Name: in vitro model of coronary angiogenesis
Uploaded: 2020-03-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Coronary Angiogenesis at JoVE.com

De auteurs bedanken de leden van het Sharma laboratorium voor het verstrekken van een ondersteunende onderzoeksomgeving. Wij willen graag speciale dank aan Diane (Dee) R. Hoffman die onderhoudt en zorgt voor onze muis kolonie. We willen ook Drs. Philip J. Smaldino en Carolyn Vann bedanken voor het grondig nalezen van het manuscript en het verstrekken van nuttige opmerkingen. Dit werk werd ondersteund door fondsen van Ball State University Provost Office en Department of Biology naar B.S, Indiana Academy of Sciences Senior Research Grant fondsen aan B.S, en NIH (RO1-HL128503) en The New York Stem Cell Foundation fondsen aan K.R.

Het gebruik van alle dieren in dit protocol volgde Ball State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) richtlijnen.
1. Oprichting van muisfokkers en het detecteren van vaginale pluggen voor getimede zwangerschappen
<ol><li>Het opzetten van een muis kweekkooi met wilde type mannelijke en vrouwelijke muizen. Zorg ervoor dat de leeftijd van de broedmuizen tussen 6-8 weken ligt. Stel een paar (1 man en 1 vrouwtje) of als trio (1 mannetje en 2 vrouwtje) op voor de fokkerij.<...

<ol>
	<li>Red-Horse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells.">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sinus+venosus+contributes+to+coronary+vasculature+through+VEGFC-stimulated+angiogenesis.">The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis.</a> Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).</li><li>Volz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+are+progenitors+for+coronary+artery+smooth+muscle.">Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-C+and+aortic+cardiomyocytes+guide+coronary+artery+stem+development.">VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4899-4914 (2014).</li><li>Chang, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DACH1+stimulates+shear+stress-guided+endothelial+cell+migration+and+coronary+artery+growth+through+the+CXCL12-CXCR4+signaling+axis.">DACH1 stimulates shear stress-guided endothelial cell migration and coronary artery growth through the CXCL12-CXCR4 signaling axis.</a> Genes and Development. , (2017).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepicardial+endothelial+cells+invade+the+embryonic+ventricle+wall+to+form+coronary+arteries.">Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries.</a> Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+Cells+Form+the+Coronary+Arteries+by+Angiogenesis+through+Myocardial-Endocardial+VEGF+Signaling.">Endocardial Cells Form the Coronary Arteries by Angiogenesis through Myocardial-Endocardial VEGF Signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Katz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+compartments+of+the+proepicardial+organ+give+rise+to+coronary+vascular+endothelial+cells.">Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells.</a> Developmental Cell. 22 (3), 639-650 (2012).</li><li>Das, S., Red-Horse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+plasticity+in+cardiovascular+development+and+disease.">Cellular plasticity in cardiovascular development and disease.</a> Developmental Dynamics. 246 (4), 328-335 (2017).</li><li>Sharma, B., Chang, A., Red-Horse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+Artery+Development:+Progenitor+Cells+and+Differentiation+Pathways.">Coronary Artery Development: Progenitor Cells and Differentiation Pathways.</a> Annual Review of Physiology. 79, 1-19 (2017).</li><li>Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+origin+and+developmental+program+of+coronary+angiogenesis.">Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis.</a> Circulation Research. 116 (3), 515-530 (2015).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling.">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Gerhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+guides+angiogenic+sprouting+utilizing+endothelial+tip+cell+filopodia.">VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia.</a> Journal of Cell Biology. 161 (6), 1163-1177 (2003).</li><li>Ruhrberg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+restricted+patterning+cues+provided+by+heparin-binding+VEGF-A+control+blood+vessel+branching+morphogenesis.">Spatially restricted patterning cues provided by heparin-binding VEGF-A control blood vessel branching morphogenesis.</a> Genes and Development. 16 (20), 2684-2698 (2002).</li><li>Kikuchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antiangiogenic+isoform+of+VEGF-A+contributes+to+impaired+vascularization+in+peripheral+artery+disease.">An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease.</a> Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2002).</li><li>Folkman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+tumor+factor+responsible+for+angiogenesis.">Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 133 (2), 275-288 (1971).</li><li>Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+VEGF+in+the+regulation+of+physiological+and+pathological+angiogenesis.">The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis.</a> Experientia Supplementum. (94), 209-231 (2005).</li><li>Ferrara, N., Bunting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor,+a+specific+regulator+of+angiogenesis.">Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 5 (1), 35-44 (1996).</li><li>Sharma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Progenitor+Cells+Compensate+to+Rebuild+the+Coronary+Vasculature+in+Elabela-+and+Apj-Deficient+Hearts.">Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts.</a> Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).</li><li>Rhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+deletion+of+Ino80+disrupts+coronary+angiogenesis+and+causes+congenital+heart+disease.">Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease.</a> Nature Communications. 9 (1), 368 (2018).</li></ol>

Enkele van de meest kritische stappen voor het succesvol kweken van kransslagaders van de SV en Endo voorloperweefsels zijn: 1) Het correct identificeren en isoleren van het SV-weefsel voor sv-cultuur; 2) het gebruik van ventrikels uit embryo's tussen de leeftijden van e11−11.5 voor een nauwkeurige Endo-cultuur; 3) het handhaven van steriele omstandigheden gedurende de gehele dissectieperiode en het te allen tijde koud houden van de weefsels; en 4) het houden van de explants aan het ecm gecoate membraan om te voorkomen...

Bloedvaten van het hart worden vaak coronaire bloedvaten genoemd. Deze vaten bestaan uit slagaders, aders en haarvaten. Tijdens de ontwikkeling worden eerst sterk vertakte haarvaten aangelegd, die vervolgens worden verbouwd tot kransslagaders en aders1,2,3,4,5. Deze eerste haarvaten zijn opgebouwd uit endotheelvoorlopercellen gevonden in het proepicardium, sinus venosus (SV) en endocardium (Endo) weefsels1,6,7,8. SV is het instroomorgaan van het embryonale hart en Endo is de binnenvoering van het hartlumen. Endotheel voorlopercellen gevonden in de SV en Endo bouwen de meerderheid van de coronaire vasculatuur, terwijl het proepicardium bijdraagt aan een relatief klein deel van het2. Het proces waarbij het capillaire netwerk van kransslagaders in het hart uit zijn reeds bestaande voorlopercellen groeit, wordt coronaire angiogenese genoemd. Coronaire hartziekte is een van de belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd en toch ontbreekt een effectieve behandeling voor deze ziekte. Inzicht in de gedetailleerde cellulaire en moleculaire mechanismen van coronaire angiogenese kan nuttig zijn bij het ontwerpen van nieuwe en effectieve therapieën te herstellen en te regenereren beschadigde kransslagaders.
Onlangs is een toename in ons begrip van hoe coronaire schepen ontwikkelen gedeeltelijk is bereikt door de ontwikkeling van nieuwe instrumenten en technologieën. Met name in vivo zijn de etikettering seinage-etikettering en geavanceerde beeldvormingstechnologieën zeer nuttig geweest bij het blootleggen van de cellulaire oorsprong s- en differentiatietrajecten van kransslagaders9,10,11,12. Ondanks de voordelen van deze in vivo tools, zijn er beperkingen op het gebied van snelheid, flexibiliteit en toegankelijkheid. Daarom kunnen robuuste in vitro modelsystemen in vivo systemen aanvullen om de cellulaire en moleculaire mechanismen van coronaire angiogenese op een hoge doorvoermanier op te helderen.
Hier beschrijven we een in vitro model van coronaire angiogenese. We hebben een in vitro explant kweeksysteem ontwikkeld om kransslagaders te kweken uit twee voorloperweefsels, SV en Endo. Met dit model laten we zien dat de in vitro weefselexplantculturen coronaire vaatspruiten kweken wanneer ze worden gestimuleerd door groeimedium. Bovendien groeien de explantculturen snel in vergelijking met controle wanneer ze worden gestimuleerd door vasculaire endotheelgroeifactor A (VEGF-A), een zeer krachtig angiogeen eiwit. Verder vonden we dat de angiogene spruiten uit de SV-cultuur veneuze dedifferentiatie ondergaan (verlies van COUP-TFII-expressie), een mechanisme vergelijkbaar met SV angiogenese in vivo1. Deze gegevens suggereren dat het in vitro explantcultuursysteem angiogene gebeurtenissen die in vivo voorkomen getrouw herstelt. Collectief, in vitro modellen van angiogenese die hier worden beschreven zijn ideaal voor het indringende cellulaire en moleculaire mechanismen van coronaire angiogenese in een hoge doorvoer en toegankelijke manier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 x 20 MM Tissue Culture Dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>877222</td>
			<td>Referred in the protocol as Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.0 uM PET membrane culture inserts</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MCEP24H48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A31572</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-rat 488</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled Metal Probe</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>10088-15</td>
			<td>Angled 45 degree, used for detecting deep plugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- ERG 1/2/3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab92513</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- VE-Cadherin antibody</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BDB550548</td>
			<td>Primary antibody, manufacturer BD BioSciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 gas tank</td>
			<td>Various suppliers</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13998223</td>
			<td>For 37 &#176;C, 5% CO2 incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereomicrosope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9i</td>
			<td>Leica S9i Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>Endothelial cell growth basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Commercially known as Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 MV Singlequots Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4147</td>
			<td>Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007003IR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FiJi</td>
			<td>NIH</td>
			<td>NA</td>
			<td>Image processing software (<a href="https://imagej.net/Fiji/Downloads" target="_blank">https://imagej.net/Fiji/Downloads</a>)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11412-11</td>
			<td>Used for embryo dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Straight-Blade operating scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-808-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH-302-5601LR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow tissue culture hood</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>various models available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Vectashield with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy/Fisher</td>
			<td>50-980-494</td>
			<td>This is available at 32%; needs to be diluted to 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated spoon</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>10370-18</td>
			<td>Useful in removing embryo/tissues from a solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine VEGF-A 165</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>450-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps, Dumont #5</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sure-Seal Mouse/Rat chamber</td>
			<td>Easysysteminc</td>
			<td>EZ-1785</td>
			<td>Euthanasia chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model of coronary angiogenesis

Hier beschrijven we een in vitro cultuurtest om coronaire angiogenese te bestuderen. Coronaire bloedvaten voeden de hartspier en zijn van klinisch belang. Defecten in deze bloedvaten vertegenwoordigen ernstige gezondheidsrisico's, zoals bij atherosclerose, wat kan leiden tot hartinfarcten en hartafwijkingen bij patiënten. Bijgevolg, coronaire hartziekte is een van de belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd. Ondanks het klinische belang, relatief weinig vooruitgang is geboekt op het gebied van het regenereren van beschadigde kransslagaders. Niettemin is er recente vooruitgang geboekt bij het begrijpen van de cellulaire oorsprong en differentiatietrajecten van coronaire vaatontwikkeling. De komst van tools en technologieën die onderzoekers in staat stellen om fluorescerende label voorlopercellen, volgen hun lot, en visualiseren progenies in vivo zijn instrumenteel in het begrijpen van coronaire schip ontwikkeling. In vivo studies zijn waardevol, maar hebben beperkingen in termen van snelheid, toegankelijkheid en flexibiliteit in experimenteel ontwerp. Als alternatief kunnen nauwkeurige in vitro modellen van coronaire angiogenese deze beperkingen omzeilen en onderzoekers in staat stellen om belangrijke biologische vragen snel en flexibel te ondervragen. Het ontbreken van geschikte in vitro modelsystemen kan de vooruitgang in het begrijpen van de cellulaire en moleculaire mechanismen van coronaire vaatgroei hebben belemmerd. Hier beschrijven we een in vitro cultuursysteem om kransslagaders te laten groeien uit de sinusvenosus (SV) en endocardium (Endo), de twee voorloperweefsels waaruit veel van de kransslagaders voortkomen. We hebben ook bevestigd dat de culturen nauwkeurig een aantal van de bekende in vivo mechanismen samenvatten. Zo tonen we aan dat de angiogene spruiten in de cultuur van SV downregulate COUP-TFII expressie vergelijkbaar met wat wordt waargenomen in vivo. Daarnaast tonen we aan dat VEGF-A, een bekende angiogene factor in vivo, angiogenese van zowel de SV- als Endo-culturen robuust stimuleert. Gezamenlijk hebben we een nauwkeurig in vitro cultuurmodel bedacht om coronaire angiogenese te bestuderen.

Een van de meest opvallende kenmerken van SV angiogenese in vivo is dat het een specifiek traject volgt en celdedifferentiatie en redifferentiatiegebeurtenissen omvat die zich voordoen op stereotiepe tijden en posities1. Als de eerste SV-cellen op de hartkamer groeien, stoppen ze met het produceren van veneuze markers zoals COUP-TFII (Figuur 7). Vervolgens nemen coronaire spruiten twee migratiepaden, hetzij over het oppervlak van het h...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Coronary Angiogenesis at JoVE.com

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

In vitro modellen van coronaire angiogenese kan worden gebruikt voor de ontdekking van de cellulaire en moleculaire mechanismen van coronaire angiogenese. In vitro explantculturen van sinusvenosus- en endocardiumweefsels laten een robuuste groei zien in reactie op VEGF-A en vertonen een vergelijkbaar patroon van COUP-TFII-expressie als in vivo.

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

Ons protocol is belangrijk omdat het onderzoekers in staat stelt om het moleculaire mechanisme van coronaire angiogenese buiten een organisme te onderzoeken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het nauwkeurig modellen van het proces van coronaire angiogenese in een organisme, het vergemakkelijken van de studie van de mechanismen van coronaire angiogenese. Begin met het spuiten van een zwangere muis die embryonale dag 11,5 embryo's met 70% ethanol.Het opheffen van de huid over de buik met tangen, gebruik schaar om een buikhuid en peritoneale incisie lateraal en anteriorly tot het middenrif te maken om de baarmoederhoorn bloot te stellen. Grijpen de baarmoeder, snijd het weefsel vrij en trek de baarmoeder hoorn. Plaats de reeks embryo's in ijskoude steriele PBS onder een stereomicroscoop, en pel de baarmoederspier, dooierzak, en amniondekking van elk embryo.Gebruik een geperforeerde lepel om de weefsels over te brengen in een nieuwe petrischaal met steriele PBS op ijs. Om het embryonale hartweefsel te oogsten, breng je het eerste embryo dat ontleed wordt in een nieuw petrischaaltje onder de microscoop en plaats je het embryo in ventrale kant omhoog. Gebruik fijne tangen om een kleine incisie in de borst te maken, iets boven het middenrif, en steek de gesloten tangen in de incisie om de incisie te vergroten.Met behulp van de tangen om de borstwand open te houden om het hart en de longen bloot te stellen, gebruik een tweede paar tangen om het hart voorzichtig 90 graden te bewegen om de rugaorta en ader bloot te leggen. Dan, grijpen deze vaten aan de basis van het hart, zorgvuldig trek het hart en de longen voorste en spoel de weefsels met koude PBS. Wanneer al het hartweefsel is geoogst, plaats de hartmonsters onder de microscoop en verwijder de longkwabben uit elk hart.Oriënteer het eerste hart op zijn rugzijde, en houd het hart aan de basis, gebruik fijne tangen om de linker en rechter atria schrapen in het aangrenzende weefsel rond de SV uit het hart. Om de SV te isoleren, oriënteer de hart rugkant omhoog. Verwijder de SV voorzichtig uit het hart en gebruik een steriele transferpipet om het geïsoleerde weefsel in een nieuwe petrischaal van zes centimeter te plaatsen met ijskoude steriele PBS op ijs.Om de hele ventrikels te isoleren, verwijder de uitstroom en gebruik een nieuwe steriele overdracht pipet om de ventrikels te plaatsen in een aparte zes centimeter petrischaal met ijskoude steriele PBS op ijs. Om SV en hele ventrikelculturen op te zetten, bestlaag de membranen van één acht micrometer porie PET-kweekinvoegsel per put van een 24-graden kweekplaat, met 100 microliter vers verdunde extracellulaire matrix per cultuur gedurende ten minste 30 minuten bij 37 graden Celsius. Wanneer de matrix is gestold, gebruik dan een transfer pipet om een explant over te brengen op elke insert, en de plaat onder de microscoop te verplaatsen.Met behulp van schone tangen, plaats de explants in het midden van elke insert om ervoor te zorgen dat ze niet zijn bevestigd aan de zijwanden, en voorzichtig verwijderen van eventuele extra PBS. Breng vervolgens de plaat met het deksel gesloten onder een laminaire stroom weefsel cultuur kap, en voeg 100 microliter van voorverwarmde complete medium aan elke insert, en 200 microliters aan de put onder elke insert. Voeg vervolgens 300 microliter PBS toe aan ongebruikte putten en plaats de plaat vijf dagen in de couveuse van de celcultuur.Voor VEGF-A behandeling op dag twee van de cultuur, verwijder het medium uit beide kamers van elke cultuur en voeg 100 microliter van PBS aan elke insert, en 200 microliter pbs aan elke put. Na het wervelen van de plaat een paar keer, vervang de PBS met 300 microliters van basaal medium aangevuld met 1% foetale runderserum om de culturen te starten, en de plaat terug te keren naar de couveuse. Voeg op dag drie na de honger 300 microliter verse basale medium plus serum toe aan de controleputten en het basale medium plus 50 nanogram per milliliter VEGF-A aan de behandelingsputten en breng de plaat terug naar de celkweek incubator.Op de zesde dag van de cultuur, was de kamers met PBS zoals aangetoond, en fix de culturen met 200 microliters van 4%paraformaldehyde in elke put, en 100 microliter fixatief in elke insert. Na 20 minuten bij 4 graden Celsius met schommelen, was de culturen met 300 microliters van PBS gedurende 10 minuten per wasbeurt met schommelen op kamertemperatuur. Voeg na de laatste wasbeurt 300 microliter primaire antilichaamoplossing toe aan de putten en wisselt voor een nachtcultuur bij vier graden Celsius met schommelen.De volgende ochtend, was de culturen 10 keer in niet-ionische oppervlakteactieve stoffen in PBS met schommelen, het veranderen van de wasoplossing om de 10 minuten voor het labelen van de culturen met 300 microliters van een geschikte fluorofofofore vervoegde secundaire antilichaam op vier graden Celsius 's nachts met schommelen. De volgende dag, was de culturen 10 keer in verse PBS met niet-ionische oppervlakteactieve stoffen zoals aangetoond. Gebruik na de laatste wasbeurt fijne tangen om het membraan zorgvuldig van elke wisselplaat te pellen en de membranen op afzonderlijke glazen microscoopdia's te plaatsen, de zijkant omhoog te verwijderen.Bedek de monsters met DAPI-aangevuld montagemedium in een afdeksel en verzegel de randen van de afdekking met duidelijke nagellak. Wanneer de nagellak is opgedroogd, beeld de dia's door confocale microscopie. Als de eerste SV cellen groeien op het hart ventrikel, ze stoppen met het produceren van veneuze markers zoals Coup-TF2.Na vijf dagen van cultuur, SV endotheelcellen ontspruiten en migreren op het membraan. Net als in het embryonale hart, coup-TF2 expressie wordt verminderd als de vaten migreren uit de buurt van de SV. Culturen gestimuleerd met VEGF-A vertonen een verhoogde groei van angiogene spruiten, zowel in dichtheid als lengte. Verdere SV culturen gestimuleerd door VEGF-A tonen een bijna drievoudige toename van de spruitlengte in vergelijking met controles, wat suggereert dat endoekjes van SV en endocardium reageren op VEGF-A.Het is belangrijk om het SV-weefsel niet te verliezen terwijl het hart en de longen worden uitgeruwd, de atria worden verwijderd en het aangrenzende weefsel rond de SV wordt gereinigd. Live imaging experimenten kunnen worden uitgevoerd om coronaire angiogenese te visualiseren en om de details van cellulaire en moleculaire dynamiek vast te leggen tijdens het proces. Deze techniek is uiterst nuttig voor het beoordelen van potentiële moleculaire mechanismen van coronaire angiogenese en als een modelsysteem voor het bestuderen van angiogenese in het algemeen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Kransslagader Ligatie en Intramyocardial Injectie in een muizenmodel van Infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

Een muis model van het hoornvlies Pocket Assay voor Angiogenese Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Multi-modale beeldvorming van angiogenese in een Naakt ratmodel van borstkanker botmetastase Met behulp van Magnetic Resonance Imaging, Volumetrische computertomografie en Echografie

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

Angiogenese in het ischemische Rat Lung

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Netvliesloslating Model in Knaagdieren door Subretinal Injectie van natriumhyaluronaat

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Echografie gebaseerde beoordeling van coronaire Flow en Coronaire Flow Reserve Met behulp van de druk overbelasting Model in Muizen

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Surgical Angiogenesis in Porcine Tibial Allotransplantation: A New Large Animal Bone Vascularized Composite Allotransplantation Model

Chirurgische angiogenese in varkens tibiale Allotransplantation: een nieuwe groot dier bot gevacuoliseerd composiet Allotransplantation Model

Segmental bone loss resulting from trauma, infection malignancy and congenital anomaly remains a major reconstructive challenge. Current therapeutic ...

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

Intravital microscopie van monocyt Homing en Tumor-gerelateerde angiogenese in een lymfkliertest Model van perifere arteriële ziekte

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrische Contractility meting van de muis mesenterische slagader met behulp van draad Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Beoordeling van therapeutische angiogenese in een Muriene model van Hindledemaat ischemie

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...