Name: apoptosis induction and detection in a primary culture of sea cucumber intestinal cells
Uploaded: 2020-01-21T14:00:00
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Los autores quieren agradecer al profesor Naiming Zhou de la Universidad de Zhejiang por su asesoramiento técnico y por poner el equipo de su laboratorio a disposición para su uso. Este trabajo fue apoyado financieramente por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (números de subvención 41876154, 41606150 y 41406137) y los Fondos De Investigación Fundamental para las Universidades e Institutos de Investigación Provinciales de Zhejiang [número de subvención 2019JZ00007 ].

1. Preparación media de cultivo celular
<ol><li>
Preparación de líquido sinmica
	<ol>
<li>
Recogida de fluidos coelómicos: En condiciones estériles, diseccione un pepino de mar sano (peso húmedo de 85-105 g), recoja el líquido celómico y guárdelo en un matraz de vidrio estéril.</li>
		<li>
Extirpación de células coelómicas: Centrifugar el líquido celómico en tubos centrífugos de 50 ml a 1.700 x g durante 5 min y transferir el sobrenadante a un ...

<ol>
	<li>Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenesis+in+primary+cell+cultures+from+larvae+of+the+abalone,+Haliotis+rufescens.">Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens.</a> Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).</li><li>Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+regeneration+and+biomineralization+in+sea+urchins:+role+of+Notch+signaling+and+presence+of+stem+cell+markers.">Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers.</a> Plos One. 10 (8), 0133860 (2015).</li><li>Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptional+time-course+analysis+of+oral+vs.+aboral+whole-body+regeneration+in+the+Sea+anemone+Nematostella+vectensis.">A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis.</a> Bmc Genomics. 17, 718 (2016).</li><li>Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+immune+response+to+bacterial+LPS+in+the+sea+urchin+Paracentrous+lividus+(Lamarck,+1816).">Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816).</a> Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).</li><li>Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+variation+in+anaerobic+energy+metabolism+reflects+hypoxia+tolerance+across+the+intertidal+and+subtidal+distribution+of+the+Pacific+oyster+(Crassostrea+gigas).">Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas).</a> Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).</li><li>Han, G., Zhang, S., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+metabolism+and+thermal+tolerance:+The+importance+of+opine+pathways+on+survival+of+a+gastropod+after+cardiac+dysfunction.">Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction.</a> Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sea+cucumber+genome+provides+insights+into+morphological+evolution+and+visceral+regeneration.">The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration.</a> PLoS Biology. 15 (10), 2003790 (2017).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iTRAQ+reveals+proteomic+changes+during+intestine+regeneration+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus.">iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).</li><li>Xu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+loss+by+apoptosis+is+involved+in+the+intestinal+degeneration+that+occurs+during+aestivation+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus.">Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).</li><li>Yang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+characteristics+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+(Selenka)+during+aestivation.">Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).</li><li>Xiang, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolytic+regulation+in+aestivation+of+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus:+evidence+from+metabolite+quantification+and+rate-limiting+enzyme+analyses.">Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses.</a> Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).</li><li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+feedback+loop+involving+FREP+and+NF-kappaB+regulates+the+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus.">A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).</li><li>Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+mRNA-miRNA+interaction+analysis+associate+with+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+based+on+transcriptome+database.">Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database.</a> Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).</li><li>Cai, X., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+invertebrate+cell+culture:+a+decade+of+development.">Marine invertebrate cell culture: a decade of development.</a> Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).</li><li>Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Approach+to+Primary+Cell+Culture+for+Octopus+vulgaris+Neurons.">A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons.</a> Frontiers in Physiology. 9, 220 (2018).</li><li>Pinsino, A., Alijagic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+urchin+Paracentrotus+lividus+immune+cells+in+culture:+formulation+of+the+appropriate+harvesting+and+culture+media+and+maintenance+conditions.">Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions.</a> Biology Open. 8 (3), (2019).</li><li>Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+holothurian+tissues+as+a+source+of+cells+for+long-term+cell+cultures.">Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures.</a> Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).</li><li>Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+Molecular+Mechanisms+and+Pathogenicity.">Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity.</a> Excli Journal. 8, 155-181 (2009).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis,+proliferation,+and+morphology+during+vein+graft+remodeling+in+rabbits.">Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits.</a> Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).</li><li>Kasibhatla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+of+suspension+cells+with+hoechst+33258+to+detect+apoptosis.">Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).</li><li>Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+long-term,+high-dose+dexamethasone+administration+on+proliferation+and+apoptosis+in+porcine+hepatocytes.">Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes.</a> Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).</li><li>Rinkevich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cultures+from+marine+invertebrates:+new+insights+for+capturing+endless+stemness.">Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness.</a> Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).</li><li>Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+of+regenerating+holothurian+tissues.">Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+water+temperature+on+the+growth+and+fatty+acid+profiles+of+juvenile+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+(Selenka).">Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka).</a> Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).</li></ol>

En las últimas décadas se han dedicado amplios esfuerzos de investigación a establecer líneas celulares en las últimas décadas, sin embargo, sigue siendo difícil avanzar en el cultivo a largo plazo de células a partir de invertebrados marinos14,22. Se ha informado de que las células cultivadas de la regeneración de los tejidos holothurianos eran viables durante un largo período de tiempo y se puede detectar una alta actividad de proliferación en célu...

El cultivo de células en condiciones controladas artificialmente, y no en su entorno natural, proporciona materiales experimentales uniformes para estudios biológicos, especialmente para especies que no se pueden cultivar fácilmente en un entorno de laboratorio. Los invertebrados marinos representan más del 30% de todas las especies animales1y proporcionan numerosos materiales biológicos para llevar a cabo investigaciones sobre los mecanismos reguladores de procesos biológicos específicos, como la regeneración2,3, la respuesta al estrés4,y la adaptación ambiental5,6.
El pepino de mar, Apostichopus japonicus,es una de las especies de equinodermos más estudiadas que habita en aguas templadas a lo largo de la costa del Pacífico Norte. Es bien conocido como una especie comercialmente importante y maricultura a gran escala en Asia oriental, especialmente en China7. Numerosas preguntas científicas sobre A. japonicus,incluyendo los mecanismos reguladores subyacentes a la regeneración intestinal después de la evisceración8 y la degeneración en la estivación9, el control metabólico10,11,y la respuesta inmune12,13 bajo tensiones térmicas o patógenas, han atraído la atención de los investigadores. Sin embargo, en comparación con los animales modelo bien estudiados, la investigación básica, especialmente a nivel celular, está limitada por cuellos de botella técnicos, como la falta de métodos avanzados de cultivo celular.
Los investigadores han dedicado mucho esfuerzo al establecimiento de líneas celulares, pero también se han enfrentado a muchos desafíos y no se ha establecido ninguna línea celular de ningún invertebrado marino todavía14. Sin embargo, los cultivos celulares primarios de los invertebrados marinos han avanzado en las últimas décadas15,16,y han proporcionado una oportunidad para la experimentación a nivel celular. Por ejemplo, la intesina regeneradora de A. japonicus se ha utilizado como una fuente de células para cultivos celulares a largo plazo que proporcionó un método práctico para el cultivo celular primario de invertebrados marinos17. Este protocolo combina y optimizó el cultivo celular de invertebrados y desarrolló un método de cultivo primario ampliamente adecuado para pepino de mar u otros invertebrados marinos.
La apoptosis es un programa de suicidio celular intrínseco desencadenado por varios estímulos exógenos y endógenos. La apoptosis coordinada es crucial para muchos sistemas biológicos18,19,y se ha implicado en la regresión intestinal del pepino de mar durante la estivación9. Para investigar el proceso apoptotico en organismos de interés, se han establecido y aplicado con éxito una serie de métodos, incluidos ensayos de tinción y microscopía Hoechst, que se han aplicado con éxito20. Aquí, llevamos a cabo la inducción y detección de apoptosis en células intestinales cultivadas primarias de pepino de mar para evaluar la usabilidad de las células primarias en estudios biológicos de invertebrados marinos. La dexametasona, uno de los glucocorticosteroides sintéticos de uso común21,se utilizó para inducir apoptosis en células intestinales cultivadas a partir de pepino de mar, y la señal significativa Hoechst 33258 se detectó con éxito en las células manchadas mediante microscopía fluorescente.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLVV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m filter</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 cm dishes</td>
			<td>ExCell Bio</td>
			<td>CS016-0124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde solution</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80096618</td>
			<td>in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuges</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Allegra X-30R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BeyoClick EdU-488 kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0071S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10005817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Lucky Riptile</td>
			<td>HN-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW00500221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric thermostatic water bath</td>
			<td>senxin17</td>
			<td>DK-S28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80176961</td>
			<td>75%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor(FGF)</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica DMI3000B</td>
			<td>DMI3000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Garamycin</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW14054101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>63005518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst33258 Staining solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW1106168001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin like Growth Factor(IGF)</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10016308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM41300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (100 mg/mL)</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM-21051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>XW77863031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10020518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td>pH7.2-7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Genom</td>
			<td>GNM15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH meter</td>
			<td>Bante</td>
			<td>A120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE</td>
			<td>Seebio</td>
			<td>185791</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

apoptosis induction and detection in a primary culture of sea cucumber intestinal cells

Las células cultivadas primarias se utilizan en una variedad de disciplinas científicas como herramientas excepcionalmente importantes para la evaluación funcional de sustancias biológicas o la caracterización de actividades biológicas específicas. Sin embargo, debido a la falta de medios y protocolos de cultivo celular universalmente aplicables, los métodos de cultivo celular bien descritos para los organismos marinos siguen siendo limitados. Mientras tanto, la contaminación microbiana y las propiedades politrópicas de las células invertebradas marinas impiden aún más el establecimiento de una estrategia de cultivo celular eficaz para los invertebrados marinos. Aquí, describimos un método fácil de manejar para el cultivo de células intestinales de pepino de mar Apostichopus japonicus; además, proporcionamos un ejemplo de inducción y detección de apoptosis in vitro en células intestinales cultivadas primarias. Además, este experimento proporciona detalles sobre el medio de cultivo adecuado y el método de colección de células. El protocolo descrito es compatible con una variedad de muestras de tejido ampliamente disponibles de organismos marinos, incluyendo Echinodermata, Mollusca y Crustacea, y puede proporcionar suficientes células para múltiples aplicaciones experimentales in vitro. Esta técnica permitiría a los investigadores manipular eficientemente los cultivos celulares primarios de los invertebrados marinos y facilitar la evaluación funcional de materiales biológicos específicos en las células.

Aquí, establecimos el cultivo celular intestinal primario de A. japonicus y pasamos las células. La Figura 1 muestra celdas redondas en diferentes etapas de cultivo. Y los ensayos de tinción EdU proporcionan evidencias directas para revelar la actividad proliferativa de estas células redondas en etapas posteriores(Figura 2). También ajustamos ligeramente el protocolo, el cultivo de bloques de tejido picado en lugar de células filtradas; además, u...

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Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Este protocolo proporciona un método fácil de manejar para cultivar las células intestinales del pepino de mar Apostichopus japonicus y es compatible con una variedad de muestras de tejido ampliamente disponibles de organismos marinos, incluyendo Echinodermata, Mollusca y Crustacea.

Inducción y detección de apoptosis en un cultivo primario de células intestinales de pepino marino

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

El protocolo proporciona un método de cultivo de células primarias fácil de manejar y ampliamente compatible para los invertebrados marinos. Esta técnica ofrece a los investigadores una manera de cultivar las células invertebradas marinas durante un tiempo relativamente largo. Se debe proporcionar un cultivo de células con antecedentes genéticos consistentes para diferentes aplicaciones experimentales biológicas adicionales en la investigación de la biología marina.Para la nueva investigación en este campo, creemos que el protocolo simplificado indicado debe ser la buena opción para ejercer. Después de la anestesia, disecciona y recoja los intestinos anteriores, luego secciona las muestras de tejido verticalmente y eliminar el contenido interno. Lave las muestras de tejido en PBS dos veces y desinfectelas por inmersión en una solución de etanol al 75% durante no más de dos segundos.Luego lave las muestras de tejido en PBS tres veces para extraer el etanol, y transfiera alrededor de 100 miligramos de muestra de tejido en un tubo de micro centrífuga estéril de dos mililitros. Añadir 1,5 mililitros de medio de cultivo pre-optimizado al bloque de tejido intestinal de pepino de mar y picar el bloque con tijeras quirúrgicas esterilizadas hasta que la solución esté turbia. Añadir 400 microlitros de 0,25% de trippsina.Mezclar la solución por inversión e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, filtre la solución con un colador celular de 100 micras y recoja el filtrado en un nuevo tubo estéril de micro centrífuga de dos mililitros. Para el protocolo simplificado opcional, los bloques de tejido cortados en medios cultivados se pueden transferir directamente a los platos y posteriormente incubar.Centrifugar el tubo a 1700xG durante tres minutos, desechar el sobrenadante, luego volver a suspender el pellet en un medio de cultivo con antibióticos, y lavarlo con medio de cultivo dos veces. Preconfigurar la incubadora para el cultivo celular, y ejecutarla con antelación durante al menos 24 horas con la temperatura de 18 grados centígrados y la humedad saturada. Luego vuelva a suspender las células usando 200 microlitros del medio indicado, y transfiéralas a platos de cuatro centímetros.Cultivo de las células en una incubadora. Después de seis horas, sáquelos de la incubadora y agregue dos mililitros de medio indicado a los platos de cultivo de la célula. Cada 12 horas, cambia la mitad del medio.Después de cinco a siete días, las células comienzan a dividirse. Reducir los efectos adversos de los antibióticos mediante la reducción de la concentración de antibióticos indicados, penicilina, estreptomicina, y gentamicina en el medio de cultivo a la mitad. Cada dos o tres días, reemplace el medio de cultivo celular.Cuando la densidad de la célula primaria alcanza el 60%, realice el passaging de células. Primero, lave las células cultivadas dos veces usando PBS a temperatura ambiente. Añadir 200 microlitros de 0.25% solución de trippsina a cada plato, y agitar manualmente los platos, asegurando que todo el fondo esté cubierto.Deseche la solución de tripsina e incubar las células durante cinco minutos a temperatura ambiente. Lavar las células con un mililitro de medio de cultivo fresco pipeteando y suspendiendo las células. Transfiera 0,5 mililitros de suspensión celular a un nuevo plato.Añadir 1,5 mililitros de medio fresco, e incubar las células a 18 grados centígrados. Después de 12 horas, cambie el medio y observe las células bajo un microscopio para evaluar las condiciones. Preparar tres grupos experimentales, incluyendo un control, y dos grupos de soluciones, con un micromolar y 100 deximetazona micromolar.Después de la incubación con o sin deximetazona durante cero, 24 o 48 horas, lave las células tres veces con PBS. Después de apagar la luz, agregue 300 microlitros de solución hoechst 33258 por pozo a una placa de 12 pozos, y agitar suavemente la placa para cubrir todas las células, asegurando su tinción. Incubar a 18 grados centígrados durante 30 minutos.A continuación, retire la solución de tinción de hoechst y fije las células añadiendo 300 microlitros de solución de paraformaldehído al cuatro por ciento en PBS a cada pozo. Agitar suavemente durante 15 minutos. Después de eso, lave las células fijas tres veces en PBS.Mantenga el PBS después del último lavado para mantener las células cubiertas. Encienda el hardware del microscopio fluorescente, incluida la potencia de la lámpara de mercurio, la potencia de luz fluorescente y el PC. Inicie sesión en la cuenta del sistema operativo, inicie el software y compruebe su configuración. Coloque la placa preparada en la etapa del microscopio.Coloque la muestra sobre el objetivo con el controlador de escenario. Encuentra las células de interés bajo el microscopio de luz. Cambie a la microscopía fluorescente y ajuste los parámetros de la excitación y emisión a aproximadamente 352 y 461 nanómetros, respectivamente, para la observación del ADN de los núcleos.Captura las imágenes. En este estudio, se estableció y se hizo un paso del cultivo celular intestinal primario del pepino de mar. Las células redondas en diferentes etapas de cultivo se muestran aquí.Aquí hay celdas unidas a la parte inferior de los platos en el tercer día, después de ser sembrado. Aquí está la proliferación celular en el séptimo día. Aquí hay celdas unidas a la parte inferior de los platos después de pasar.Y células que perdieron actividad y estaban muriendo después de 10 pasajes. Los ensayos de encción de la EDU proporcionan evidencia directa para revelar la actividad proliferativa de estas células redondas en etapas posteriores. La estimulación con una deximetazona micromolar aumentó la velocidad celular apoptótica más rápidamente, en comparación con el control y la estimulación de deximetazona micromolar 100.Las células cultivadas fueron tratadas con dexmetazona durante diferentes períodos de tiempo, seguido de la tinción hoechst 33258 para la detección de células apoptóticas. Los tratamientos celulares antes de la incubación son críticos para el control a largo plazo. Es un recordatorio para probar el protocolo simplificado opcional cuando la célula no crece bien.El paraformaldehído es moderadamente tóxico por contacto o inhalación de la piel, y está documentado como un carcinógeno probablemente humano.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Cultura primaria y electroporación plásmido del órgano de Corti murino.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Investigación

Biología

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

Detección por inmunofluorescencia de dos análogos de la timidina (CldU y UDI) en los tejidos de Primaria

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Inducción y prueba de hipoxia en el cultivo celular

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Aislamiento y cultivo primario de células hepáticas de ratas

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Inducción y Análisis de epitelial a mesenquimal de transición

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Aislamiento y cultivo de ratón primarias células acinares pancreáticas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Un Protocolo de vídeo de la infección retroviral en Primaria Intestinal organoide Cultura

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Evaluación del selectivo ARNm traducción en células de mamífero por polisoma perfiles

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Aislamiento y cultivo primario de células endoteliales aórticas de ratón

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Una interfaz gráfica de usuario para el seguimiento asistido por software de la concentración de proteínas en protones dinámicos celulares

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...