Name: apoptosis induction and detection in a primary culture of sea cucumber intestinal cells
Uploaded: 2020-01-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить профессора Наиджина Чжоу из Университета Чжэцзян за его технические рекомендации и за то, что он сделал оборудование его лаборатории доступным для использования. Эта работа была финансово поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант номера 41876154, 41606150, и 41406137) и фундаментальных научно-исследовательских фондов для чжэцзян провинциальных университетов и научно-исследовательских институтов (грант номер 2019J'00007) ].

1. Средняя подготовка клеточной культуры
<ol><li>
Coelomic препарат жидкости
	<ol>
<li>
Коллекция coelomic жидкости: В стерильных условиях вскрыть здоровый морской огурец (мокрый вес 85-105 г), собрать коеломную жидкость и хранить ее в стерильной стеклянной колбе.</li>
		<li>
Удаление coel...

<ol>
	<li>Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenesis+in+primary+cell+cultures+from+larvae+of+the+abalone,+Haliotis+rufescens.">Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens.</a> Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).</li><li>Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+regeneration+and+biomineralization+in+sea+urchins:+role+of+Notch+signaling+and+presence+of+stem+cell+markers.">Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers.</a> Plos One. 10 (8), 0133860 (2015).</li><li>Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptional+time-course+analysis+of+oral+vs.+aboral+whole-body+regeneration+in+the+Sea+anemone+Nematostella+vectensis.">A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis.</a> Bmc Genomics. 17, 718 (2016).</li><li>Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+immune+response+to+bacterial+LPS+in+the+sea+urchin+Paracentrous+lividus+(Lamarck,+1816).">Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816).</a> Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).</li><li>Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+variation+in+anaerobic+energy+metabolism+reflects+hypoxia+tolerance+across+the+intertidal+and+subtidal+distribution+of+the+Pacific+oyster+(Crassostrea+gigas).">Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas).</a> Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).</li><li>Han, G., Zhang, S., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+metabolism+and+thermal+tolerance:+The+importance+of+opine+pathways+on+survival+of+a+gastropod+after+cardiac+dysfunction.">Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction.</a> Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sea+cucumber+genome+provides+insights+into+morphological+evolution+and+visceral+regeneration.">The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration.</a> PLoS Biology. 15 (10), 2003790 (2017).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iTRAQ+reveals+proteomic+changes+during+intestine+regeneration+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus.">iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).</li><li>Xu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+loss+by+apoptosis+is+involved+in+the+intestinal+degeneration+that+occurs+during+aestivation+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus.">Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).</li><li>Yang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+characteristics+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+(Selenka)+during+aestivation.">Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).</li><li>Xiang, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolytic+regulation+in+aestivation+of+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus:+evidence+from+metabolite+quantification+and+rate-limiting+enzyme+analyses.">Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses.</a> Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).</li><li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+feedback+loop+involving+FREP+and+NF-kappaB+regulates+the+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus.">A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).</li><li>Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+mRNA-miRNA+interaction+analysis+associate+with+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+based+on+transcriptome+database.">Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database.</a> Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).</li><li>Cai, X., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+invertebrate+cell+culture:+a+decade+of+development.">Marine invertebrate cell culture: a decade of development.</a> Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).</li><li>Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Approach+to+Primary+Cell+Culture+for+Octopus+vulgaris+Neurons.">A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons.</a> Frontiers in Physiology. 9, 220 (2018).</li><li>Pinsino, A., Alijagic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+urchin+Paracentrotus+lividus+immune+cells+in+culture:+formulation+of+the+appropriate+harvesting+and+culture+media+and+maintenance+conditions.">Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions.</a> Biology Open. 8 (3), (2019).</li><li>Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+holothurian+tissues+as+a+source+of+cells+for+long-term+cell+cultures.">Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures.</a> Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).</li><li>Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+Molecular+Mechanisms+and+Pathogenicity.">Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity.</a> Excli Journal. 8, 155-181 (2009).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis,+proliferation,+and+morphology+during+vein+graft+remodeling+in+rabbits.">Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits.</a> Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).</li><li>Kasibhatla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+of+suspension+cells+with+hoechst+33258+to+detect+apoptosis.">Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).</li><li>Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+long-term,+high-dose+dexamethasone+administration+on+proliferation+and+apoptosis+in+porcine+hepatocytes.">Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes.</a> Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).</li><li>Rinkevich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cultures+from+marine+invertebrates:+new+insights+for+capturing+endless+stemness.">Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness.</a> Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).</li><li>Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+of+regenerating+holothurian+tissues.">Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+water+temperature+on+the+growth+and+fatty+acid+profiles+of+juvenile+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+(Selenka).">Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka).</a> Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).</li></ol>

Обширные исследовательские усилия были посвящены созданию клеточных линий в последние десятилетия, однако, по-прежнему трудно добиться прогресса в долгосрочной культуре клеток из морских беспозвоночных14,22. Было сообщено, что культивированные клетки и?...

Культивирование клеток в искусственно контролируемых условиях, а не в их естественной среде, обеспечивает единые экспериментальные материалы для биологических исследований, особенно для видов, которые не могут быть легко культивированы в лабораторных условиях. Морские беспозвоночные составляют более 30% всех видов животных1,и они обеспечивают многочисленные биологические материалы для проведенияисследований по регулирующим механизмам конкретных биологических процессов, таких как регенерация2,3,стресс ответ 4 , и экологическая адаптация5,6.
Морской огурец, Apostichopus japonicus, является одним из наиболее изученных видов эхинодерм, населяющих умеренные воды вдоль побережья Северной Части Тихого океана. Он хорошо известен как коммерчески важные виды и maricultured в больших масштабах в Восточной Азии, особенно в Китае7. Многочисленные научные вопросы, касающиеся A. japonicus, в том числе регулятивных механизмов, лежащих в основе кишечной регенерации после потрошивания8 и дегенерации в эстивации9,метаболический контроль10,11, и иммунный ответ12,13 под тепловой или патогенных стрессов, привлекли внимание исследователей. Однако, по сравнению с хорошо изученными модельными животными, фундаментальные исследования, особенно на клеточном уровне, ограничены техническими узкими местами, такими как отсутствие передовых методов клеточной культуры.
Исследователи посвятили много усилий для установления клеточных линий, но они также столкнулись со многими проблемами, и ни одна клеточная линия от любого морского беспозвоночного была создана еще14. Тем не менее, первичные клеточные культуры морских беспозвоночных продвинулись в последние десятилетия15,16, и они предоставили возможность для экспериментов на клеточном уровне. Например, регенерирующий интезин от A. japonicus был использован в качестве источника клеток для долгосрочных клеточных культур, которые предоставили практический метод для первичной клеточной культуры морских беспозвоночных17. Этот протокол объединил и оптимизировал культуру беспозвоночных клеток и разработал широко подходящий метод первичной культуры для морских огурцов или других морских беспозвоночных.
Апоптоз является внутренней программы самоубийства клетки вызваны различными экзогенными и эндогенными стимулами. Скоординированный апоптоз имеет решающее значение для многих биологических систем18,19, и он был вовлечен в кишечной регрессии морского огурца во время aestivation9. Для исследования апоптотический процесс в организмах, представляющих интерес, ряд методов, в том числе Hoechst окрашивания и микроскопических анализов, были созданы и успешно применяются20. Здесь мы провели индукцию апоптоза и выявление в первичных культивированных кишечных клетках морского огурца для оценки удобства использования первичных клеток в биологических исследованиях морских беспозвоночных. Дексаметазон, один из широко используемых синтетических глюкокортикостероидов21, был использован для индуцирования апоптоза в культивированных кишечных клетках из морского огурца, и значительный сигнал Hoechst 33258 был успешно обнаружен в окрашенных клетках флуоресцентной микроскопией.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLVV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m filter</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 cm dishes</td>
			<td>ExCell Bio</td>
			<td>CS016-0124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde solution</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80096618</td>
			<td>in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuges</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Allegra X-30R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BeyoClick EdU-488 kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0071S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10005817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Lucky Riptile</td>
			<td>HN-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW00500221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric thermostatic water bath</td>
			<td>senxin17</td>
			<td>DK-S28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80176961</td>
			<td>75%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor(FGF)</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica DMI3000B</td>
			<td>DMI3000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Garamycin</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW14054101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>63005518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst33258 Staining solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW1106168001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin like Growth Factor(IGF)</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10016308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM41300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (100 mg/mL)</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM-21051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW77863031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10020518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td>pH7.2-7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH meter</td>
			<td>Bante</td>
			<td>A120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE</td>
			<td>Seebio</td>
			<td>185791</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

apoptosis induction and detection in a primary culture of sea cucumber intestinal cells

Первичные культивированные клетки используются в различных научных дисциплинах в качестве исключительно важных инструментов для функциональной оценки биологических веществ или характеристики конкретных биологических видов деятельности. Однако из-за отсутствия универсально применимых средств массовой информации и протоколов клеточной культуры хорошо описанные методы клеточной культуры для морских организмов по-прежнему ограничены. Между тем, часто происходящее микробное загрязнение и политропные свойства морских беспозвоночных клеток еще больше препятствуют выработке эффективной стратегии клеточной культуры для морских беспозвоночных. Здесь мы описываем простой в обращении метод культивирования кишечных клеток из морского огурца Apostichopus japonicus; кроме того, мы предоставляем пример индукции in vitro apoptosis и обнаружения в первичных культивированных кишечных клетках. Кроме того, этот эксперимент содержит подробную информацию о соответствующем методе культуры и собираемости клеток. Описанный протокол совместим с различными широко доступными образцами тканей морских организмов, включая Эхинодермата, Моллюскусу и Раккуза, и может обеспечить достаточное количество клеток для нескольких экспериментальных применений in vitro. Этот метод позволит исследователям эффективно манипулировать первичными культурами клеток из морских беспозвоночных и облегчить функциональную оценку целевых биологических материалов на клетках.

Здесь мы установили первичную кишечную клеточную культуру A. japonicus и прооцизировали клетки. На рисунке 1 показаны круглые клетки на разных стадиях культивирования. И EdU окрашивания анализы предоставляют прямые доказательства, чтобы выявить пролиферативной активно?...

Watch this Scientific Journal Video about Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells at JoVE.com

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Этот протокол обеспечивает простой в обращении метод культуры кишечных клеток из морского огурца Apostichopus japonicus и совместим с различными широко доступными образцами тканей морских организмов, включая Эхинодермата, Моллюскуску и Раккусею.

Апоптоз индукции и обнаружения в начальной культуре морских огурцов кишечных клеток

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Протокол обеспечивает простой в обращении и широко совместимый метод культуры первичных клеток для морских беспозвоночных. Этот метод дает исследователям способ культуры морских беспозвоночных клеток в течение сравнительно длительного времени. Культура клеток должна быть обеспечена последовательным генетическим фоном для различных дальнейших биологических экспериментальных применений в исследованиях морской биологии.Что мы считаем, что для новых исследований в этой области указанный упрощенный протокол должен быть хорошим выбором для осуществления. После обезболировки, вскрывать и собирать передний кишечник, затем раздел образцов ткани вертикально и удалить внутреннее содержимое. Вымойте образцы тканей в PBS дважды и дезинфицировать их путем погружения в 75%ethanol раствор не более двух секунд.Затем мыть образцы тканей в PBS три раза, чтобы удалить этанол, и передать около 100 миллиграммов образца ткани в два миллилитров стерильных микро центрифуг трубки. Добавьте 1,5 миллилитров предварительно оптимизированной среды культуры в блок кишечной ткани морского огурца и измельчите блок стерилизованными хирургическими ножницами до тех пор, пока раствор не будет мутным. Добавьте 400 микролитров 0,25% трипсина.Смешайте раствор инверсией и инкубировать его в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем отфильтруйте раствор с помощью 100 микрон-клеточного ситечко и соберите фильтрат в новой стерильной двухмилитровой микро центрифуге. Для факультативного упрощенного протокола блоки тканей, разрезанные в культурных средствах массовой информации, могут быть непосредственно переданы в посуду и впоследствии инкубированы.Центрифуга трубки на 1700xG в течение трех минут, отказаться от супернатанта, а затем вновь приостановить гранулы в среде культуры с антибиотиками, и мыть его с культурой среды в два раза. Предварительно установите инкубатор для клеточной культуры, и запустить его заранее, по крайней мере 24 часов с температурой 18 градусов по Цельсию и насыщенной влажности. Затем повторно приостанавливайте клетки с помощью 200 микролитров указанной среды и перенесите их в четырехметровые блюда.Культура клеток в инкубаторе. Через шесть часов вывихните их из инкубатора и добавьте два миллилитров указанной среды в клетку, культивируя блюда. Каждые 12 часов меняй половину среды.Через пять-семь дней клетки начинают делиться. Уменьшите неблагоприятное воздействие антибиотиков за счет снижения концентрации указанных антибиотиков, пенициллина, стрептомицина и гентамицина в среде культуры в два раза. Каждые два-три дня, заменить клеточной культуры среды.Когда плотность первичной клетки достигает 60%, проводится пропуск клеток. Во-первых, мыть культурные клетки в два раза с помощью PBS при комнатной температуре. Добавьте 200 микролитров 0,25%трипсина раствора к каждому блюду, и вручную агитировать блюда, гарантируя, что все дно покрыто.Откажитесь от трипсина раствор, и инкубировать клетки в течение пяти минут при комнатной температуре. Вымойте клетки одним миллилитром свежей среды культуры путем пипетки и повторной приостановки клеток. Перенесите 0,5 миллилитров клеточной подвески на новое блюдо.Добавьте 1,5 миллилитров свежей среды и инкубировать клетки при 18 градусах Цельсия. Через 12 часов, изменить среду, и наблюдать клетки под микроскопом, чтобы оценить условия. Подготовьте три экспериментальные группы, включая контроль, и две группы решений, с одним микромолярем и 100 микромоляной дексиметазон.После инкубации с или без дексиметазона для нуля, 24, или 48 часов, мыть клетки три раза с PBS. После выключив свет, добавьте 300 микролитров раствора hoechst 33258 на колодец в 12 хорошо пластины, и осторожно агитировать пластины, чтобы покрыть все клетки, обеспечивая их окрашивание. Инкубировать при 18 градусах по Цельсию в течение 30 минут.Затем удалите раствор окрашивания hoechst и исправить клетки, добавив 300 микролитров четырехпроцентного раствора параформальдегида в PBS к каждой хорошо. Аккуратно агитировать в течение 15 минут. После этого, мыть фиксированные клетки три раза в PBS.Держите PBS после последнего мытья, чтобы держать клетки покрыты. Включите аппаратное обеспечение флуоресцентного микроскопа, включая мощность ртутной лампы, люминесцентную световую силу и ПК. Войдите в учетную запись операционной системы, запустите программное обеспечение и проверьте его конфигурацию. Поместите подготовленную тарелку на сцену микроскопа.Распоить образец над объективом цели с помощью сценического контроллера. Найти клетки, представляющие интерес под световым микроскопом. Переключитесь на флуоресцентную микроскопию и отрегулируйте параметры возбуждения и выброса примерно до 352 и 461 нанометров, соответственно, для наблюдения ДНК ядер.Захват изображений. В этом исследовании была установлена и проходная культура первичных кишечных клеток морских огурцов. Здесь показаны круглые клетки на разных стадиях культивирования.Вот клетки, прикрепленные к нижней части блюд на третий день, после того, как посеяны. Вот распространение клеток на седьмой день. Вот клетки, прикрепленные к нижней части посуды после прохода.И клетки, которые потеряли активность и умирали после 10 проходов. EDU заявив, анализы предоставляют прямые доказательства, чтобы выявить пролиферативную активность этих круглых клеток на более поздних стадиях. Стимуляция с помощью одного микромолара дексиметазона увеличила скорость апоптотических клеток наиболее быстро, по сравнению с контролем и 100 микромоляной дексиметазонной стимуляцией.Культурные клетки были обработаны с deximethazone для различных периодов времени, а затем hoechst 33258 окрашивания для обнаружения апоптотических клеток. Клеточное лечение перед инкубацией имеет решающее значение для долгосрочного контроля. Это напоминание, чтобы попробовать дополнительный упрощенный протокол, когда ячейка не растут хорошо.Параформальдегид умеренно токсичен при контакте с кожей или вдыхании, и он задокументирован как, вероятно, канцероген человека.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Первичные культуры и плазмиды электропорации мышей органа Корти.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

Иммунофлуоресцентного Обнаружение два аналога тимидина (CldU и ПИН) в первичных тканей

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Индукция и тестирование Гипоксия в культуре клеток

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Выделение и первичной культуре клеток крысы Печеночная

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Индукционные и анализ эпителиальных к мезенхимальных перехода

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Выделение и культивирование Мышь первичные клетки поджелудочной Ацинарных

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Видео Протокол ретровирусной инфекции в начальной кишечника Органоид культуры

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Оценка Selective мРНК перевода в клетках млекопитающих по полисом профилирования

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Выделение и первичной культуре мышиных эндотелиальных клеток аорты

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Графический пользовательский интерфейс для отслеживания концентрации белка в программном сопровождении в динамических клеточных выпячиваниях

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...