Name: in vitro model of coronary angiogenesis
Uploaded: 2020-03-10T13:00:00
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著者らは、支援的な研究環境を提供してくれたシャルマ研究所のメンバーに感謝する。私たちは、私たちのマウスのコロニーを維持し、世話をするダイアン(ディー)R.ホフマンに特別な感謝を拡張したいと思います。また、フィリップ・J・スマルディーノ博士とキャロリン・ヴァン博士が原稿を徹底的に校正し、有益なコメントを提供してくれたことに感謝します。この研究は、ボール州立大学プロボスト事務所と生物学部からB.S.、インディアナ科学アカデミーシニアリサーチ補助金のB.S、NIH(RO1-HL128503)、ニューヨーク幹細胞財団からK.R.への資金によって支えられました。

このプロトコルですべての動物の使用は、ボール州立大学の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)ガイドラインに従いました。
1. マウスブリーダーの確立と、時を取った妊娠のための膣プラグの検出
<ol><li>野生型の雄と雌のマウスでマウスの繁殖ケージを設定します。飼育マウスの年齢が6-8週間の間であることを確認してください。ペア(1雄と1メス)またはトリオ(1オスと2?...

<ol>
	<li>Red-Horse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells.">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sinus+venosus+contributes+to+coronary+vasculature+through+VEGFC-stimulated+angiogenesis.">The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis.</a> Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).</li><li>Volz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+are+progenitors+for+coronary+artery+smooth+muscle.">Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-C+and+aortic+cardiomyocytes+guide+coronary+artery+stem+development.">VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4899-4914 (2014).</li><li>Chang, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DACH1+stimulates+shear+stress-guided+endothelial+cell+migration+and+coronary+artery+growth+through+the+CXCL12-CXCR4+signaling+axis.">DACH1 stimulates shear stress-guided endothelial cell migration and coronary artery growth through the CXCL12-CXCR4 signaling axis.</a> Genes and Development. , (2017).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepicardial+endothelial+cells+invade+the+embryonic+ventricle+wall+to+form+coronary+arteries.">Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries.</a> Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+Cells+Form+the+Coronary+Arteries+by+Angiogenesis+through+Myocardial-Endocardial+VEGF+Signaling.">Endocardial Cells Form the Coronary Arteries by Angiogenesis through Myocardial-Endocardial VEGF Signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Katz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+compartments+of+the+proepicardial+organ+give+rise+to+coronary+vascular+endothelial+cells.">Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells.</a> Developmental Cell. 22 (3), 639-650 (2012).</li><li>Das, S., Red-Horse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+plasticity+in+cardiovascular+development+and+disease.">Cellular plasticity in cardiovascular development and disease.</a> Developmental Dynamics. 246 (4), 328-335 (2017).</li><li>Sharma, B., Chang, A., Red-Horse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+Artery+Development:+Progenitor+Cells+and+Differentiation+Pathways.">Coronary Artery Development: Progenitor Cells and Differentiation Pathways.</a> Annual Review of Physiology. 79, 1-19 (2017).</li><li>Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+origin+and+developmental+program+of+coronary+angiogenesis.">Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis.</a> Circulation Research. 116 (3), 515-530 (2015).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling.">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Gerhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+guides+angiogenic+sprouting+utilizing+endothelial+tip+cell+filopodia.">VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia.</a> Journal of Cell Biology. 161 (6), 1163-1177 (2003).</li><li>Ruhrberg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+restricted+patterning+cues+provided+by+heparin-binding+VEGF-A+control+blood+vessel+branching+morphogenesis.">Spatially restricted patterning cues provided by heparin-binding VEGF-A control blood vessel branching morphogenesis.</a> Genes and Development. 16 (20), 2684-2698 (2002).</li><li>Kikuchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antiangiogenic+isoform+of+VEGF-A+contributes+to+impaired+vascularization+in+peripheral+artery+disease.">An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease.</a> Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2002).</li><li>Folkman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+tumor+factor+responsible+for+angiogenesis.">Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 133 (2), 275-288 (1971).</li><li>Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+VEGF+in+the+regulation+of+physiological+and+pathological+angiogenesis.">The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis.</a> Experientia Supplementum. (94), 209-231 (2005).</li><li>Ferrara, N., Bunting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor,+a+specific+regulator+of+angiogenesis.">Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 5 (1), 35-44 (1996).</li><li>Sharma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Progenitor+Cells+Compensate+to+Rebuild+the+Coronary+Vasculature+in+Elabela-+and+Apj-Deficient+Hearts.">Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts.</a> Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).</li><li>Rhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+deletion+of+Ino80+disrupts+coronary+angiogenesis+and+causes+congenital+heart+disease.">Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease.</a> Nature Communications. 9 (1), 368 (2018).</li></ol>

SVおよび遠親組織から冠状血管を正常に成長させるための最も重要なステップのいくつかは次のとおりです: 1) SV培養のためのSV組織を正しく同定し、単離する;2)正確な遠心培養のためにe11-11.5の年齢の間の胚からの心室を使用する。3)解剖期間を通じて無菌状態を維持し、常に組織を冷たく保つ;4)培地に浮遊する組織を避けるために、ECM被覆膜に付着した外植体を維持する。
<p class="jove_conte...

心臓の血管は一般に冠状血管と呼ばれる。これらの血管は、動脈、静脈、および毛細血管で構成されています。開発中、高度に分岐した毛細血管が最初に確立され、その後、冠状動脈と静脈1、2、3、4、5に改造されます。これらの初期毛細血管は、プロエピカルジウム、静脈内静脈(SV)、および内心内膜(遠心内膜)組織1、6、7、8に見られる内皮前駆細胞から構築される。SVは胚性心臓の流入器官であり、心内腔の内層である。SVおよびEndoに見られる内皮前駆細胞は冠動脈脈管系の大部分を構築し、一方、プロエピカルジウムはその比較的小さな部分に寄与する2。冠状血管の毛細血管ネットワークが心臓に存在する前駆細胞から成長する過程を冠状血管新生と呼びます。冠動脈疾患は、世界的に主要な死因の1つであり、まだこの疾患に対する効果的な治療法は欠けている。冠状動脈形成の詳細な細胞および分子メカニズムを理解することは、損傷した冠状動脈を修復し再生するための新しい効果的な治療法を設計するのに役立ちます。
最近、新しいツールや技術の開発を通じて、冠状血管がどのように発達していくのか、私たちの理解が急増しています。特に、生体内系統標識および高度なイメージング技術は、冠状血管9、10、11、12の細胞起源および分化経路を明らかにする上で非常に有用であった。これらの in vivo ツールの利点にもかかわらず、速度、柔軟性、およびアクセシビリティの点では制限があります。したがって、堅牢なin vitroモデルシステムは、高スループットの方法で冠状血管新生の細胞および分子機構を解明するために生体内システムを補完することができる。
ここでは冠状血管新生のインビトロモデルについて述べる。SVと遠島の2つの前駆体組織から冠状血管を成長させるインビトロ外植培養システムを開発しました。このモデルを用いて、インビトロ組織外植培養物が成長培地によって刺激されると冠状血管芽を増殖することを示す。さらに、外植培養物は、血管内皮増殖因子A(VEGF-A)によって刺激された制御に比べて急速に成長し、非常に強力な血管新生タンパク質である。さらに、SV培養物からの血管新生芽は静脈脱分化(COUP-TFII発現の喪失)を受け、生体内のSV血管新生と同様のメカニズムであることがわかった。これらのデータは、インビトロ外植物培養システムが生体内で起こる血管新生事象を忠実に復活させることを示唆している。総称して、ここで説明する血管新生のインビトロモデルは、高スループットでアクセス可能な方法で冠状血管新生の細胞および分子機構を探査するのに理想的である。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 x 20 MM Tissue Culture Dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>877222</td>
			<td>Referred in the protocol as Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.0 uM PET membrane culture inserts</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MCEP24H48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A31572</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-rat 488</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled Metal Probe</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>10088-15</td>
			<td>Angled 45 degree, used for detecting deep plugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- ERG 1/2/3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab92513</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- VE-Cadherin antibody</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BDB550548</td>
			<td>Primary antibody, manufacturer BD BioSciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 gas tank</td>
			<td>Various suppliers</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13998223</td>
			<td>For 37 &#176;C, 5% CO2 incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereomicrosope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9i</td>
			<td>Leica S9i Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>Endothelial cell growth basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Commercially known as Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 MV Singlequots Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4147</td>
			<td>Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007003IR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FiJi</td>
			<td>NIH</td>
			<td>NA</td>
			<td>Image processing software (<a href="https://imagej.net/Fiji/Downloads" target="_blank">https://imagej.net/Fiji/Downloads</a>)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11412-11</td>
			<td>Used for embryo dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Straight-Blade operating scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-808-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH-302-5601LR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow tissue culture hood</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>various models available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Vectashield with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy/Fisher</td>
			<td>50-980-494</td>
			<td>This is available at 32%; needs to be diluted to 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated spoon</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>10370-18</td>
			<td>Useful in removing embryo/tissues from a solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine VEGF-A 165</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>450-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps, Dumont #5</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sure-Seal Mouse/Rat chamber</td>
			<td>Easysysteminc</td>
			<td>EZ-1785</td>
			<td>Euthanasia chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model of coronary angiogenesis

ここでは冠状血管新生を研究するためのインビトロ培養アッセイについて述べる。冠状血管は心臓の筋肉を養い、臨床的に重要です。これらの血管の欠陥は、アテローム性動脈硬化症などの深刻な健康上のリスクを表し、患者の心筋梗塞や心不全を引き起こす可能性があります。その結果、冠状動脈疾患は、世界中の主要な死因の1つである。臨床的に重要であるにもかかわらず、損傷した冠状動脈を再生する方法について比較的少し進歩が見られた。しかしながら、冠状血管の発達の細胞起源と分化経路の理解において最近の進歩が見られた。研究者が前駆細胞に蛍光標識し、その運命に従い、生体内の子孫を視覚化することを可能にするツールと技術の出現は、冠状血管の発達を理解するのに役立っています。インビボ研究は貴重ですが、実験設計における速度、アクセシビリティ、柔軟性の面で限界があります。あるいは、冠状動脈血管新生の正確なin vitroモデルは、これらの限界を回避し、研究者が速度と柔軟性を持つ重要な生物学的質問を尋問することを可能にする。適切なin vitroモデルシステムの欠如は、冠状血管の成長の細胞および分子機構の理解の進展を妨げている可能性があります。ここでは、冠状血管の多くが生じる2つの前駆体組織である静脈内静脈(SV)および心内膜(Endo)から冠状血管を成長させるインビトロ培養システムについて説明する。また、この文化が既知のin vivoメカニズムの一部を正確に再現していることも確認した。例えば、SV由来の培養中の血管新生は、生体内で観察されるものと同様のCOUP-TFII発現を下方制御することを示す。また、VEGF-Aは、生体内の血管新生因子として知られており、SV培養および遠東培養の両方から血管新生を強く刺激することを示す。全体として、冠状動脈血管新生を研究するための正確なインビトロ培養モデルを考案しました。

生体内のSV血管新生の最も顕著な特徴の1つは、特定の経路に従い、ステレオタイプの時間と位置1で起こる細胞脱分化および再分化事象を伴うことである。初期SV細胞が心室に成長するにつれて、それらはCOUP-TFIIのような静脈マーカーの産生を停止する(図7)。その後、冠状動脈芽は、心臓の表面または心筋内の深い2つの移動経路...

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In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

冠状血管新生のインビトロモデルは、冠状血管新生の細胞および分子機構の発見に利用することができる。静脈内および心内膜組織のインビトロ外植培養はVEGF-Aに応答して強固な成長を示し、in vivoと同様のCOUP-TFII発現パターンを示す。

冠動脈血管新生のインビトロモデル

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

私たちのプロトコルは、研究者が生物の外で冠状動脈性血管新生の分子メカニズムを調査することを可能にするので、重要です。この技術の主な利点は、生物内部の冠状動脈血管新生のプロセスを正確にモデル化し、冠状動脈血管新生のメカニズムの研究を促進することです。胚性11.5日目の胚を70%エタノールで運ぶ妊娠中のマウスをスプレーすることから始めます。鉗子で腹の上に皮膚を持ち上げ、腹部の皮膚を作るためにはさみを使用し、腹膜切開を横隔膜まで前眼的に子宮の角を露出させる。子宮をつかみ、ティッシュを自由に切り、子宮の角を引き出す。胚のストリングをステレオ顕微鏡下の氷冷滅菌PBSに入れ、各胚から子宮筋、黄身嚢、羊膜カバーを剥がします。各胚が単離されると、穿張スプーンを使用して、氷の上に滅菌PBSを含む新しいペトリ皿に組織を移します。胚性心臓組織を収穫するには、顕微鏡下で新しいペトリ皿に解剖される最初の胚を移し、胚を腹側に上に置く。細かい鉗子を使用して、胸部の小さな切開を作り、横隔膜のわずかに上に、そして切開に閉じた鉗子を挿入して切開を拡大する。胸壁を開けて胸壁を開いたままにして胸壁を開いたままにし、2番目の鉗子を使用して心臓を90度前に静かに動かして、背中大根と静脈を露出させます。次に、心臓の基部でこれらの血管をつかみ、慎重に心臓と肺を前から引き出し、冷たいPBSで組織をすすいだ。すべての心臓組織が採取されたら、心臓サンプルを顕微鏡の下に置き、各心臓から肺葉を取り除きます。最初の心臓を後側に向け、心臓を基に保持し、細かい鉗子を使用して、心臓からSVを取り囲む隣接する組織の左右の心房を削ります。SVを分離するには、心臓の後側を上方向に向ける。慎重に心臓からSVを除去し、氷の上に氷冷滅菌PBSを含む新しい6センチメートルペトリ皿に単離された組織を配置するために滅菌伝達ピペットを使用しています。心室全体を分離するには、流出管を取り除き、新しい無菌移動ピペットを使用して、氷の上に氷冷滅菌PBSを含む別の6センチメートルのペトリ皿に心室を置きます。SVと心室全体の培養を設定するには、まず24ウェル培養プレートのウェルあたり1つの8マイクロメートルの孔PET培養インサートの膜をコーティングし、培養1回あたり100マイクロリットルの細胞外マトリックスを37°Cで少なくとも30分間コーティングします。マトリックスが固まったら、移管ピペットを使用して各挿入物に1つの外植物を移し、顕微鏡下でプレートを移動させます。きれいな鉗子を使用して、各インサートの中央に外植を置いて、それらが側壁に取り付けられていないことを確認し、余分なPBSを慎重に取り除きます。次に、蓋を層流組織培養フードの下に閉じた状態でプレートを移し、各挿入物に100マイクロリットルの事前温め完了培地を加え、各挿入物の下のウェルに200マイクロリットルを加えます。その後、未使用のウェルに300マイクロリットルのPBSを加え、5日間細胞培養インキュベーターにプレートを入れる。培養2日目のVEGF-A処理では、各培養の両チャンバーから培地を取り出し、各インサートに100マイクロリットルのPBSを加え、各ウェルに200マイクロリットルのPBSを加えます。プレートを数回旋回した後、PBSを1%の牛血清を補充した基底培地の300マイクロリットルに置き換えて培養を開始し、プレートをインキュベーターに戻します。飢餓後3日目に、コントロールウェルと基底培地に300マイクロリットルの新鮮な基底培地と血清を加え、VEGF-Aのミリリットル当たり50ナノグラムを処理井戸に加え、プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。培養の6日目に、示されているようにPBSでチャンバーを洗浄し、各ウェルに200マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒド、各インサートに100マイクロリットルの固定液で培養液を固定します。ロッキングで摂氏4度で20分後、室温で揺れ動かして1回10分間PBSの300マイクロリットルで培養物を洗います。最後の洗浄の後、300マイクロリットルの一次抗体溶液を井戸に加え、ロッキングで摂氏4度で一晩培養します。翌朝、PBSの非イオン性界面活性剤で培養物を10回洗浄し、10分ごとに洗浄液を交換してから、適切なフルオロフォア共役抗体を一晩で4°Cで2次抗体を結合させた300マイクロリットルで培養液を変化させる。翌日、示すように非イオン性界面活性剤で新鮮なPBSで培養を10回洗浄する。最後の洗浄後、細かい鉗子を使用して各インサートから膜を慎重に剥がし、膜を個々のガラス顕微鏡スライド上に置き、側面を外植します。カバースリップでDAPI補土媒体でサンプルを覆い、カバースリップの端を透明なマニキュアで密封します。マニキュアが乾燥したら、共焦点顕微鏡でスライドを画像化します。最初のSV細胞が心臓心室に成長するにつれて、彼らはCoup-TF2のような静脈マーカーの産生を停止する。5日間培養した後、SV内皮細胞が芽を出し、膜上に移動する。胚性心臓と同様に、クープTF2発現は、血管がSVから離れて移動するにつれて減少する。VEGF-Aで刺激された培養物は、密度および長さの両方で血管新生芽の増加の成長を示す。さらに、VEGF-Aによって刺激されたSV培養物は、コントロールと比較して芽長がほぼ3倍に増加することを示し、SVおよび内心からの内皮芽がVEGF-Aに応答することを示唆している。心臓と肺を引き出し、心房を取り除き、SVを取り巻く隣接する組織を洗浄しながらSV組織を失わないことが重要である。ライブイメージング実験を行い、冠状動脈血管新生を可視化し、その過程で細胞および分子動力学の詳細を捉えることができます。冠状血管新生の潜在的な分子機構を評価する場合や、血管新生全般を研究するためのモデルシステムとして、この技術は極めて有用である。

Research

JoVE Journal

Medicine

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

心筋梗塞のマウスモデルにおける冠動脈結紮および心筋内注入

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

血管新生研究のための角膜ポケットアッセイのマウスモデル

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

磁気共鳴イメージング、体積CT画像と超音波を用いた乳がんの骨転移のヌードラットモデルにおける血管新生のマルチモーダルイメージング

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

虚血ラットの肺の血管新生

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

ヒアルロン酸ナトリウムの網膜下注入によるげっ歯類における網膜剥離モデル

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

マウスの圧負荷モデルを用いた冠動脈の流れと冠血流準備の超音波ベースのアセスメント

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Surgical Angiogenesis in Porcine Tibial Allotransplantation: A New Large Animal Bone Vascularized Composite Allotransplantation Model

豚脛骨移植外科的血管新生: 新しい大型動物の骨血管複合移植モデル

Segmental bone loss resulting from trauma, infection malignancy and congenital anomaly remains a major reconstructive challenge. Current therapeutic ...

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

単球のホーミングと末梢動脈疾患のマウスモデルにおける腫瘍関連血管新生の生体顕微鏡

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

ワイヤー図法を使用してマウスの腸間膜動脈の等尺性収縮力測定

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

ヒンドリム虚血のマウスモデルにおける治療血管新生の評価

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...