Name: in vitro model of coronary angiogenesis
Uploaded: 2020-03-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Coronary Angiogenesis at JoVE.com

يشكر المؤلفون أعضاء مختبر شارما على توفير بيئة بحثية داعمة. نود أن نقدم لكم شكرا خاصا لديان (دي) R. هوفمان الذي يحافظ ويهتم لدينا مستعمرة الماوس. كما نود أن نشكر الدكتورين فيليب ج. سمالدينو وكارولين فان على تدقيق المخطوطة بدقة وتقديم تعليقات مفيدة. تم دعم هذا العمل من خلال أموال من مكتب عميد جامعة ولاية بول وقسم البيولوجيا إلى بكالوريوس، وأكاديمية إنديانا للعلوم صناديق منحة البحوث العليا إلى B.S، والمعاهد القومية للصحة (RO1-HL128503) ومؤسسة الخلايا الجذعية في نيويورك أموال إلى K.R.

استخدام جميع الحيوانات في هذا البروتوكول يتبع جامعة ولاية الكرة المؤسسية رعاية الحيوانات ولجنة الاستخدام (IACUC) المبادئ التوجيهية.
1. إنشاء مربي الفئران والكشف عن المقابس المهبلية للحمل في الوقت المناسب
<ol><li>إعداد قفص تربية الفئران مع الفئران نوع البرية الذكور والإناث. تأك?...

<ol>
	<li>Red-Horse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells.">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sinus+venosus+contributes+to+coronary+vasculature+through+VEGFC-stimulated+angiogenesis.">The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis.</a> Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).</li><li>Volz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+are+progenitors+for+coronary+artery+smooth+muscle.">Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-C+and+aortic+cardiomyocytes+guide+coronary+artery+stem+development.">VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4899-4914 (2014).</li><li>Chang, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DACH1+stimulates+shear+stress-guided+endothelial+cell+migration+and+coronary+artery+growth+through+the+CXCL12-CXCR4+signaling+axis.">DACH1 stimulates shear stress-guided endothelial cell migration and coronary artery growth through the CXCL12-CXCR4 signaling axis.</a> Genes and Development. , (2017).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepicardial+endothelial+cells+invade+the+embryonic+ventricle+wall+to+form+coronary+arteries.">Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries.</a> Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+Cells+Form+the+Coronary+Arteries+by+Angiogenesis+through+Myocardial-Endocardial+VEGF+Signaling.">Endocardial Cells Form the Coronary Arteries by Angiogenesis through Myocardial-Endocardial VEGF Signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Katz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+compartments+of+the+proepicardial+organ+give+rise+to+coronary+vascular+endothelial+cells.">Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells.</a> Developmental Cell. 22 (3), 639-650 (2012).</li><li>Das, S., Red-Horse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+plasticity+in+cardiovascular+development+and+disease.">Cellular plasticity in cardiovascular development and disease.</a> Developmental Dynamics. 246 (4), 328-335 (2017).</li><li>Sharma, B., Chang, A., Red-Horse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+Artery+Development:+Progenitor+Cells+and+Differentiation+Pathways.">Coronary Artery Development: Progenitor Cells and Differentiation Pathways.</a> Annual Review of Physiology. 79, 1-19 (2017).</li><li>Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+origin+and+developmental+program+of+coronary+angiogenesis.">Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis.</a> Circulation Research. 116 (3), 515-530 (2015).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling.">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Gerhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+guides+angiogenic+sprouting+utilizing+endothelial+tip+cell+filopodia.">VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia.</a> Journal of Cell Biology. 161 (6), 1163-1177 (2003).</li><li>Ruhrberg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+restricted+patterning+cues+provided+by+heparin-binding+VEGF-A+control+blood+vessel+branching+morphogenesis.">Spatially restricted patterning cues provided by heparin-binding VEGF-A control blood vessel branching morphogenesis.</a> Genes and Development. 16 (20), 2684-2698 (2002).</li><li>Kikuchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antiangiogenic+isoform+of+VEGF-A+contributes+to+impaired+vascularization+in+peripheral+artery+disease.">An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease.</a> Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2002).</li><li>Folkman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+tumor+factor+responsible+for+angiogenesis.">Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 133 (2), 275-288 (1971).</li><li>Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+VEGF+in+the+regulation+of+physiological+and+pathological+angiogenesis.">The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis.</a> Experientia Supplementum. (94), 209-231 (2005).</li><li>Ferrara, N., Bunting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor,+a+specific+regulator+of+angiogenesis.">Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 5 (1), 35-44 (1996).</li><li>Sharma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Progenitor+Cells+Compensate+to+Rebuild+the+Coronary+Vasculature+in+Elabela-+and+Apj-Deficient+Hearts.">Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts.</a> Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).</li><li>Rhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+deletion+of+Ino80+disrupts+coronary+angiogenesis+and+causes+congenital+heart+disease.">Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease.</a> Nature Communications. 9 (1), 368 (2018).</li></ol>

بعض الخطوات الأكثر أهمية لزراعة الأوعية التاجية بنجاح من أنسجة السلف SV وEndo هي: 1) تحديد وعزل أنسجة SV بشكل صحيح لاستزراع SV؛ 1) تحديد وعزل أنسجة SV لاستزراع SV؛ 1) تحديد وعزل أنسجة SV لاستزراع SV؛ 1) تحديد وعزل أنسجة SV لاستزراع SV؛ 1) تحديد وعزل أنسجة SV لاستزراع SV؛ 1) تحديد وعزل أنسجة SV لاستزراع SV؛ 1) تحدي...

تسمى الأوعية الدموية للقلب عادة الأوعية التاجية. تتكون هذه الأوعية من الشرايين والأوردة والشعيرات الدموية. أثناء التطوير ، يتم إنشاء الشعيرات الدموية المتفرعة للغاية أولاً ، والتي تعيد تشكيلها بعد ذلك في الشرايين التاجية والأوردة1،2،3،4،5. يتم بناء هذه الشعيرات الدموية الأولية من الخلايا السلف البوالجينية الموجودة في proepicardium ، ووينوس الجيوب الأنفية (SV) ، وأنسجة الشغاف (Endo)1،6،7،8. SV هو عضو تدفق القلب الجنينية وإندو هو البطانة الداخلية للتجويف القلب. الخلايا السلف الاندوري وجدت في SV وEndo بناء غالبية الأوعية الدموية التاجية، في حين أن proepicardium يساهم في جزء صغير نسبيا منه2. وتسمى العملية التي تنمو بها الشبكة الشعرية للأوعية التاجية في القلب من خلاياها السليفة الموجودة مسبقًا تولد الأوعية التاجية. مرض الشريان التاجي هو واحد من الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم وحتى الآن لا يوجد علاج فعال لهذا المرض. يمكن أن يكون فهم الآليات الخلوية والجزيئية التفصيلية لتكوين الأوعية التاجية مفيدًا في تصميم علاجات جديدة وفعالة لإصلاح الشرايين التاجية التالفة وتجديدها.
في الآونة الأخيرة، تم تحقيق طفرة في فهمنا لكيفية تطور الأوعية التاجية جزئيا من خلال تطوير أدوات وتقنيات جديدة. على وجه الخصوص ، في تسمية النسب الحي وتقنيات التصوير المتقدمة كانت مفيدة للغاية في الكشف عن المنشأ الخلوي ومسارات التمايز للأوعية التاجية9،10،11،12. على الرغم من مزايا هذه في أدوات الجسم الحي ، هناك قيود من حيث السرعة والمرونة وسهولة الوصول. لذلك ، يمكن أن تكمل أنظمة النموذج المختبري القوية في أنظمة الجسم الحي لتوضيح الآليات الخلوية والجزيئية لتكوين الأوعية التاجية بطريقة عالية الإنتاجية.
هنا، نصف نموذج في المختبر من تولد الأوعية التاجية. لقد قمنا بتطوير نظام زراعة الاستئصال في المختبر لزراعة الأوعية التاجية من اثنين من أنسجة السلف، SV وEndo. مع هذا النموذج، ونحن نظهر أن الثقافات في الأنسجة المختبرية explant تنمو براعم الأوعية التاجية عندما حفزت من قبل متوسط النمو. بالإضافة إلى ذلك، تنمو الثقافات النباتية بسرعة مقارنة بالتحكم عندما يحفزها عامل النمو البائي A (VEGF-A)، وهو بروتين أنجيوجينيك قوي للغاية. وعلاوة على ذلك، وجدنا أن براعم الأوعية من ثقافة SV الخضوع إزالة التمايز وينوب (فقدان التعبير COUP-TFII)، وهي آلية مماثلة لتولد الأوعية SV في الجسم الحي1. هذه البيانات تشير إلى أن نظام الثقافة في المختبر explant يعيد بأمانة الأحداث الوعائية التي تحدث في الجسم الحي. بشكل جماعي ، في نماذج المختبر من تولد الأوعية التي يتم وصفها هنا مثالية للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية لتولد الأوعية التاجية بطريقة عالية الإنتاجية ويمكن الوصول إليها.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 x 20 MM Tissue Culture Dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>877222</td>
			<td>Referred in the protocol as Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.0 uM PET membrane culture inserts</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MCEP24H48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A31572</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-rat 488</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled Metal Probe</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>10088-15</td>
			<td>Angled 45 degree, used for detecting deep plugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- ERG 1/2/3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab92513</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- VE-Cadherin antibody</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BDB550548</td>
			<td>Primary antibody, manufacturer BD BioSciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 gas tank</td>
			<td>Various suppliers</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13998223</td>
			<td>For 37 &#176;C, 5% CO2 incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereomicrosope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9i</td>
			<td>Leica S9i Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>Endothelial cell growth basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Commercially known as Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 MV Singlequots Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4147</td>
			<td>Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007003IR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FiJi</td>
			<td>NIH</td>
			<td>NA</td>
			<td>Image processing software (<a href="https://imagej.net/Fiji/Downloads" target="_blank">https://imagej.net/Fiji/Downloads</a>)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11412-11</td>
			<td>Used for embryo dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Straight-Blade operating scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-808-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH-302-5601LR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow tissue culture hood</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>various models available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Vectashield with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy/Fisher</td>
			<td>50-980-494</td>
			<td>This is available at 32%; needs to be diluted to 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated spoon</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>10370-18</td>
			<td>Useful in removing embryo/tissues from a solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine VEGF-A 165</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>450-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps, Dumont #5</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sure-Seal Mouse/Rat chamber</td>
			<td>Easysysteminc</td>
			<td>EZ-1785</td>
			<td>Euthanasia chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model of coronary angiogenesis

هنا، نصف في المختبر الثقافة الزرع لدراسة الأوعية التاجية. الأوعية التاجية تغذية عضلة القلب وذات أهمية سريرية. العيوب في هذه الأوعية تمثل مخاطر صحية شديدة مثل تصلب الشرايين، والتي يمكن أن تؤدي إلى احتشاء عضلة القلب وفشل القلب في المرضى. وبالتالي، فإن مرض الشريان التاجي هو أحد الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم. على الرغم من أهميتها السريرية، لم يتم إحراز تقدم يذكر نسبيا في كيفية تجديد الشرايين التاجية التالفة. ومع ذلك، فقد أُحرز تقدم في الآونة الأخيرة في فهم المنشأ الخلوي ومسارات التمايز لتطوير الأوعية التاجية. وكان ظهور الأدوات والتكنولوجيات التي تسمح للباحثين لتسمية خلايا السلف الفلورسنت، ومتابعة مصيرها، وتصور progenies في الجسم الحي، تلعب دورا ً أساسياً في فهم تطور الأوعية التاجية. في دراسات الجسم الحي قيمة، ولكن لها قيود من حيث السرعة، وسهولة الوصول، والمرونة في التصميم التجريبي. بدلا من ذلك، يمكن للنماذج الدقيقة في المختبر لتولد الأوعية التاجية التحايل على هذه القيود والسماح للباحثين لاستجواب الأسئلة البيولوجية الهامة بسرعة ومرونة. قد يكون عدم وجود أنظمة نموذج في المختبر المناسب قد أعاق التقدم في فهم الآليات الخلوية والجزيئية لنمو الأوعية التاجية. هنا ، نصف نظام الاستزراع في المختبر لزراعة الأوعية التاجية من الوريد الالجيوب الأنفية (SV) وendocardium (Endo)، وهما أنسجة السلف التي تنشأ منها العديد من الأوعية التاجية. كما أكدنا أن الثقافات تُلخص بدقة بعض الآليات المعروفة في الجسم الحي. على سبيل المثال، نحن نظهر أن براعم الأوعية في الثقافة من SV downregulate COUP-TFII التعبير مماثلة لما لوحظ في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، نظهر أن VEGF-A ، وهو عامل أنجيوجينيك معروف في الجسم الحي ، يحفز بقوة تولد الأوعية من كل من ثقافات SV و Endo. بشكل جماعي ، ابتكرنا نموذجًا دقيقًا في الثقافة المختبرية لدراسة تولد الأوعية التاجية.

واحدة من السمات الأكثر لفتا للتولد الوعائي SV في الجسم الحي هو أنه يتبع مسارمحدد وينطوي على إزالة التمايز الخلية والأحداث التي تحدث في الأوقات النمطية والمواقف1. كما تنمو خلايا SV الأولية على البطين القلب، فإنها تتوقف عن إنتاج علامات وينوية مثل COUP-TFII<strong class="xfi...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Coronary Angiogenesis at JoVE.com

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

في المختبر يمكن استخدام نماذج تولد الأوعية التاجية لاكتشاف الآليات الخلوية والجزيئية لتولد الأوعية التاجية. في المختبر الثقافات الاستئصالية من الأنسجة الودينة والشغاف تظهر نموا قويا استجابة لVEGF-A وعرض نمط مماثل من التعبير COUP-TFII كما هو الحال في الجسم الحي.

في المختبر نموذج الأوعية التاجية

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

بروتوكولنا مهم لأنه يسمح للباحثين بالتحقيق في الآلية الجزيئية لتنشأة الأوعية التاجية خارج الكائن الحي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها النماذج بدقة عملية تولد الأوعية التاجية داخل كائن حي ، مما يسهل دراسة آليات تولد الأوعية التاجية. تبدأ برش فأرة حامل تحمل يوم الجنين 11.5 الأجنة مع 70٪ الإيثانول.رفع الجلد على البطن مع ملقط، واستخدام مقص لجعل الجلد البطني شق الصفاقي في شقاً شقاً شخصياً ولاحقاً حتى الحجاب الحاجز لفضح قرن الرحم. الامساك بالرحم، قطع الأنسجة الحرة وسحب قرن الرحم. ضع سلسلة الأجنة في نظام PBS المعقم البارد تحت مجهر ستيريو، وقش عضلات الرحم، كيس الصفار، وغطاء الأمنيون من كل جنين.كما يتم عزل كل جنين، واستخدام ملعقة مثقبة لنقل الأنسجة إلى طبق بيتري جديد يحتوي على برنامج تلفزيوني عقيم على الجليد. لحصاد أنسجة القلب الجنينية، نقل أول جنين يتم تشريحه في طبق بيتري جديد تحت المجهر، ووضع الجنين في الجانب البطني. استخدم ملقطًا ناعمًا لإجراء شق صغير في الصدر، فوق الحجاب الحاجز قليلاً، وأدخل ملقطًا مغلقًا في الشق لتكبير الشق.باستخدام ملقط لعقد جدار الصدر مفتوحة لفضح القلب والرئتين، واستخدام زوج الثاني من ملقط لتحريك بلطف القلب 90 درجة في وقت ما للكشف عن الشريان الأبهر الظهري والوريد. ثم، واستيعاب هذه الأوعية في قاعدة القلب، وسحب بعناية القلب والرئتين في وقت ما قبل وشطف الأنسجة مع برنامج تلفزيوني الباردة. عندما يتم حصاد جميع أنسجة القلب، ضع عينات القلب تحت المجهر وأزل فصوص الرئة من كل قلب.توجيه القلب الأول على جانبها الظهري، وعقد القلب في قاعدتها، واستخدام ملقط غرامة لكشط الأذين الأيسر والأيمين في الأنسجة المجاورة المحيطة SV من القلب. لعزل SV، توجيه الجانب الظهري القلب. إزالة بعناية SV من القلب واستخدام ماصة نقل معقمة لوضع الأنسجة المعزولة في طبق بيتري ستة سنتيمترات جديدة تحتوي على الجليد الباردة معقم برنامج تلفزيوني على الجليد.لعزل البطينينين كله، وإزالة المسالك الخارج واستخدام ماصة نقل معقمة جديدة لوضع البطينين في طبق بيتري ستة سنتيمترات منفصلة تحتوي على الجليد الباردة معقم برنامج تلفزيوني على الجليد. لإعداد SV وثقافات البطينين بأكملها ، اغطي أولاً أغشية ثمانية ميكرومتر مسام PET تضاف في بئر من 24 لوحة ثقافة جيدة ، مع 100 ميكرولترات من المصفوفة الخارجية الخلايا المخففة حديثًا لكل ثقافة لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية. عندما توطدت المصفوفة، استخدم ماصة نقل لنقل explant واحد على كل إدراج، ونقل لوحة تحت المجهر.باستخدام ملقط نظيفة، وضع explants في مركز كل إدراج لضمان أنها ليست تعلق على الجدران الجانبية، وإزالة بعناية أي برنامج تلفزيوني إضافي. المقبل، نقل لوحة مع غطاء مغلقة تحت غطاء ثقافة تدفق لارينار، وإضافة 100 ميكرولترات من المتوسط الكامل قبل الدافئة لكل إدراج، و 200 ميكرولترات إلى أسفل كل إدراج. ثم إضافة 300 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني إلى أي آبار غير المستخدمة، ووضع لوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة خمسة أيام.ل VEGF -A العلاج في اليوم الثاني من الثقافة ، وإزالة المتوسطة من كل غرفة من كل ثقافة وإضافة 100 ميكرولترس من برنامج تلفزيوني لكل إدراج ، و 200 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر. بعد دوامة لوحة عدة مرات، استبدال برنامج تلفزيوني مع 300 ميكرولترات من المتوسطة القاعدية تكملها مصل الأبقار الجنينية 1٪ لبدء الثقافات، والعودة إلى لوحة الحاضنة. في اليوم الثالث بعد المجاعة، إضافة 300 ميكرولترات من المتوسطة القاعدية الطازجة بالإضافة إلى المصل إلى آبار التحكم والمتوسطة القاعدية بالإضافة إلى 50 نانوغرام لكل ملليلتر من VEGF-A إلى آبار العلاج، وإعادة اللوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية.في اليوم السادس من الثقافة، وغسل الغرف مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح، وإصلاح الثقافات مع 200 ميكرولترات من 4٪ شبهformaldehyde في كل بئر، و 100 ميكرولترات من المثبت في كل إدراج. بعد 20 دقيقة في 4 درجات مئوية مع هزاز، وغسل الثقافات مع 300 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة لكل غسل مع هزاز في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل الأخير، إضافة 300 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة الأولية إلى الآبار وإدراج لثقافة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية مع هزاز.في صباح اليوم التالي ، وغسل الثقافات 10 مرات في السطح غير الأيونية في برنامج تلفزيوني مع هزاز ، وتغيير محلول الغسيل كل 10 دقائق قبل وضع العلامات على الثقافات مع 300 ميكرولترات من الأجسام المضادة الثانوية المناسبة fluorophore مترافق في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها مع هزاز. في اليوم التالي ، وغسل الثقافات 10 مرات في برنامج تلفزيوني جديد مع السطح غير الأيونية كما هو موضح. بعد الغسيل الأخير، استخدم ملقط غرامة لتقشير الغشاء بعناية من كل إدراج ووضع الأغشية على شرائح المجهر الزجاج الفردية، explant الجانب.تغطية العينات مع DAPI تكمل تصاعد المتوسطة في زلة الغطاء، وختم حواف زلات الغطاء مع طلاء الأظافر واضحة. عندما جفف طلاء الأظافر، صورة الشرائح عن طريق المجهر confocal. كما تنمو خلايا SV الأولية على بطين القلب، أنها تتوقف عن إنتاج علامات الوريدية مثل انقلاب TF2.بعد خمسة أيام من الثقافة، تنبت الخلايا البطانية SV وتهاجر على الغشاء. كما هو الحال في القلب الجنيني، يتم تقليل التعبير Coup-TF2 مع هجرة الأوعية بعيدًا عن SV. الثقافات حفزت مع معرض VEGF-A زيادة نمو براعم أوعية على حد سواء في الكثافة والطول. مزيد من الثقافات SV حفز من قبل VEGF-A تثبت زيادة ثلاثة أضعاف تقريبا في طول براعم بالمقارنة مع الضوابط, مما يشير إلى أن براعم البطانية من SV وsocardium تستجيب ل VEGF-A.من المهم عدم فقدان الأنسجة SV أثناء سحب القلب والرئتين، وإزالة الأذين، وتنظيف الأنسجة المجاورة المحيطة SV. يمكن إجراء تجارب التصوير الحية لتصور تولد الأوعية التاجية والتقاط تفاصيل الديناميات الخلوية والجزيئية أثناء العملية. هذه التقنية مفيدة للغاية لتقييم الآليات الجزيئية المحتملة لنشأة الأوعية التاجية وكنظام نموذجي لدراسة تولد الأوعية بشكل عام.

Research

JoVE Journal

Medicine

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

الشريان التاجي ربط Intramyocardial وحقن الفئران في نموذج من احتشاء

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

نموذج الفأر من القرنية الفحص جيب للدراسة الأوعية الدموية

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

ومتعددة الوسائط التصوير من الأوعية الدموية في نموذج الفئران عاري من سرطان الثدي الإنبثاث العظام باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي، الحجمي التصوير المقطعي والموجات فوق الصوتية

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

الأوعية الدموية في الرئة الجرذ الدماغية

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

شبكية العين مفرزة النموذجي في القوارض بواسطة حقن تحت الشبكية من هيالورونات الصوديوم

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

تقييم الموجات فوق الصوتية وبناء من الشريان التاجي تدفق وتدفق التاجي الاحتياطي باستخدام نموذج الزائد الضغط في الفئران

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Surgical Angiogenesis in Porcine Tibial Allotransplantation: A New Large Animal Bone Vascularized Composite Allotransplantation Model

الأوعية الجراحية في اللوترانسبلانتيشن قصبي الخنزير: Vascularized العظام حيوانية كبيرة جديدة نموذج مركب اللوترانسبلانتيشن

Segmental bone loss resulting from trauma, infection malignancy and congenital anomaly remains a major reconstructive challenge. Current therapeutic ...

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

إينترافيتال المجهري لصاروخ موجه الوحيدات والأوعية المتصلة بورم في نموذج مورين لأمراض الشرايين الطرفية

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

متساوي القياس كونتراكتيليتي القياس الشريان المساريقي العلوي الماوس باستخدام أسلاك ميوجرافي

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

تقييم تكوين الأوعية العلاجية في نموذج مورين من نقص التروية الخلفية

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...