Name: in vitro model of coronary angiogenesis
Uploaded: 2020-03-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Coronary Angiogenesis at JoVE.com

Авторы благодарят сотрудников лаборатории Шарма за создание благоприятной исследовательской среды. Мы хотели бы выразить особое спасибо Диане (Ди) Р. Хоффман, который поддерживает и заботится о нашей колонии мыши. Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Филипа Смальдино и Каролин Ванн за тщательное коррективо рукописи и предоставление полезных комментариев. Эта работа была поддержана за счет средств из Балла государственный университет проректор управления и кафедры биологии в B.S., Индиана Академия наук старший научно-исследовательский грант средств B.S, и NIH (RO1-HL128503) и Нью-йоркской стволовой клетки Фонд средств К.Р.

Использование всех животных в этом протоколе следовало руководящим принципам Комитета по институциональному уходу и использованию животных (IACUC).
1. Создание мышь заводчиков и обнаружение вагинальных втыковок для приурочен беременности
<ol><li>Настроили клетку для разве?...

<ol>
	<li>Red-Horse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells.">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sinus+venosus+contributes+to+coronary+vasculature+through+VEGFC-stimulated+angiogenesis.">The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis.</a> Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).</li><li>Volz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+are+progenitors+for+coronary+artery+smooth+muscle.">Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-C+and+aortic+cardiomyocytes+guide+coronary+artery+stem+development.">VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4899-4914 (2014).</li><li>Chang, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DACH1+stimulates+shear+stress-guided+endothelial+cell+migration+and+coronary+artery+growth+through+the+CXCL12-CXCR4+signaling+axis.">DACH1 stimulates shear stress-guided endothelial cell migration and coronary artery growth through the CXCL12-CXCR4 signaling axis.</a> Genes and Development. , (2017).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepicardial+endothelial+cells+invade+the+embryonic+ventricle+wall+to+form+coronary+arteries.">Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries.</a> Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+Cells+Form+the+Coronary+Arteries+by+Angiogenesis+through+Myocardial-Endocardial+VEGF+Signaling.">Endocardial Cells Form the Coronary Arteries by Angiogenesis through Myocardial-Endocardial VEGF Signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Katz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+compartments+of+the+proepicardial+organ+give+rise+to+coronary+vascular+endothelial+cells.">Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells.</a> Developmental Cell. 22 (3), 639-650 (2012).</li><li>Das, S., Red-Horse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+plasticity+in+cardiovascular+development+and+disease.">Cellular plasticity in cardiovascular development and disease.</a> Developmental Dynamics. 246 (4), 328-335 (2017).</li><li>Sharma, B., Chang, A., Red-Horse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+Artery+Development:+Progenitor+Cells+and+Differentiation+Pathways.">Coronary Artery Development: Progenitor Cells and Differentiation Pathways.</a> Annual Review of Physiology. 79, 1-19 (2017).</li><li>Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+origin+and+developmental+program+of+coronary+angiogenesis.">Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis.</a> Circulation Research. 116 (3), 515-530 (2015).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling.">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Gerhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+guides+angiogenic+sprouting+utilizing+endothelial+tip+cell+filopodia.">VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia.</a> Journal of Cell Biology. 161 (6), 1163-1177 (2003).</li><li>Ruhrberg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+restricted+patterning+cues+provided+by+heparin-binding+VEGF-A+control+blood+vessel+branching+morphogenesis.">Spatially restricted patterning cues provided by heparin-binding VEGF-A control blood vessel branching morphogenesis.</a> Genes and Development. 16 (20), 2684-2698 (2002).</li><li>Kikuchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antiangiogenic+isoform+of+VEGF-A+contributes+to+impaired+vascularization+in+peripheral+artery+disease.">An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease.</a> Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2002).</li><li>Folkman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+tumor+factor+responsible+for+angiogenesis.">Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 133 (2), 275-288 (1971).</li><li>Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+VEGF+in+the+regulation+of+physiological+and+pathological+angiogenesis.">The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis.</a> Experientia Supplementum. (94), 209-231 (2005).</li><li>Ferrara, N., Bunting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor,+a+specific+regulator+of+angiogenesis.">Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 5 (1), 35-44 (1996).</li><li>Sharma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Progenitor+Cells+Compensate+to+Rebuild+the+Coronary+Vasculature+in+Elabela-+and+Apj-Deficient+Hearts.">Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts.</a> Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).</li><li>Rhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+deletion+of+Ino80+disrupts+coronary+angiogenesis+and+causes+congenital+heart+disease.">Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease.</a> Nature Communications. 9 (1), 368 (2018).</li></ol>

Некоторые из наиболее важных шагов для успешного выращивания коронарных сосудов из тканей SV и Endo-прародителя: 1) Правильное выявление и изоляция ткани СВ для культуры СВ; 2) использование желудочков эмбрионов в возрасте от e11-11.5 для точной культуры эндо; 3) поддержание стерильных состояни...

Кровеносные сосуды сердца обычно называют коронарных сосудов. Эти сосуды состоят из артерий, вен и капилляров. Во время разработки сначала устанавливаются высокоразветвленные капилляры, которые затем переделываютв коронарные артерии и вены1,2,3,4. Эти первоначальные капилляры построены из эндотелиальных клеток-прародителей, найденных в проэпикардии, синусвенных веносах (SV) и эндокардии (Эндо)тканей 1,6,7,8. SV является органом притока эмбрионального сердца и Эндо является внутренней подкладкой просвет сердца. Эндотелиальные клетки-прародители, найденные в SV и Endo, создают большинство коронарных сосуд, в то время как проэпикардий способствует относительно небольшой его части2. Процесс, при котором капиллярная сеть коронарных сосудов растет в сердце из уже существующих клеток-предшественников, называется коронарным ангиогенезом. Ишемическая болезнь сердца является одной из ведущих причин смерти во всем мире, и все же эффективного лечения этого заболевания не хватает. Понимание подробных клеточных и молекулярных механизмов коронарного ангиогенеза может быть полезно при разработке новых и эффективных методов лечения для ремонта и регенерации поврежденных коронарных артерий.
В последнее время резкое понимание того, как развиваются коронарные сосуды, частично было достигнуто за счет разработки новых инструментов и технологий. В частности, маркировка линии in vivo и передовые технологии визуализации были очень полезны при раскрытии клеточного происхождения и путей дифференциации коронарных сосудов9,10,11,12. Несмотря на преимущества этих инструментов in vivo, существуют ограничения с точки зрения скорости, гибкости и доступности. Таким образом, надежные системы моделей in vitro могут дополнять системы in vivo для выяснения клеточных и молекулярных механизмов коронарного ангиогенеза высокой пропускной способностью.
Здесь мы описываем в пробирке модель коронарного ангиогенеза. Мы разработали систему культуры эксплантирования в пробирке для выращивания коронарных сосудов из двух тканей-прародителей, SV и Endo. С помощью этой модели мы показываем, что в экстракорпоральной ткани explant культур расти коронарных ростков сосудов, когда стимулируется средой роста. Кроме того, культуры эксплантов быстро растут по сравнению с контролем, когда стимулируется сосудистым эндотелиальным фактором роста A (VEGF-A), очень мощным ангиогенным белком. Кроме того, мы обнаружили, что ангиогенные ростки из культуры SV проходят венозную дедифференицицию (потеря экспрессии COUP-TFII), механизм, похожий на SV ангиогенез in vivo1. Эти данные свидетельствуют о том, что система культуры экстракорпорального экспланта точно восстанавливает ангиогенные события, происходящие в vivo. В совокупности, в пробирке модели ангиогенеза, которые описаны здесь идеально подходят для зондирования клеточных и молекулярных механизмов коронарного ангиогенеза в высокой пропускной способностью и доступным способом.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 x 20 MM Tissue Culture Dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>877222</td>
			<td>Referred in the protocol as Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.0 uM PET membrane culture inserts</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MCEP24H48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A31572</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-rat 488</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled Metal Probe</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>10088-15</td>
			<td>Angled 45 degree, used for detecting deep plugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- ERG 1/2/3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab92513</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- VE-Cadherin antibody</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BDB550548</td>
			<td>Primary antibody, manufacturer BD BioSciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 gas tank</td>
			<td>Various suppliers</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13998223</td>
			<td>For 37 &#176;C, 5% CO2 incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereomicrosope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9i</td>
			<td>Leica S9i Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>Endothelial cell growth basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Commercially known as Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 MV Singlequots Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4147</td>
			<td>Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007003IR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FiJi</td>
			<td>NIH</td>
			<td>NA</td>
			<td>Image processing software (<a href="https://imagej.net/Fiji/Downloads" target="_blank">https://imagej.net/Fiji/Downloads</a>)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11412-11</td>
			<td>Used for embryo dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Straight-Blade operating scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-808-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH-302-5601LR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow tissue culture hood</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>various models available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Vectashield with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy/Fisher</td>
			<td>50-980-494</td>
			<td>This is available at 32%; needs to be diluted to 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated spoon</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>10370-18</td>
			<td>Useful in removing embryo/tissues from a solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine VEGF-A 165</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>450-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps, Dumont #5</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sure-Seal Mouse/Rat chamber</td>
			<td>Easysysteminc</td>
			<td>EZ-1785</td>
			<td>Euthanasia chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model of coronary angiogenesis

Здесь мы описываем анализ культуры in vitro для изучения коронарного ангиогенеза. Коронарные сосуды питают сердечную мышцу и имеют клиническое значение. Дефекты в этих сосудах представляют серьезную опасность для здоровья, например, при атеросклерозе, что может привести к инфарктам миокарда и сердечной недостаточности у пациентов. Следовательно, ишемическая болезнь сердца является одной из ведущих причин смерти во всем мире. Несмотря на его клиническую важность, относительно незначительный прогресс был достигнут в том, как регенерировать поврежденные коронарные артерии. Тем не менее, в последнее время был достигнут прогресс в понимании клеточного происхождения и путей дифференциации развития коронарных судов. Появление инструментов и технологий, которые позволяют исследователям флуоресцентно маркировать клетки-прародителя, следить за их судьбой и визуализировать потомство in vivo сыграли важную роль в понимании развития коронарных сосудов. Исследования In vivo являются ценными, но имеют ограничения с точки зрения скорости, доступности и гибкости в экспериментальном дизайне. Кроме того, точные модели в пробирке коронарного ангиогенеза могут обойти эти ограничения и позволить исследователям быстро и гибко изопрашивать важные биологические вопросы. Отсутствие соответствующих систем моделей in vitro, возможно, препятствовало прогрессу в понимании клеточных и молекулярных механизмов роста коронарных сосудов. Здесь мы описываем систему культуры in vitro для выращивания коронарных сосудов из синусового веноза (SV) и эндокардия (Endo), двух тканей-прародителей, из которых возникают многие коронарные сосуды. Мы также подтвердили, что культуры точно резюмируют некоторые из известных механизмов in vivo. Например, мы показываем, что ангиогенные ростки в культуре от SV downregulate COUP-TFII выражение аналогично тому, что наблюдается in vivo. Кроме того, мы показываем, что VEGF-A, известный ангиогенный фактор in vivo, активно стимулирует ангиогенез как из Культуры СВ, так и из эндо. В совокупности мы разработали точную модель культуры in vitro для изучения коронарного ангиогенеза.

Одна из самых ярких особенностей SV ангиогенез in vivo является то, что она следует определенным образом и включает в себя ячейки обезличения и реразличения событий, которые происходят в стереотипные времена и позиции1. По мере того как начальные клетки SV раст...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Coronary Angiogenesis at JoVE.com

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

В пробирке модели коронарного ангиогенеза могут быть использованы для открытия клеточных и молекулярных механизмов коронарного ангиогенеза. В пробирке эксплантные культуры синусовых веносов и эндокардийных тканей демонстрируют устойчивый рост в ответ на VEGF-A и демонстрируют аналогичную схему выражения COUP-TFII, как in vivo.

В vitro Модель коронарного ангиогенеза

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

Наш протокол имеет важное значение, поскольку позволяет исследователям исследовать молекулярный механизм коронарного ангиогенеза вне организма. Основным преимуществом этой методики является то, что она точно моделирует процесс коронарного ангиогенеза внутри организма, облегчая изучение механизмов коронарного ангиогенеза. Начните с распыления беременной мыши проведения эмбрионального дня 11,5 эмбрионов с 70%этанола.Подъем кожи над животом с типами, использовать ножницы, чтобы сделать брюшную кожу и брюшной разрез боковой и передней до диафрагмы подвергать рога матки. Хватая матку, вырезать ткани бесплатно и вытащить матки рога. Поместите строку эмбрионов в ледяной стерильный PBS под стерео микроскопом, и снять мышцы матки, желточный мешок, и амнион покрытия от каждого эмбриона.Поскольку каждый эмбрион изолирован, используйте перфорированную ложку для переноса тканей в новую чашку Петри, содержащую стерильные PBS на льду. Чтобы собрать эмбрионационную сердечную ткань, перенесите первый эмбрион, который будет расчленен в новую чашку Петри под микроскопом, и поместите эмбрион в брюшной стороне вверх. Используйте тонкие типсы, чтобы сделать небольшой разрез в груди, немного выше диафрагмы, и вставьте закрытые типсы в разрез, чтобы увеличить разрез.Используя типсы, чтобы держать грудную стенку открытой, чтобы разоблачить сердце и легкие, используйте вторую пару типсов, чтобы мягко переместить сердце передне на 90 градусов, чтобы разоблачить спинную аорту и вену. Затем, хватая эти сосуды у основания сердца, осторожно вытяните сердце и легкие передней и промойте ткани холодным PBS. Когда все сердечные ткани были собраны, поместите образцы сердца под микроскопом и удалить легочные доли из каждого сердца.Ориентируя первое сердце на спинную сторону и удерживая сердце у его основания, используйте тонкие типсы, чтобы соскребать левую и правую атрию в соседних тканях, окружающих СВ от сердца. Чтобы изолировать SV, сориентировать сердце спинной стороны вверх. Тщательно удалите SV из сердца и используйте стерильный пипетки передачи разместить изолированную ткань в новую шестиметровую чашку Петри, содержащую ледяной стерильный PBS на льду.Чтобы изолировать все желудочков, удалить отток тракта и использовать новые стерильные передачи пипетки для места желудочков в отдельные шесть сантиметров Петри блюдо, содержащее ледяной стерильной PBS на льду. Чтобы создать SV и целые желудочковые культуры, сначала покрыть мембраны одного восьмимиметрового поры ПЭТ культуры вставить на колодец 24 хорошо культуры пластины, с 100 микролитров свежеотбавленных внеклеточной матрицы на культуру, по крайней мере 30 минут при 37 градусов по Цельсию. Когда матрица затвердеет, используйте передачу пипетки для передачи одного explant на каждую вставку, и переместить пластину под микроскопом.Используя чистые типсы, распоите explants в центре каждой вставки, чтобы убедиться, что они не прикреплены к боковым стенкам, и тщательно удалить любые дополнительные PBS. Затем перенесите пластину с закрытой крышкой под капотом культуры ламинарного потока и добавьте 100 микролитров предварительно разогретой полной среды к каждой вставке и 200 микролитров к значительно ниже каждой вставки. Затем добавьте 300 микролитров PBS в любые неиспользованные скважины и поместите пластину в инкубатор клеточной культуры в течение пяти дней.Для лечения VEGF-A на второй день культуры, удалить среду из обеих камер каждой культуры и добавить 100 микролитров PBS для каждой вставки, и 200 микролитров PBS к каждой хорошо. После закрученного пластины несколько раз, заменить PBS с 300 микролитров базальной среды дополняется 1%фетальной сыворотки крупного рогатого скота, чтобы начать культур, и вернуть пластину в инкубатор. На третий день после голодания добавьте 300 микролитров свежей базальной среды плюс сыворотку в контрольные скважины и базальную среду плюс 50 нанограмм на миллилитр VEGF-A в лечебные скважины и верните пластину в инкубатор клеточной культуры.На шестой день культуры, мыть камеры с PBS, как попродемонстрировано, и исправить культур с 200 микролитров 4%paraformaldehyde в каждой хорошо, и 100 микролитров фиксатора в каждой вставке. После 20 минут при температуре 4 градуса По Цельсию с качания, мыть культур с 300 микролитров PBS в течение 10 минут за стирку с качания при комнатной температуре. После последней стирки добавьте 300 микролитров первичного раствора антител в колодцы и вставьте для ночной культуры при четырех градусах Цельсия с раскачиванием.На следующее утро, мыть культур 10 раз в неионных сурфактант в PBS с качания, изменение мытья раствор каждые 10 минут, прежде чем маркировки культур с 300 микролитров соответствующих фторфора конъюгированных вторичных антител на четыре градуса Цельсия ночь с качания. На следующий день, мыть культуры 10 раз в свежем PBS с неионной сурфактант, как попродемонстрировано. После последней стирки используйте тонкие типсы, чтобы тщательно очистить мембрану от каждой вставки и поместить мембраны на отдельные стеклянные микроскоп слайды, explant вверх.Обложка образцов с DAPI дополнены монтажной среды в крышку скольжения, и печать края крышки скользит с четким лаком для ногтей. Когда лак для ногтей высохнет, изображение слайдов конфокальные микроскопии. По мере того как начальные клетки SV растут на желудочек сердца, они останавливают производить венозные маркеры such as Coup-TF2.После пяти дней культуры, SV эндотелиальных клеток прорастают и мигрируют на мембрану. Как и в эмбриональном сердце, экспрессия Coup-TF2 уменьшается по мере того, как сосуды мигрируют от СВ. Культуры, стимулируемые VEGF-A, демонстрируют повышенный рост ангиогенных ростков как по плотности, так и по длине. Дальнейшие культуры СВ, стимулируемые VEGF-A, демонстрируют почти трехкратное увеличение длины ростков по сравнению с контрольами, что свидетельствует о том, что эндотелиальные ростки из СВ и эндокарда реагируют на VEGF-A.Важно не потерять ткани SV, вытаскивая сердце и легкие, удаляя атрию, и очистки прилегающих тканей, окружающих СВ. Эксперименты с живой визуализацией могут быть проведены для визуализации коронарного ангиогенеза и для захвата деталей клеточной и молекулярной динамики во время процесса. Этот метод чрезвычайно полезен для оценки потенциальных молекулярных механизмов коронарного ангиогенеза и в качестве образцовой системы для изучения ангиогенеза в целом.

Research

JoVE Journal

Medicine

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Коронарных артерий и Лигирование Intramyocardial инъекций в мышиной модели миокарда

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

Мышь Модель Пробирной Роговица Карман для ангиогенеза исследование

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Мульти-модальных изображений ангиогенеза в обнаженной модели крысы из груди метастазы рака костей с помощью магнитного резонанса, компьютерной томографии Объемные и ультразвуковые

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

Ангиогенеза в ишемизированных легких крысы

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Отслойки Модель в Грызуны по субретинальной инжекции гиалуронат натрия

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Ультразвук оценки на основе коронарной артерии потока и коронарного кровотока заповедника Использование перегрузки Модель давления у мышей

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Surgical Angiogenesis in Porcine Tibial Allotransplantation: A New Large Animal Bone Vascularized Composite Allotransplantation Model

Хирургическое ангиогенеза в свинину большеберцовых аллотрансплантация: новые большие кости животных васкуляризированной композитных аллотрансплантация модель

Segmental bone loss resulting from trauma, infection malignancy and congenital anomaly remains a major reconstructive challenge. Current therapeutic ...

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

Прижизненной микроскопии Моноцит самонаведения и связанных с опухоли ангиогенеза в мышиных модели болезнь периферических артерий

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Изометрические сократимости измерение верхней брыжеечной артерии мыши, с помощью проволоки миография

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Оценка терапевтического ангиогенеза в модели Murine Hindlimb Ischemia

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...