Name: in vitro model of coronary angiogenesis
Uploaded: 2020-03-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Coronary Angiogenesis at JoVE.com

Forfatterne takker medlemmene av Sharma-laboratoriet for å gi et støttende forskningsmiljø. Vi liker å utvide spesiell takk til Diane (Dee) R. Hoffman som opprettholder og bryr seg om vår musekoloni. Vi vil også takke Drs. Philip J. Smaldino og Carolyn Vann for grundig korrekturlesing av manuskriptet og gi nyttige kommentarer. Dette arbeidet ble støttet av midler fra Ball State University Provost Office og Department of Biology til B.S, Indiana Academy of Sciences Senior Research Grant midler til B, og NIH (RO1-HL128503) og The New York Stem Cell Foundation midler til K.R.

Bruk av alle dyrene i denne protokollen fulgte Ball State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) retningslinjer.
1. Etablere mus oppdrettere og oppdage vaginal plugger for tidsbestemt graviditeter
<ol><li>Sett opp et museavlbur med villtype hann- og hunnmus. Sørg for at alderen på avlsmusene er mellom 6-8 uker. Sett opp enten et par (1 mann og 1 kvinne) eller som en trio (1 mann og 2 kvinne) for avl.</li>
	<li>Se etter en vaginal plugg neste morgen. Bruk en vinklet ...

<ol>
	<li>Red-Horse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells.">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sinus+venosus+contributes+to+coronary+vasculature+through+VEGFC-stimulated+angiogenesis.">The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis.</a> Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).</li><li>Volz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+are+progenitors+for+coronary+artery+smooth+muscle.">Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-C+and+aortic+cardiomyocytes+guide+coronary+artery+stem+development.">VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4899-4914 (2014).</li><li>Chang, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DACH1+stimulates+shear+stress-guided+endothelial+cell+migration+and+coronary+artery+growth+through+the+CXCL12-CXCR4+signaling+axis.">DACH1 stimulates shear stress-guided endothelial cell migration and coronary artery growth through the CXCL12-CXCR4 signaling axis.</a> Genes and Development. , (2017).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepicardial+endothelial+cells+invade+the+embryonic+ventricle+wall+to+form+coronary+arteries.">Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries.</a> Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+Cells+Form+the+Coronary+Arteries+by+Angiogenesis+through+Myocardial-Endocardial+VEGF+Signaling.">Endocardial Cells Form the Coronary Arteries by Angiogenesis through Myocardial-Endocardial VEGF Signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Katz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+compartments+of+the+proepicardial+organ+give+rise+to+coronary+vascular+endothelial+cells.">Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells.</a> Developmental Cell. 22 (3), 639-650 (2012).</li><li>Das, S., Red-Horse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+plasticity+in+cardiovascular+development+and+disease.">Cellular plasticity in cardiovascular development and disease.</a> Developmental Dynamics. 246 (4), 328-335 (2017).</li><li>Sharma, B., Chang, A., Red-Horse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+Artery+Development:+Progenitor+Cells+and+Differentiation+Pathways.">Coronary Artery Development: Progenitor Cells and Differentiation Pathways.</a> Annual Review of Physiology. 79, 1-19 (2017).</li><li>Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+origin+and+developmental+program+of+coronary+angiogenesis.">Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis.</a> Circulation Research. 116 (3), 515-530 (2015).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling.">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Gerhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+guides+angiogenic+sprouting+utilizing+endothelial+tip+cell+filopodia.">VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia.</a> Journal of Cell Biology. 161 (6), 1163-1177 (2003).</li><li>Ruhrberg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+restricted+patterning+cues+provided+by+heparin-binding+VEGF-A+control+blood+vessel+branching+morphogenesis.">Spatially restricted patterning cues provided by heparin-binding VEGF-A control blood vessel branching morphogenesis.</a> Genes and Development. 16 (20), 2684-2698 (2002).</li><li>Kikuchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antiangiogenic+isoform+of+VEGF-A+contributes+to+impaired+vascularization+in+peripheral+artery+disease.">An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease.</a> Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2002).</li><li>Folkman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+tumor+factor+responsible+for+angiogenesis.">Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 133 (2), 275-288 (1971).</li><li>Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+VEGF+in+the+regulation+of+physiological+and+pathological+angiogenesis.">The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis.</a> Experientia Supplementum. (94), 209-231 (2005).</li><li>Ferrara, N., Bunting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor,+a+specific+regulator+of+angiogenesis.">Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 5 (1), 35-44 (1996).</li><li>Sharma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Progenitor+Cells+Compensate+to+Rebuild+the+Coronary+Vasculature+in+Elabela-+and+Apj-Deficient+Hearts.">Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts.</a> Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).</li><li>Rhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+deletion+of+Ino80+disrupts+coronary+angiogenesis+and+causes+congenital+heart+disease.">Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease.</a> Nature Communications. 9 (1), 368 (2018).</li></ol>

Noen av de mest kritiske trinnene for vellykket voksende koronarfartøy fra SV og Endo stamcellevev er: 1) Korrekt identifisering og isolere SV-vevet for SV-kultur; 2) ved hjelp av ventrikler fra embryoer mellom e11-11,5 år for nøyaktig Endo kultur; 3) opprettholde sterile forhold gjennom disseksjonsperioden og holde vevet kaldt til enhver tid; og 4) holde explants festet til ECM belagt membran for å unngå vev flyter i mediet.
For det første kan isolasjon av SV-vev være utfordrende. Det ...

Blodkar i hjertet kalles ofte koronarkar. Disse fartøyene består av arterier, årer og kapillærer. Under utvikling, svært forgrenede kapillærer er etablert først, som deretter ombygge til koronararterier og årer1,2,3,4,5. Disse første kapillærene er bygget av endotelstamceller som finnes i proepikardiet, sinus venosus (SV) og endokardiet (Endo) vev1,6,7,8. SV er tilsigsorganet av embryonisk hjerte og Endo er den indre foringen av hjertelumen. Endotelstamceller som finnes i SV og Endo bygger flertallet av koronarvaskulaturen, mens proepikardiet bidrar til en relativt liten del av det2. Prosessen der kapillærnettverket av koronarkar vokser i hjertet fra sine eksisterende forløperceller kalles koronar angiogenese. Koronarsykdom er en av de viktigste dødsårsakene over hele verden, og likevel mangler en effektiv behandling for denne sykdommen. Forstå detaljerte cellulære og molekylære mekanismer for koronar angiogenese kan være nyttig i å designe nye og effektive terapier for å reparere og regenerere skadede koronararterier.
Nylig har en økning i vår forståelse av hvordan koronarfartøy utvikler seg, delvis oppnås gjennom utvikling av nye verktøy og teknologier. Spesielt, in vivo avstamning merking og avansert bildeteknologi har vært svært nyttig i å avdekke cellulær opprinnelse og differensiering veier av koronar fartøy9,10,11,12. Til tross for fordelene med disse in vivo-verktøyene, er det begrensninger når det gjelder hastighet, fleksibilitet og tilgjengelighet. Derfor kan robuste in vitro-modellsystemer utfylle in vivo-systemer for å belyse cellulære og molekylære mekanismer for koronar angiogenese på en høy gjennomstrømningsmåte.
Her beskriver vi en in vitro-modell av koronar angiogenese. Vi har utviklet et in vitro explant kultursystem for å dyrke koronarfartøy fra to stamcellevev, SV og Endo. Med denne modellen viser vi at in vitro vev explant kulturer vokse koronar fartøy spirer når stimulert av vekst medium. I tillegg vokser eksplantkulturene raskt sammenlignet med kontroll når de stimuleres av vaskulær endotelvekstfaktor A (VEGF-A), et svært potent angiogent protein. Videre fant vi at de angiogene spirene fra SV-kulturen gjennomgår venøs dedifferensiering (tap av COUP-TFII-uttrykk), en mekanisme som ligner SV angiogenese in vivo1. Disse dataene tyder på at in vitro explant kultursystemet trofast gjeninnfører angigene hendelser som oppstår in vivo. Samlet, in vitro modeller av angiogenese som er beskrevet her er ideelle for sondering cellulær og molekylære mekanismer for koronar angiogenese på en høy gjennomstrømning og tilgjengelig måte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 x 20 MM Tissue Culture Dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>877222</td>
			<td>Referred in the protocol as Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.0 uM PET membrane culture inserts</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MCEP24H48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A31572</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-rat 488</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled Metal Probe</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>10088-15</td>
			<td>Angled 45 degree, used for detecting deep plugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- ERG 1/2/3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab92513</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- VE-Cadherin antibody</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BDB550548</td>
			<td>Primary antibody, manufacturer BD BioSciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 gas tank</td>
			<td>Various suppliers</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13998223</td>
			<td>For 37 &#176;C, 5% CO2 incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereomicrosope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9i</td>
			<td>Leica S9i Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>Endothelial cell growth basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Commercially known as Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 MV Singlequots Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4147</td>
			<td>Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007003IR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FiJi</td>
			<td>NIH</td>
			<td>NA</td>
			<td>Image processing software (<a href="https://imagej.net/Fiji/Downloads" target="_blank">https://imagej.net/Fiji/Downloads</a>)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11412-11</td>
			<td>Used for embryo dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Straight-Blade operating scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-808-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH-302-5601LR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow tissue culture hood</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>various models available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Vectashield with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy/Fisher</td>
			<td>50-980-494</td>
			<td>This is available at 32%; needs to be diluted to 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated spoon</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>10370-18</td>
			<td>Useful in removing embryo/tissues from a solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine VEGF-A 165</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>450-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps, Dumont #5</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sure-Seal Mouse/Rat chamber</td>
			<td>Easysysteminc</td>
			<td>EZ-1785</td>
			<td>Euthanasia chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model of coronary angiogenesis

Her beskriver vi en in vitro kulturanalyse for å studere koronar angiogenese. Koronarfartøyene mater hjertemuskelen og er av klinisk betydning. Defekter i disse fartøyene representerer alvorlige helserisikoer som ved aterosklerose, noe som kan føre til hjerteinfarkt og hjertesvikt hos pasienter. Følgelig er koronarsykdom en av de viktigste dødsårsakene over hele verden. Til tross for sin kliniske betydning, relativt lite fremgang har blitt gjort på hvordan å regenerere skadede koronararterier. Likevel har det nylig gjort fremskritt for å forstå cellulær opprinnelse og differensieringsveier for koronarfartøyutvikling. Bruk av verktøy og teknologier som gjør det mulig for forskere å fluorescerende merke stamceller, følge deres skjebne, og visualisere avkom i vivo har vært medvirkende til å forstå koronar fartøyutvikling. In vivo studier er verdifulle, men har begrensninger i form av hastighet, tilgjengelighet og fleksibilitet i eksperimentell design. Alternativt kan nøyaktige in vitro-modeller av koronarangiogenese omgå disse begrensningene og tillate forskere å avhøre viktige biologiske spørsmål med hastighet og fleksibilitet. Mangelen på passende in vitro modellsystemer kan ha hindret fremdriften i å forstå cellulære og molekylære mekanismer for koronar fartøyvekst. Her beskriver vi et in vitro kultursystem for å dyrke koronarfartøy fra sinus venosus (SV) og endokardiet (Endo), de to stamfarvev ene og opp. Vi bekreftet også at kulturene nøyaktig rekapitulerer noen av de kjente in vivo-mekanismene. For eksempel viser vi at de angiogene spirene i kultur fra SV nedregulerer COUP-TFII-uttrykk som ligner på det som observeres in vivo. I tillegg viser vi at VEGF-A, en velkjent angiogen faktor in vivo, robust stimulerer angiogenese fra både SV- og Endo-kulturene. Samlet sett har vi utviklet en nøyaktig in vitro kulturmodell for å studere koronar angiogenese.

En av de mest slående funksjonene i SV angiogenese in vivo er at den følger en bestemt vei og innebærer cellededifferensiering og redifferensiering hendelser som oppstår på stereotypiske tider og posisjoner1. Som innledende SV-celler vokser på hjertet ventrikkel, de slutter å produsere venøse markører som COUP-TFII (Figur 7). Deretter tar koronarspirer to migrasjonsstier, enten over hjertets overflate eller dypt inne i myokard...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Coronary Angiogenesis at JoVE.com

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

In vitro modeller av koronar angiogenese kan brukes til oppdagelsen av cellulær og molekylære mekanismer for koronar angiogenese. In vitro explant kulturer av sinus venosus og endokardiet vev viser robust vekst som svar på VEGF-A og vise et lignende mønster av COUP-TFII uttrykk som i vivo.

In Vitro Modell av Koronar Angiogenese

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

Vår protokoll er betydelig fordi den gjør det mulig for forskere å undersøke den molekylære mekanismen for koronar angiogenese utenfor en organisme. Den største fordelen med denne teknikken er at den nøyaktig modellerer prosessen med koronar angiogenese inne i en organisme, noe som letter studiet av mekanismene for koronar angiogenese. Begynn med å sprøyte en gravid mus som bærer embryonale dag 11,5 embryoer med 70% etanol.Løfte huden over magen med tang, bruk saks for å lage en bukhud og peritoneal snitt lateralt og fremre opp til membranen for å avsløre livmorhornet. Gripe livmoren, kutt vevet fritt og trekk ut livmorhornet. Plasser strengen av embryoer i iskald steril PBS under et stereomikroskop, og skrelle av livmormuskelen, eggeplommeseken og amniondekselet fra hvert embryo.Etter hvert som hvert embryo er isolert, bruk en perforert skje til å overføre vevet til en ny petriskål som inneholder steril PBS på is. For å høste det embryonale hjertevevet, overfør det første embryoet som skal dissekeres til en ny petriskål under mikroskopet, og plasser embryoet i ventral side opp. Bruk fine tang for å gjøre et lite snitt i brystet, litt over membranen, og sett de lukkede tangene inn i snittet for å forstørre snittet.Bruk tangen til å holde brystveggen åpen for å eksponere hjertet og lungene, bruk et andre par tang for å forsiktig bevege hjertet fremre 90 grader for å avsløre den dorsale aorta og venen. Deretter griper disse karene ved foten av hjertet, trekker forsiktig ut hjertet og lungene fremre og skyll vevet med kald PBS. Når alt hjertevevet er høstet, plasser hjerteprøvene under mikroskopet og fjern lungelappene fra hvert hjerte.Orienter det første hjertet på ryggsiden, og hold hjertet ved basen, bruk fine tang for å skrape venstre og høyre atria i det tilstøtende vevet rundt SV fra hjertet. For å isolere SV, orienter hjertet dorsal side opp. Fjern forsiktig SV fra hjertet og bruk en steril overføringspipette for å plassere det isolerte vevet i en ny seks centimeter petriskål som inneholder iskaldt steril PBS på is.For å isolere hele ventriklene, fjern utstrømningskanalen og bruk en ny steril overføringspipette for å plassere ventriklene i en separat seks centimeter petriskål som inneholder iskald steril PBS på is. For å sette opp SV og hele ventrikkelkulturer, må du først belegge membranene til en åtte mikrometerpor PET-kulturinnsats per brønn av en 24-brønns kulturplate, med 100 mikroliter nyfortynnet ekstracellulær matrise per kultur i minst 30 minutter ved 37 grader Celsius. Når matrisen er størknet, bruker du en overføringspipette til å overføre en skrått til hver innsats, og flytt platen under mikroskopet.Bruk rene tang, plasser explants i midten av hver innsats for å sikre at de ikke er festet til sideveggene, og fjern forsiktig eventuelle ekstra PBS. Deretter overfører du platen med lokket lukket under en laminær strømningsvevskulturhette, og legger til 100 mikroliter forhåndsoppvarmet komplett medium til hver innsats, og 200 mikroliter til brønnen under hver innsats. Tilsett deretter 300 mikroliter PBS til ubrukte brønner, og legg platen i cellekulturinkubatoren i fem dager.For VEGF-A behandling på dag to av kultur, fjerne mediet fra begge kamrene i hver kultur og legge til 100 mikroliter pbs til hver innsats, og 200 mikroliter pbs til hver brønn. Etter å ha virvlet platen noen ganger, erstatt PBS med 300 mikroliter basal medium supplert med 1% fosterbovin serum for å starte kulturer, og returnere platen til inkubatoren. På dag tre etter sult, tilsett 300 mikroliter friskt basal medium pluss serum til kontrollbrønnene og basalmediet pluss 50 nanogram per milliliter VEGF-A til behandlingsbrønnene, og returner platen til cellekulturinkubatoren.På den sjette kulturdagen vasker du kamrene med PBS som demonstrert, og fest kulturene med 200 mikroliter med 4% paraformaldehyd i hver brønn, og 100 mikroliter fikseringsmiddel i hvert innlegg. Etter 20 minutter ved 4 grader Celsius med gynge, vask kulturene med 300 mikroliter PBS i 10 minutter per vask med gynge ved romtemperatur. Etter siste vask legger du til 300 mikroliter primær antistoffløsning til brønnene og setter inn for en overnattingskultur ved fire grader Celsius med gynge.Neste morgen, vask kulturene 10 ganger i ikke-ionisk overflateaktivt middel i PBS med gynge, endre vaskeløsningen hvert 10. Neste dag, vask kulturene 10 ganger i fersk PBS med ikke-ionisk overflateaktivt middel som demonstrert. Etter siste vask, bruk fine tang for å forsiktig skrelle membranen fra hver innsats og plasser membranene på individuelle glassmikroskopsklier, explant side opp.Dekk prøvene med DAPI supplert monteringsmedium i en dekselslipp, og forsegle kantene på dekselet slips med klar neglelakk. Når neglelakken har tørket, bilde lysbildene ved konfokal mikroskopi. Etter hvert som de første SV-cellene vokser på hjerteventrikkelen, slutter de å produsere venøse markører som Coup-TF2.Etter fem dager med kultur spirer SV-endotelceller og migrerer på membranen. Som i det embryonale hjertet reduseres Coup-TF2-uttrykket etter hvert som fartøyene migrerer bort fra SV. Kulturer stimulert med VEGF-A viser en økt vekst av angiogene spirer både i tetthet og lengde. Ytterligere SV-kulturer stimulert av VEGF-A viser en nesten tredobling i spirelengde sammenlignet med kontroller, noe som tyder på at endotelspirer fra SV og endokardi reagerer på VEGF-A.Det er viktig å ikke miste SV-vevet mens du trekker ut hjertet og lungene, fjerner atria, og rengjør det tilstøtende vevet rundt SV. Levende bildeeksperimenter kan utføres for å visualisere koronar angiogenese og for å fange detaljene i cellulær og molekylær dynamikk under prosessen. Denne teknikken er svært nyttig for å vurdere potensielle molekylære mekanismer av koronar angiogenese og som et modellsystem for å studere angiogenese generelt.

Research

JoVE Journal

Medicine

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Multi-modal Imaging av angiogenese i en Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastase Bruke Magnetic Resonance Imaging, Volumetrisk computertomografi og ultralyd

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

Angiogenese i den ischemiske rottelunger

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Netthinneavløsning Model i Gnagere etter subretinal Injeksjon av Natriumhyaluronat

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Ultralyd Basert Vurdering av Coronary Artery Flow og Coronary Flow Reserve Bruke Trykkload Model i Mus

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Surgical Angiogenesis in Porcine Tibial Allotransplantation: A New Large Animal Bone Vascularized Composite Allotransplantation Model

Kirurgisk angiogenese i svin Tibial Allotransplantation: en ny stor dyr bein Stangeriaceae sammensatte Allotransplantation modell

Segmental bone loss resulting from trauma, infection malignancy and congenital anomaly remains a major reconstructive challenge. Current therapeutic ...

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

Intravital mikroskopi Monocyte Homing og svulst-relaterte angiogenese i en Murine modell av perifere Arterial sykdom

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk Contractility måling av musen hvem arterien bruker Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Vurdering av terapeutiske angiogenese i en murine modell av Hindlimb bentap ischemia

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...