Name: in vitro model of coronary angiogenesis
Uploaded: 2020-03-10T13:00:00
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저자는 지원 연구 환경을 제공 샤르마 연구소의 구성원에게 감사드립니다. 우리는 우리의 마우스 식민지를 유지하고 돌보는 다이앤 (디) R. 호프만에게 특별한 감사를 전하고 싶습니다. 우리는 또한 철저하게 원고를 교정하고 유용한 의견을 제공 필립 J. 스말디노 박사와 캐롤린 반 감사드립니다. 이 작품은 볼 스테이트 대학 프로보스트 사무실과 생물학학과에서 B.S에, 과학 수석 연구 보조금 기금 B.S에 인디애나 아카데미, NIH (RO1-HL128503) 및 뉴욕 줄기 세포 재단 기금K.R.

이 프로토콜에 있는 모든 동물의 사용은 볼 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 지침을 따랐습니다.
1. 시간 적정 임신을위한 마우스 브리더 를 구축하고 질 플러그를 감지
<ol><li>야생형 수컷 과 암컷 마우스로 마우스 사육 케이지를 설치한다. 사육 마우스의 나이가 6-8 주 사이인지 확인하십시오. 한 쌍 (1 남성과 1 암컷) 또는 번식을위한 트리오 (1 남성과 2 여성)로...

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	<li>Red-Horse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells.">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sinus+venosus+contributes+to+coronary+vasculature+through+VEGFC-stimulated+angiogenesis.">The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis.</a> Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).</li><li>Volz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+are+progenitors+for+coronary+artery+smooth+muscle.">Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-C+and+aortic+cardiomyocytes+guide+coronary+artery+stem+development.">VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4899-4914 (2014).</li><li>Chang, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DACH1+stimulates+shear+stress-guided+endothelial+cell+migration+and+coronary+artery+growth+through+the+CXCL12-CXCR4+signaling+axis.">DACH1 stimulates shear stress-guided endothelial cell migration and coronary artery growth through the CXCL12-CXCR4 signaling axis.</a> Genes and Development. , (2017).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepicardial+endothelial+cells+invade+the+embryonic+ventricle+wall+to+form+coronary+arteries.">Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries.</a> Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+Cells+Form+the+Coronary+Arteries+by+Angiogenesis+through+Myocardial-Endocardial+VEGF+Signaling.">Endocardial Cells Form the Coronary Arteries by Angiogenesis through Myocardial-Endocardial VEGF Signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Katz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+compartments+of+the+proepicardial+organ+give+rise+to+coronary+vascular+endothelial+cells.">Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells.</a> Developmental Cell. 22 (3), 639-650 (2012).</li><li>Das, S., Red-Horse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+plasticity+in+cardiovascular+development+and+disease.">Cellular plasticity in cardiovascular development and disease.</a> Developmental Dynamics. 246 (4), 328-335 (2017).</li><li>Sharma, B., Chang, A., Red-Horse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+Artery+Development:+Progenitor+Cells+and+Differentiation+Pathways.">Coronary Artery Development: Progenitor Cells and Differentiation Pathways.</a> Annual Review of Physiology. 79, 1-19 (2017).</li><li>Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+origin+and+developmental+program+of+coronary+angiogenesis.">Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis.</a> Circulation Research. 116 (3), 515-530 (2015).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling.">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Gerhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+guides+angiogenic+sprouting+utilizing+endothelial+tip+cell+filopodia.">VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia.</a> Journal of Cell Biology. 161 (6), 1163-1177 (2003).</li><li>Ruhrberg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+restricted+patterning+cues+provided+by+heparin-binding+VEGF-A+control+blood+vessel+branching+morphogenesis.">Spatially restricted patterning cues provided by heparin-binding VEGF-A control blood vessel branching morphogenesis.</a> Genes and Development. 16 (20), 2684-2698 (2002).</li><li>Kikuchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antiangiogenic+isoform+of+VEGF-A+contributes+to+impaired+vascularization+in+peripheral+artery+disease.">An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease.</a> Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2002).</li><li>Folkman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+tumor+factor+responsible+for+angiogenesis.">Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 133 (2), 275-288 (1971).</li><li>Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+VEGF+in+the+regulation+of+physiological+and+pathological+angiogenesis.">The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis.</a> Experientia Supplementum. (94), 209-231 (2005).</li><li>Ferrara, N., Bunting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor,+a+specific+regulator+of+angiogenesis.">Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 5 (1), 35-44 (1996).</li><li>Sharma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Progenitor+Cells+Compensate+to+Rebuild+the+Coronary+Vasculature+in+Elabela-+and+Apj-Deficient+Hearts.">Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts.</a> Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).</li><li>Rhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+deletion+of+Ino80+disrupts+coronary+angiogenesis+and+causes+congenital+heart+disease.">Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease.</a> Nature Communications. 9 (1), 368 (2018).</li></ol>

SV 및 엔도 전구 조직으로부터 관상 동맥 혈관을 성공적으로 성장시키는 가장 중요한 단계 중 일부는 다음과 같습니다: 1) SV 배양을 위한 SV 조직을 올바르게 식별하고 격리하는 단계; 2) 정확한 엔도 배양을 위해 e11-11.5의 나이 사이의 배아로부터의 심실을 사용하는 단계; 3) 해부 기간 내내 멸균 상태를 유지하고 조직을 항상 차갑게 유지; 및 4) 배지에 부동하는 조직을 피하기 위해 ECM 코팅 막에 부?...

심혼의 혈관은 일반적으로 관상 동맥 혈관에게 불립니다. 이 혈관은 동맥, 정맥 및 모세 혈관으로 구성됩니다. 개발 하는 동안, 높은 분기 모 세 혈관 먼저 설립, 관상 동맥과 정 맥으로 리모델링1,2,3,4,5. 이들 초기 모세혈관은 내피카슘, 부비동(SV) 및 내막부(Endo) 조직1,6,7,8에서발견되는 내피전구 세포로부터 구축된다. SV는 배아 심장의 유입 기관이며 엔도는 심장 루멘의 내벽입니다. SV 및 엔도에서 발견되는 내피 전구 세포는 관상 동맥 혈관구조의 대부분을 구축하는 반면, 프로피카슘은 그것의 상대적으로 작은 부분에기여한다 2. 관상 동맥 혈관의 모세관 네트워크가 기존의 전구체 세포에서 심장에서 성장하는 과정을 관상 동맥 혈관 신생이라고합니다. 관상 동맥 질환은 전 세계적으로 사망의 주요 원인 중 하나이며이 질병에 대한 효과적인 치료법이 부족합니다. 관상 동맥 혈관 신생의 상세한 세포 및 분자 메커니즘을 이해하는 것은 손상된 관상 동맥을 복구하고 재생하는 새롭고 효과적인 치료법을 설계하는 데 유용 할 수 있습니다.
최근에는 관상 동맥 선박이 어떻게 개발되는지에 대한 이해가 급증하면서 새로운 도구와 기술의 개발을 통해 부분적으로 달성되었습니다. 특히, 생체내 계보 라벨링 및 첨단 영상 기술은 관상동맥 혈관의 세포 기원 및 분화 경로를 밝히는 데 매우 유용하여9,10,11,12. 이러한 생체 내 도구의 장점에도 불구하고 속도, 유연성 및 접근성 측면에서 는 한계가 있습니다. 따라서, 견고한 시험관 내 모델 시스템은 생체 내 시스템을 보완하여 관상 동맥 혈관신생의 세포 및 분자 메커니즘을 높은 처리량 방식으로 해명할 수 있다.
여기서, 우리는 관상 동맥 혈관신생의 시험관내 모델을 기술한다. 우리는 두 개의 전구 조직, SV 및 엔도에서 관상 동맥 혈관을 성장하는 시험관 내 배양 시스템을 개발했습니다. 이 모델을 통해, 우리는 시험관 내 조직 배양 배양이 성장 배지에 의해 자극될 때 관상 동맥 혈관 새싹을 성장한다는 것을 보여준다. 추가적으로, 배양 배양은 혈관 내피 성장 인자 A(VEGF-A)에 의해 자극될 때 대조군과 비교하여 급속히 성장하며, 매우 강력한 혈관신생 단백질이다. 더욱이, 우리는 SV 배양으로부터의 혈관신생 싹이 생체내SV 혈관신생과 유사한 기전인 정맥탈분화(COUP-TFII 발현의 손실)를 겪는다는 것을 발견하. 이러한 데이터는 시험관 내 배원 배양 시스템이 생체 내에서 발생하는 혈관신생 사건을 충실하게 회복한다는 것을 시사한다. 집합적으로, 여기에 기술되는 혈관신생의 시험관내 모델은 높은 처리량 및 접근 가능한 방식으로 관상 동맥 혈관신생의 세포 및 분자 기전을 조사하는 데 이상적입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 x 20 MM Tissue Culture Dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>877222</td>
			<td>Referred in the protocol as Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.0 uM PET membrane culture inserts</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MCEP24H48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A31572</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-rat 488</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled Metal Probe</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>10088-15</td>
			<td>Angled 45 degree, used for detecting deep plugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- ERG 1/2/3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab92513</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- VE-Cadherin antibody</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BDB550548</td>
			<td>Primary antibody, manufacturer BD BioSciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 gas tank</td>
			<td>Various suppliers</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13998223</td>
			<td>For 37 &#176;C, 5% CO2 incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereomicrosope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9i</td>
			<td>Leica S9i Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>Endothelial cell growth basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Commercially known as Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 MV Singlequots Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4147</td>
			<td>Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007003IR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FiJi</td>
			<td>NIH</td>
			<td>NA</td>
			<td>Image processing software (<a href="https://imagej.net/Fiji/Downloads" target="_blank">https://imagej.net/Fiji/Downloads</a>)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11412-11</td>
			<td>Used for embryo dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Straight-Blade operating scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-808-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH-302-5601LR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow tissue culture hood</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>various models available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Vectashield with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy/Fisher</td>
			<td>50-980-494</td>
			<td>This is available at 32%; needs to be diluted to 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated spoon</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>10370-18</td>
			<td>Useful in removing embryo/tissues from a solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine VEGF-A 165</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>450-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps, Dumont #5</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sure-Seal Mouse/Rat chamber</td>
			<td>Easysysteminc</td>
			<td>EZ-1785</td>
			<td>Euthanasia chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model of coronary angiogenesis

여기서, 우리는 관상 동맥 혈관신생을 연구하기 위한 시험관 내 배양 분석방법을 기술한다. 관상 동맥 혈관은 심장 근육을 공급하고 임상적으로 중요합니다. 이 혈관에 있는 결점은 환자에 있는 심근 경색 그리고 심부전으로 이끌어 낼 수 있는 동맥 경화증과 같은 가혹한 건강 리스크를 나타냅니다. 따라서 관상 동맥 질환은 전 세계적으로 사망의 주요 원인 중 하나입니다. 그것의 임상 중요성에도 불구 하 고, 상대적으로 작은 진전 손상 된 관상 동맥을 재생 하는 방법에 만들어졌다. 그럼에도 불구하고, 최근 관상동맥 혈관 발달의 세포 기원 및 분화 경로를 이해하는 데 진전이 이루어지고 있다. 연구원이 형광성으로 선조 세포에 라벨을 붙이고, 그들의 운명을 따르고, 생체 내에서 자손을 시각화 할 수있는 도구와 기술의 출현은 관상 동맥 혈관 발달을 이해하는 데 중요한 역할을했습니다. 생체 내 연구는 가치가 있지만 실험 설계의 속도, 접근성 및 유연성 측면에서 한계가 있습니다. 양자택일로, 관상 동맥 혈관 신생의 정확한 시험관 내 모형은 이 한계를 우회하고 연구원이 속도와 융통성 있는 중요한 생물학 질문을 심문하는 것을 허용할 수 있습니다. 적절한 시험관 내 모델 시스템의 부족은 관상 동맥 혈관 성장의 세포 및 분자 메커니즘을 이해하는 진행을 방해 할 수있다. 여기서, 우리는 많은 관상 동맥이 발생하는 부비동(SV) 및 심내막(Endo)으로부터 관상동맥 혈관을 성장시키는 체외 배양 시스템을 설명한다. 우리는 또한 문화가 정확하게 생체 내 메커니즘의 일부를 재현 것을 확인했다. 예를 들어, 우리는 SV다운조절 COUP-TFII 발현으로부터의 배양물에서 혈관신생 콩싹이 생체내에서 관찰되는 것과 유사하다는 것을 보여준다. 또한 생체 내에서 잘 알려진 혈관 신생 인자 인 VEGF-A가 SV 및 엔도 문화 모두에서 혈관 신생을 강력하게 자극한다는 것을 보여줍니다. 종합적으로, 우리는 관상 동맥 혈관 신생을 공부하기 위하여 시험관 내 배양 모형을 고안했습니다.

생체 내에서 SV 혈관신생의 가장 눈에 띄는 특징 중 하나는 특정 경로를 따르고 고정관상 정적인 시간 및 위치1에서발생하는 세포 탈분화 및 재분화 이벤트를 수반한다는 것이다. 초기 SV 세포가 심실로 성장함에 따라 COUP-TFII(그림 7)와같은 정맥 마커 생성을 중단합니다. 그 후, 관상 동맥 새싹은 심근 의 표면 또는 심근 깊은 두 개의 ...

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In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

관상 동맥 혈관신생의 시험관내 모델은 관상 동맥 혈관신생의 세포 및 분자 기전의 발견을 위해 이용될 수 있다. 부비동 및 심내막 조직의 체외 배원 배양은 VEGF-A에 반응하여 견고한 성장을 나타내고 생체 내에서와 같이 COUP-TFII 발현의 유사한 패턴을 표시한다.

관상 동맥 혈관 신생의 체외 모델

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

우리의 프로토콜은 연구원이 유기체 의 외부 관상 동맥 혈관 신생의 분자 메커니즘을 조사 할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 관상 동맥 혈관 신생 의 메커니즘의 연구를 용이하게, 유기체 내부 관상 동맥 혈관 신생의 과정을 정확하게 모델링한다는 것입니다. 먼저 배아의 날 11.5배의 배아를 70%로 운반하는 임신한 마우스를 살포하여 시작합니다.집게로 배 위로 피부를 들어 올리고, 가위를 사용하여 복부 피부와 복막 절개를 횡격막까지 앞쪽으로 만들어 자궁 경적을 노출시합니다. 자궁을 잡고, 조직을 자유롭게 자르고 자궁 경적을 꺼냅니다. 배아의 끈을 스테레오 현미경으로 얼음 차가운 멸균 PBS에 넣고 각 배아에서 자궁 근육, 노른자 낭 및 양막 덮개를 벗깁니다.각 배아가 고립되면 천공 숟가락을 사용하여 조직을 얼음에 멸균 PBS가 함유된 새로운 페트리 접시로 옮기습니다. 배아 심장 조직을 수확하기 위해, 현미경의 밑에 새로운 Petri 접시로 해부되는 첫번째 태아를 전송하고, 복부 측에 태아를 놓습니다. 미세 한 집게를 사용하여 가슴에 작은 절개를 하고 다이어프램 위에 약간 부착하고 닫힌 포셉을 절개에 삽입하여 절개를 확대합니다.집게를 사용하여 가슴 벽을 열어 심장과 폐를 노출시키고, 두 번째 한 쌍의 집게를 사용하여 심장을 앞쪽으로 90도 움직여 등쪽 대오르타와 정맥을 노출시합니다. 그런 다음, 심장의 기지에서이 혈관을 잡고, 조심스럽게 심장과 폐를 앞쪽으로 끌어 내어 차가운 PBS로 조직을 헹구는다. 모든 심장 조직이 수확되면 심장 샘플을 현미경 아래에 놓고 각 심장에서 폐 엽을 제거하십시오.등쪽 의 첫 번째 심장을 방향을 지정하고, 심장을 바닥에 잡고, 심장에서 SV를 둘러싼 인접한 조직에서 왼쪽과 오른쪽 아리아를 긁어 미세 한 집게를 사용합니다. SV를 분리하려면 심장 등쪽을 위로 향하게 합니다. 조심스럽게 심혼에서 SV를 제거하고 멸균 전달 파이펫을 사용하여 격리 된 조직을 얼음에 차가운 멸균 PBS가 함유 된 새로운 6 센티미터 페트리 접시에 넣습니다.전체 심실을 분리하려면 유출관을 제거하고 새로운 멸균 이송 파이펫을 사용하여 얼음 에 얼음 냉멸 균 PBS가 들어있는 별도의 6센티미터 페트리 접시에 심실을 배치합니다. SV와 전체 심실 배양을 설정하려면 먼저 24개의 웰 배양 판당 8마이크로미터 모공 PET 배양 삽입물의 멤브레인을 코팅하고, 문화당 100마이크로리터가 섭씨 37도에서 최소 30분 동안 배양당 100마이크로리터를 넣습니다. 매트릭스가 고화되면, 전송 파이펫을 사용하여 각 삽입에 각 각 파기를 전송하고 현미경으로 플레이트를 이동합니다.깨끗한 집게를 사용하여 각 삽입의 중앙에 이클을 배치하여 측면 벽에 부착되지 않았는지 확인하고 추가 PBS를 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 라미나르 유동 조직 배양 후드 하에서 뚜껑을 닫은 채 플레이트를 옮기고, 각 삽입에 미리 따뜻워진 완전 배지 100마이크로리터와 각 삽입물 아래에 200마이크로리터를 첨가한다. 그런 다음 사용되지 않는 우물에 PBS 300 마이크로리터를 추가하고 5 일 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 넣습니다.문화의 둘째 날에 VEGF-A 치료의 경우, 각 배양의 양 챔버에서 배지를 제거하고 각 삽입에 PBS의 100 마이크로 리터를 추가하고, 각 우물에 PBS의 마이크로 리터 200 마이크로 리터를 추가합니다. 플레이트를 몇 번 소용돌이치고, PBS를 1%의 태아 소 세럼으로 보충한 기저 배지 300마이크로리터로 교체하여 배양을 시작하고 접시를 인큐베이터로 되돌리십시오. 기아 후 3일째에는 VEGF-A밀리리터당 50나노그램을 대조유우물및 기초배지에 신선한 기저형 배지 플러스 세럼 300마이크로리터를 첨가하고, 플레이트를 세포 배양 배양기로 반납한다.문화의 여섯 번째 날에는 PBS로 챔버를 세척하고 각 우물에 4 %의 파라 포름 알데히드의 200 마이크로 리터와 각 삽입에 고정 100 마이크로 리터로 문화를 수정합니다. 섭씨 4도에서 20분 후, 실온에서 흔들리며 세척당 10분 동안 PBS 300 마이크로리터로 배양을 씻으실 수 있습니다. 마지막 세척 후, 우물에 1 차 적인 항체 용액의 300 마이크로 리터를 추가하고 흔들로 섭씨 4도에서 하룻밤 문화를 삽입합니다.다음날 아침, PBS의 비이온 계면활성제에서 10회 세척하여 10분마다 세척용액을 변경한 후 적절한 플루오로퍼리 공주 2차 항체300마이크로리터로 10분마다 흔들고 있다. 다음 날, 시연된 바와 같이 비이온 계면활성제로 신선한 PBS로 문화를 10회 세척합니다. 마지막 세척 후, 미세 한 집게를 사용하여 각 삽입에서 멤브레인을 조심스럽게 껍질을 벗기고 멤브레인을 개별 유리 현미경 슬라이드에 놓고 옆으로 식히십시오.뚜껑 슬립에 DAPI 보충 장착 매체로 샘플을 덮고 뚜껑 전표의 가장자리를 명확한 매니큐어로 밀봉합니다. 매니큐어가 건조되면 공초점 현미경 검사법에 의해 슬라이드를 이미지합니다. 초기 SV 세포가 심장 심실로 성장함에 따라 Coup-TF2와 같은 정맥 마커 생성을 중단합니다.배양 5일 후, SV 내피 세포가 싹트고 막으로 이동합니다. 배아 심혼에서와 같이, 혈관이 SV에서 멀리 이동함에 따라 Coup-TF2 발현이 감소된다. VEGF-A로 자극 하는 배양 밀도 와 길이 모두에서 혈관 형성 콩나물의 증가 성장을 전시. VEGF-A에 의해 자극된 추가 SV 배양은 대조군에 비해 새싹 길이가 거의 3배 증가하는 것을 보여주며, 이는 SV와 내피칸티움의 내피 새싹이 VEGF-A에 반응한다는 것을 시사한다.심장과 폐를 꺼내고, 아리아를 제거하고, SV를 둘러싼 인접 조직을 청소하면서 SV 조직을 잃지 않는 것이 중요합니다. 살아있는 화상 진찰 실험은 관상 동맥 혈관 신생을 시각화하고 프로세스 도중 세포 및 분자 역학의 세부 사항을 포착하기 위하여 수행될 수 있습니다. 이 기술은 관상 동맥 혈관 신생의 잠재적인 분자 메커니즘을 평가하고 일반적으로 혈관 신생을 연구하기위한 모델 시스템으로 매우 유용합니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

경색의 Murine 모델에서 관상 동맥 내고과 Intramyocardial 사출

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

연구

의학

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

Angiogenesis 연구에 대한 각막 포켓 분석의 마우스 모델

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

자기 공명 영상, 체적 계산의 Tomography 및 초음파를 이용한 유방암의 뼈 전이의 누드 쥐 모델에서 Angiogenesis의 멀티 모달 이미징

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

허혈성 쥐 폐의 혈관 신생

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

나트륨 히알루 론산의 망막 주사 설치류에있는 망막 박리 모델

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

마우스의 압력 과부하 모델을 사용하여 관상 동맥 흐름 및 관상 동맥 흐름 준비 제도 이사회의 초음파를 바탕으로 평가

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Surgical Angiogenesis in Porcine Tibial Allotransplantation: A New Large Animal Bone Vascularized Composite Allotransplantation Model

돼지 Tibial Allotransplantation 외과 신생: 새로운 큰 동물 뼈 나가도록 복합 Allotransplantation 모델

Segmental bone loss resulting from trauma, infection malignancy and congenital anomaly remains a major reconstructive challenge. Current therapeutic ...

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

Intravital 현미경 Monocyte 유도 및 주변 동맥 질병의 Murine 모델에서 종양 관련 신생의

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Myography 와이어를 사용 하 여 마우스 Mesenteric 동맥의 isometric 수축 측정

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

힌들보 리 허 혈의 뮤린 모델에서 치료 혈관 신생 평가

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...