Name: in vitro model of coronary angiogenesis
Uploaded: 2020-03-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Coronary Angiogenesis at JoVE.com

Forfatterne takker medlemmerne af Sharma laboratorium for at give en støttende forskning miljø. Vi vil gerne rette en særlig tak til Diane (Dee) R. Hoffman, der vedligeholder og bekymrer sig om vores musekoloni. Vi vil også gerne takke Drs. Philip J. Smaldino og Carolyn Vann for grundigt korrekturlæsning af manuskriptet og give nyttige kommentarer. Dette arbejde blev støttet af midler fra Ball State University Provost Office og Institut for Biologi til BS, Indiana Academy of Sciences Senior Research Grant midler til BS, og NIH (RO1-HL128503) og The New York Stem Cell Foundation midler til KK

Brugen af alle dyrene i denne protokol fulgte Ball State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) retningslinjer.
1. Oprettelse af Mus Opdrættere og detektering Vaginal Stik til tidsforrettede graviditeter
<ol><li>Opret en mus avl bur med vilde type mandlige og kvindelige mus. Sørg for, at avlsmusenes alder er mellem 6-8 uger. Opret enten et par (1 han og 1 hun) eller som en trio (1 han og 2 hunner) til avl.</li>
	<li>Kontroller for en vaginal stik den følgende morge...

<ol>
	<li>Red-Horse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells.">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sinus+venosus+contributes+to+coronary+vasculature+through+VEGFC-stimulated+angiogenesis.">The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis.</a> Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).</li><li>Volz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+are+progenitors+for+coronary+artery+smooth+muscle.">Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-C+and+aortic+cardiomyocytes+guide+coronary+artery+stem+development.">VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4899-4914 (2014).</li><li>Chang, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DACH1+stimulates+shear+stress-guided+endothelial+cell+migration+and+coronary+artery+growth+through+the+CXCL12-CXCR4+signaling+axis.">DACH1 stimulates shear stress-guided endothelial cell migration and coronary artery growth through the CXCL12-CXCR4 signaling axis.</a> Genes and Development. , (2017).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepicardial+endothelial+cells+invade+the+embryonic+ventricle+wall+to+form+coronary+arteries.">Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries.</a> Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+Cells+Form+the+Coronary+Arteries+by+Angiogenesis+through+Myocardial-Endocardial+VEGF+Signaling.">Endocardial Cells Form the Coronary Arteries by Angiogenesis through Myocardial-Endocardial VEGF Signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Katz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+compartments+of+the+proepicardial+organ+give+rise+to+coronary+vascular+endothelial+cells.">Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells.</a> Developmental Cell. 22 (3), 639-650 (2012).</li><li>Das, S., Red-Horse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+plasticity+in+cardiovascular+development+and+disease.">Cellular plasticity in cardiovascular development and disease.</a> Developmental Dynamics. 246 (4), 328-335 (2017).</li><li>Sharma, B., Chang, A., Red-Horse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+Artery+Development:+Progenitor+Cells+and+Differentiation+Pathways.">Coronary Artery Development: Progenitor Cells and Differentiation Pathways.</a> Annual Review of Physiology. 79, 1-19 (2017).</li><li>Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+origin+and+developmental+program+of+coronary+angiogenesis.">Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis.</a> Circulation Research. 116 (3), 515-530 (2015).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling.">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Gerhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+guides+angiogenic+sprouting+utilizing+endothelial+tip+cell+filopodia.">VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia.</a> Journal of Cell Biology. 161 (6), 1163-1177 (2003).</li><li>Ruhrberg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+restricted+patterning+cues+provided+by+heparin-binding+VEGF-A+control+blood+vessel+branching+morphogenesis.">Spatially restricted patterning cues provided by heparin-binding VEGF-A control blood vessel branching morphogenesis.</a> Genes and Development. 16 (20), 2684-2698 (2002).</li><li>Kikuchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antiangiogenic+isoform+of+VEGF-A+contributes+to+impaired+vascularization+in+peripheral+artery+disease.">An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease.</a> Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2002).</li><li>Folkman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+tumor+factor+responsible+for+angiogenesis.">Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 133 (2), 275-288 (1971).</li><li>Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+VEGF+in+the+regulation+of+physiological+and+pathological+angiogenesis.">The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis.</a> Experientia Supplementum. (94), 209-231 (2005).</li><li>Ferrara, N., Bunting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor,+a+specific+regulator+of+angiogenesis.">Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 5 (1), 35-44 (1996).</li><li>Sharma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Progenitor+Cells+Compensate+to+Rebuild+the+Coronary+Vasculature+in+Elabela-+and+Apj-Deficient+Hearts.">Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts.</a> Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).</li><li>Rhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+deletion+of+Ino80+disrupts+coronary+angiogenesis+and+causes+congenital+heart+disease.">Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease.</a> Nature Communications. 9 (1), 368 (2018).</li></ol>

Nogle af de mest kritiske skridt for en vellykket dyrkning koronar fartøjer fra SV og Endo progenitor væv er: 1) Korrekt identifikation og isolering af SV væv for SV kultur; 2) brug af hjertekamre fra embryoner i alderen e11−11.5 for nøjagtig Endo-kultur; 3) at opretholde sterile forhold i hele dissektionsperioden og holde vævet koldt på alle tidspunkter; og 4) holde explants knyttet til ECM belagt membran for at undgå væv flyder i mediet.
For det første kan isolering af SV-væv væ...

Blodkar i hjertet er almindeligvis kaldes koronar fartøjer. Disse fartøjer består af arterier, vener og kapillærer. Under udviklingen, stærkt forgrenede kapillærer er etableret først, som derefter omforme stil kranspulsårerne og vener1,2,3,4,5. Disse indledende kapillærer er bygget af endotel progenitor celler findes i proepicardium, sinus venosus (SV), og endocardium (Endo) væv1,6,7,8. SV er inflow organ af embryonale hjerte og Endo er den indvendige foring af hjertet lumen. Endotel stamphændede celler findes i SV og Endo opbygge størstedelen af koronar vaskulatur, mens proepicardium bidrager til en relativt lille del af det2. Den proces, hvorved kapillær netværk af koronar fartøjer vokser i hjertet fra sin allerede eksisterende prækursor celler kaldes koronar angiogenese. Koronararteriesygdom er en af de førende dødsårsager på verdensplan, og alligevel mangler en effektiv behandling for denne sygdom. Forståelse af detaljerede cellulære og molekylære mekanismer koronar angiogenese kan være nyttige i udformningen af nye og effektive behandlinger til at reparere og regenerere beskadigede kranspulsårer.
For nylig er en kraftig stigning i vores forståelse af, hvordan koronar fartøjer udvikler sig, til dels opnået gennem udvikling af nye værktøjer og teknologier. Navnlig har mærkning af in vivo-afstamning og avancerede billeddannelsesteknologier været meget nyttige til at afdække koronarfartøjernes celleoprindelse og differentieringsveje9,10,11,12. På trods af fordelene ved disse in vivo-værktøjer er der begrænsninger med hensyn til hastighed, fleksibilitet og tilgængelighed. Derfor kan robuste in vitro-modelsystemer supplere in vivo-systemer for at belyse de cellulære og molekylære mekanismer i koronar angiogenese på en måde med høj overførselsdrift.
Her beskriver vi en in vitro model af koronar angiogenese. Vi har udviklet et in vitro explant kultursystem til at dyrke koronarfartøjer fra to progenitorvæv, SV og Endo. Med denne model viser vi, at in vitro-vævseksplantens kulturer vokser koronarspirer, når de stimuleres af vækstmedium. Derudover, explant kulturer vokser hurtigt i forhold til kontrol, når stimuleret af vaskulære endotel vækstfaktor A (VEGF-A), en meget potent angiogenic protein. Desuden fandt vi, at de angiogene spirer fra SV-kulturen gennemgår venøs dedifferentiering (tab af COUP-TFII udtryk), en mekanisme svarende til SV angiogenese in vivo1. Disse data tyder på, at in vitro explant kultur system trofast genindfører angiogene hændelser, der opstår in vivo. Kollektivt, in vitro modeller af angiogenese, der er beskrevet her er ideelle til sondering cellulære og molekylære mekanismer koronar angiogenese i en høj-throughput og tilgængelig måde.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 x 20 MM Tissue Culture Dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>877222</td>
			<td>Referred in the protocol as Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.0 uM PET membrane culture inserts</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MCEP24H48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A31572</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-rat 488</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled Metal Probe</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>10088-15</td>
			<td>Angled 45 degree, used for detecting deep plugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- ERG 1/2/3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab92513</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- VE-Cadherin antibody</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BDB550548</td>
			<td>Primary antibody, manufacturer BD BioSciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 gas tank</td>
			<td>Various suppliers</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13998223</td>
			<td>For 37 &#176;C, 5% CO2 incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereomicrosope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9i</td>
			<td>Leica S9i Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>Endothelial cell growth basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Commercially known as Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 MV Singlequots Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4147</td>
			<td>Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007003IR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FiJi</td>
			<td>NIH</td>
			<td>NA</td>
			<td>Image processing software (<a href="https://imagej.net/Fiji/Downloads" target="_blank">https://imagej.net/Fiji/Downloads</a>)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11412-11</td>
			<td>Used for embryo dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Straight-Blade operating scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-808-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH-302-5601LR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow tissue culture hood</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>various models available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Vectashield with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy/Fisher</td>
			<td>50-980-494</td>
			<td>This is available at 32%; needs to be diluted to 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated spoon</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>10370-18</td>
			<td>Useful in removing embryo/tissues from a solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine VEGF-A 165</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>450-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps, Dumont #5</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sure-Seal Mouse/Rat chamber</td>
			<td>Easysysteminc</td>
			<td>EZ-1785</td>
			<td>Euthanasia chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model of coronary angiogenesis

Her beskriver vi en in vitro kultur assay at studere koronar angiogenese. Koronar fartøjer fodre hjertemusklen og er af klinisk betydning. Defekter i disse fartøjer udgør alvorlige sundhedsrisici såsom åreforkalkning, hvilket kan føre til myokardieinfarkter og hjertesvigt hos patienter. Derfor, koronararteriesygdom er en af de førende dødsårsager på verdensplan. På trods af sin kliniske betydning, relativt lidt fremskridt er blevet gjort på, hvordan man regenerere beskadigede kranspulsårer. Ikke desto mindre er der gjort nylige fremskridt med hensyn til at forstå den cellulære oprindelse og differentieringsveje for udvikling af koronarfartøjer. Fremkomsten af værktøjer og teknologier, der giver forskerne mulighed for at fluorescerende mærke progenitor celler, følge deres skæbne, og visualisere afkom in vivo har været medvirkende til at forstå koronar fartøj udvikling. In vivo-undersøgelser er værdifulde, men har begrænsninger med hensyn til hastighed, tilgængelighed og fleksibilitet i forsøgsdesign. Alternativt, nøjagtige in vitro modeller af koronar angiogenese kan omgå disse begrænsninger og give forskerne mulighed for at afhøre vigtige biologiske spørgsmål med hastighed og fleksibilitet. Manglen på passende in vitro model systemer kan have hindret fremskridt i forståelsen af cellulære og molekylære mekanismer koronar fartøj vækst. Her beskriver vi et in vitro kultursystem til dyrkning af koronarfartøjer fra sinus venosus (SV) og endocardium (Endo), de to progenitorvæv, hvorfra mange af koronarfartøjerne opstår. Vi bekræftede også, at kulturerne nøjagtigt opsummerer nogle af de kendte in vivo-mekanismer. For eksempel viser vi, at de angiogene spirer i kultur fra SV downregulate COUP-TFII udtryk svarende til, hvad der er observeret in vivo. Derudover viser vi, at VEGF-A, en velkendt angiogenic faktor in vivo, robust stimulerer angiogenese fra både SV og Endo kulturer. Kollektivt har vi udtænkt en nøjagtig in vitro kultur model til at studere koronar angiogenese.

Et af de mest slående træk ved SV angiogenese in vivo er, at det følger en bestemt vej og indebærer celle dedifferentiering og redifferentiering begivenheder, der opstår på stereotype tidspunkter og positioner1. Som indledende SV-celler vokser på hjertet hjertekammer, de holder op med at producere venøse markører såsom COUP-TFII (Figur 7). Efterfølgende koronar spirer tage to migration stier, enten over overfladen af hjertet...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Coronary Angiogenesis at JoVE.com

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

In vitro modeller af koronar angiogenese kan udnyttes til opdagelsen af de cellulære og molekylære mekanismer koronar angiogenese. In vitro explant kulturer af sinus venosus og endokardiet væv viser robust vækst som reaktion på VEGF-A og vise et lignende mønster af COUP-TFII udtryk som in vivo.

In Vitro Model af koronar Angiogenese

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

Vores protokol er betydelig, fordi det giver forskerne mulighed for at undersøge den molekylære mekanisme af koronar angiogenese uden for en organisme. Den største fordel ved denne teknik er, at det præcist modeller processen med koronar angiogenese inde i en organisme, lette studiet af mekanismerne i koronar angiogenese. Begynd med at sprøjte en gravid mus med embryonale dag 11,5 embryoner med 70% ethanol.Løft huden over maven med kraftforpinte, bruge en saks til at gøre en abdominal hud og bughinde indsnit side og anteriorly op til mellemgulvet at udsætte livmoderhorn. Gribe livmoderen, skære vævet fri og trække livmoderen horn. Placer strengen af embryoner i iskold steril PBS under et stereomikroskop, og skræl livmodermusklen, blommesækken og amniondækslet fra hvert foster.Da hvert embryon er isoleret, skal du bruge en perforeret ske til at overføre vævene til en ny petriskål, der indeholder steril PBS på is. At høste embryonale hjertevæv, overføre det første foster, der skal dissekeres i en ny petriskål under mikroskopet, og placere fosteret i ventrale side op. Brug fine kraftføringer til at lave et lille snit i brystet, lidt over mellemgulvet, og indsæt de lukkede kraftfornæv i snittet for at forstørre snittet.Brug af scerotter til at holde brystvæggen åben for at udsætte hjertet og lungerne, bruge et andet par kraftrekniver til forsigtigt at flytte hjertet anteriorly 90 grader for at afsløre dorsal aorta og vene. Derefter gribe disse fartøjer i bunden af hjertet, forsigtigt trække hjertet og lungerne anteriorly og skyl væv med koldt PBS. Når alt hjertevævet er høstet, skal du placere hjerteprøverne under mikroskopet og fjerne lungeflipperne fra hvert hjerte.Orient det første hjerte på sin dorsale side, og holde hjertet på sin base, bruge fine kraftbecestavler til at skrabe venstre og højre atria i det tilstødende væv omkring SV fra hjertet. For at isolere SV, orientere hjertet dorsale side op. Fjern forsigtigt SV fra hjertet og brug en steril overførselspipette til at placere det isolerede væv i en ny seks centimeter petriskål, der indeholder iskold steril PBS på is.For at isolere hele hjertekamrene fjernes udstrømningskanalen og bruges en ny steril overførselspipette til at placere hjertekamrene i en separat seks centimeter petriskål, der indeholder iskold steril PBS på is. For at oprette SV og hele ventrikelkulturer, første lag membranerne i en otte mikrometer pore PET kultur indsætte per brønd af en 24 brønd kultur plade, med 100 mikroliter af friskfortyndet ekstracellulære matrix pr kultur i mindst 30 minutter ved 37 grader Celsius. Når matrixen er størknet, skal du bruge en overførselspipette til at overføre en explant på hvert skær og flytte pladen under mikroskopet.Brug rene vicesser, placere explants i midten af hver indsats for at sikre, at de ikke er fastgjort til sidevæggene, og forsigtigt fjerne eventuelle ekstra PBS. Dernæst overføre pladen med låget lukket under en laminar flow væv kultur hætte, og tilsæt 100 mikroliter af forvarperede komplet medium til hver indsats, og 200 mikroliter til godt under hver indsats. Derefter tilsættes 300 mikroliter AF PBS til eventuelle ubrugte brønde, og læg pladen i cellekulturskuvøsen i fem dage.For VEGF-A behandling på dag to af kultur, fjerne mediet fra begge kamre i hver kultur og tilføje 100 mikroliter af PBS til hver indsætte, og 200 mikroliter af PBS til hver brønd. Efter at have hvirvlet pladen et par gange, skal PBS udskiftes med 300 mikroliter af basalt medium suppleret med 1 % føtalt kvægserum for at starte kulturerne og returnere pladen til inkubatoren. På dag tre efter sult tilsættes 300 mikroliter frisk basalt medium plus serum til kontrolboserne og basalmediet plus 50 nanogram pr. milliliter VEGF-A til behandlingsbomerne, og pladen returneres til cellekulturkubvøsen.På den sjette kulturdag vaskes kamrene med PBS som påvist, og de kulturer med 200 mikroliter på 4% paraformaldehyd i hver brønd og 100 mikroliter fiksativ i hver indsats. Efter 20 minutter ved 4 grader Celsius med rokkende, vask kulturerne med 300 mikroliter AF PBS i 10 minutter pr vask med rokkende ved stuetemperatur. Efter den sidste vask, tilsæt 300 mikroliter af primære antistof opløsning til brøndene og skær til en overnatning kultur ved fire grader Celsius med vuggende.Den næste morgen, vaske kulturerne 10 gange i non-ionisk overfladeaktivt stof i PBS med vuggende, ændre vaskeopløsning hver 10 minutter før mærkning af kulturer med 300 mikroliter af en passende fluorophore konjugerede sekundære antistof ved fire grader Celsius natten over med vuggende. Den næste dag vaskes kulturerne 10 gange i frisk PBS med nonionisk overfladeaktivt stof som påvist. Efter den sidste vask, bruge fine kraftføringer til omhyggeligt at skrælle membranen fra hver indsats og placere membraner på de enkelte glas mikroskop dias, explant side op.Dæk prøverne med DAPI suppleret monteringsmed i et dæksel slip, og forsegle kanterne af dækslet glider med klar neglelak. Når neglelakken er tørret, skal du afbilde objektglassene ved konfokal mikroskopi. Som indledende SV-celler vokser på hjertet hjertekammer, de holder op med at producere venøse markører såsom Coup-TF2.Efter fem dages kultur spirer sv-endotelceller og vandrer ind på membranen. Som i fosterhjertet reduceres Coup-TF2-udtrykket, når fartøjerne vandrer væk fra SV. Kulturer stimuleret med VEGF-A udviser en øget vækst af angiogene spirer både i tæthed og længde. Yderligere SV kulturer stimuleret af VEGF-A demonstrere en næsten tre gange stigning i spire længde i forhold til kontrol, hvilket tyder på, at endotel spirer fra SV og endocardium reagere på VEGF-A.Det er vigtigt ikke at miste SV væv, mens trække ud af hjertet og lungerne, fjerne atria, og rengøring af tilstødende væv omkring SV. Levende billeddannelse eksperimenter kan udføres for at visualisere koronar angiogenese og fange detaljerne i cellulære og molekylære dynamik under processen. Denne teknik er yderst nyttig til vurdering af potentielle molekylære mekanismer af koronar angiogenese og som en model system til at studere angiogenese i almindelighed.

Research

JoVE Journal

Medicine

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Multi-modal Imaging af angiogenese i en nøgen rotte model af Breast Cancer knoglemetastaser Brug Magnetic Resonance Imaging, Volumetrisk Computed Tomography og Ultralyd

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

Angiogenese i den iskæmiske rottelunge

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Nethindeløsning Model i Gnavere ved subretinal Injektion af Natriumhyaluronats

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Ultralyd funderet vurdering af koronararterie Flow og koronar Flow Reserve Brug af trykoverbelastning Model i mus

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Surgical Angiogenesis in Porcine Tibial Allotransplantation: A New Large Animal Bone Vascularized Composite Allotransplantation Model

Kirurgisk angiogenese i svin Tibial Allotransplantation: en ny stor animalsk knogle vaskulariserede sammensatte Allotransplantation Model

Segmental bone loss resulting from trauma, infection malignancy and congenital anomaly remains a major reconstructive challenge. Current therapeutic ...

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

Intravital mikroskopi af monocyt målsøgende og Tumor-relaterede angiogenese i en Murine Model af perifer arteriel sygdom

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk kontraktilitet måling af musen mesenterica arterie ved hjælp af Wire blodkar

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Vurdering af terapeutisk angiogenese i en murine model af baglemmer iskæmi

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...