質の副作用を軽減する。2~3日ごとに、細胞培養培地を交換する。一次細胞密度が60%に達すると、細胞の通過を行う。まず、培養細胞を室温でPBSを用いて2回洗浄する。各皿に0.25%トリプシン溶液の200マイクロリットルを加え、手動で皿を攪拌し、底全体が覆われていることを確認します。トリプシン溶液を捨て、室温で5分間培養します。1ミリリットルの新鮮な培養培地で細胞を洗浄し、細胞をピペット化し、再懸濁させます。新しい皿に細胞懸濁液の0.5ミリリットルを移す。新鮮な培地を1.5ミリリットル加え、18°Cで細胞をインキュベートします。12時間後、培地を変え、顕微鏡下で細胞を観察し、その条件を評価した。コントロールを含む3つの実験グループと、1つのマイクロモルと100マイクロモルデシメタズンを含む2つの溶液グループを準備します。デキシメタゾールの有無にかかわらず、ゼロ、24、または48時間のインキュベーション後、PBSで細胞を3回洗浄する。光を消した後、12ウェルプレートに1ウェルあたり300マイクロリットルのhoechst 33258溶液を加え、プレートを軽く攪拌してすべての細胞を覆い、染色を確実にします。摂氏18度で30分間インキュベートします。次に、hoechst染色液を取り除き、各ウェルにPBSに4%パラホルムアルデヒド溶液の300マイクロリットルを加えて細胞を固定します。15分間静かに攪拌します。その後、固い細胞をPBSで3回洗浄する。最後の洗浄後にPBSを保管し、細胞を覆い続けます。水銀灯パワー、蛍光灯パワー、PCなどの蛍光顕微鏡ハードウェアをオンにします。オペレーティング システム アカウントにログインし、ソフトウェアを起動し、その構成を確認します。準備したプレートを顕微鏡ステージに置きます。ステージコントローラを使用して、サンプルを対物レンズの上に置きます。光学顕微鏡の下で目的の細胞を見つける。蛍光顕微鏡に切り替え、核DNA観察のために、励起および放出のパラメータをそれぞれ約352および461ナノメートルに調整します。画像をキャプチャします。本研究では、ナマコの初代腸細胞培養が確立され、継代された。培養の異なる段階での丸い細胞がここに示されている。ここでは、播種された後、3日目に皿の底に取り付けられた細胞があります。ここでは7日目の細胞増殖です。ここでは、合格後の皿の底に取り付けられた細胞があります。そして、活動を失い、10の通過後に死んでいた細胞。EDU記載のアッセイは、後の段階でこれらの丸い細胞の増殖活性を明らかにするための直接的な証拠を提供する。1つのミクロモルデキシメタズンによる刺激は、コントロールおよび100マイクロモルデキシメタゾール刺激と比較して、アポトーシス細胞速度を最も急速に増加した。培養細胞を異なる期間デシメタゾールで処理し、続いてアポトーシス細胞検出用にhoechst 33258染色を行った。インキュベート前の細胞治療は、長期制御にとって重要です。セルがうまく成長しない場合は、オプションの簡略化されたプロトコルを試してみることを思い出させるものです。パラホルムアルデヒドは、皮膚接触または吸入によって適度に有毒であり、それはおそらくヒト発がん性物質として文書化されている。

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

初代培養およびコルチのマウス臓器のプラスミドエレクトロ。

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

一次組織の二つのチミジン類似体の免疫蛍光検出（CldUとIDU）

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

細胞培養で誘導し、低酸素のテスト

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

ラット肝細胞の単離及び初代培養

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

間葉転換を誘導し、上皮の分析

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

マウスプライマリ膵臓腺房細胞の単離と培養

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

初代腸オルガノイド培養におけるレトロウイルス感染のビデオプロトコル

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

ポリソームプロファイリングによる哺乳動物細胞における選択的mRNAの翻訳の評価

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

マウス大動脈内皮細胞の単離および初代培養

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...